Usando Baseplating e um Miniscópio Pré-ancorado com uma Lente Objetiva para Pesquisa Transiente de Cálcio em Camundongos

Resumo

O encolhimento do cimento dentário durante a cura desloca a placa de base. Este protocolo minimiza o problema, criando uma base inicial do cimento dentário que deixa espaço para cimentar a placa de base. Semanas depois, a placa de base pode ser cimentada em posição neste andaime usando pouco cimento novo, reduzindo assim o encolhimento.

Resumo

Os neurocientistas usam microscópios em miniatura (miniscópios) para observar a atividade neuronal em animais que se comportam livremente. A equipe do Miniscope da Universidade da Califórnia, Los Angeles (UCLA) fornece recursos abertos para que os pesquisadores construam miniscópios eles mesmos. O V3 UCLA Miniscope é um dos miniscópios de código aberto mais populares atualmente em uso. Ele permite a imagem dos transientes de fluorescência emitidos por neurônios geneticamente modificados através de uma lente objetiva implantada no córtex superficial (um sistema de uma lente), ou em áreas cerebrais profundas através de uma combinação de uma lente de relé implantada no cérebro profundo e uma lente objetiva que é pré-ancorada no miniscópio para observar a imagem retransmitida (um sistema de duas lentes). Mesmo em condições ideais (quando os neurônios expressam indicadores de fluorescência e a lente de relé foi implantada adequadamente), uma mudança de volume do cimento dentário entre a placa de base e sua fixação ao crânio após a cura do cimento pode causar desalinhamento com uma distância alterada entre as lentes objetiva e de relé, resultando na má qualidade da imagem. Uma placa de base é uma placa que ajuda a montar o miniscópio no crânio e fixa a distância de trabalho entre as lentes objetiva e de relé. Assim, mudanças no volume do cimento dentário ao redor da placa de base alteram a distância entre as lentes. O presente protocolo tem como objetivo minimizar o problema de desalinhamento causado por alterações de volume no cimento dental. O protocolo reduz o desalinhamento construindo uma base inicial de cimento dentário durante o implante da lente de relé. O tempo de convalescença após a implantação é suficiente para a fundação do cimento dentário curar completamente a placa de base, de modo que a placa de base possa ser cimentada neste andaime usando o mínimo de cimento novo possível. No presente artigo, descrevemos estratégias de baseplating em camundongos para permitir a imagem da atividade neuronal com uma lente objetiva ancorada no miniscópio.

Introdução

Os repórteres de atividade fluorescente são ideais para a imagem da atividade neuronal, pois são sensíveis e apresentam grandes amplitudes dinâmicas ^1,2,3. Portanto, um número crescente de experimentos está utilizando microscopia de fluorescência para observar diretamente a atividade neuronal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ^,16. O primeiro microscópio miniaturizado de fluorescência de um fóton (miniscópio) foi projetado em 2011 por Mark Schnitzer et ^al.5. Esse miniscópio permite que os pesquisadores monitorem a dinâmica de fluorescência das células cerebelares em animais de comportamento livre⁵ (ou seja, sem qualquer restrição física, apoio de cabeça, sedação ou anestesia para os animais). Atualmente, a técnica pode ser aplicada para monitorar áreas cerebrais superficiais, como o córtex 6,8,15,16; áreas subcorticais como o hipocampo dorsal 8,11,13,14 e o ^{estriado 6,17}; e áreas cerebrais profundas, como o hipocampo ventral¹⁴, a amígdala 10,18 e o hipotálamo ^8,12.

Nos últimos anos, vários miniscópios de código aberto foram desenvolvidos^{4,5,6,7,11,13,17,19}. O miniscópio pode ser montado economicamente por pesquisadores se eles seguirem as diretrizes passo a passo fornecidas pela equipe de miniscópio da Universidade da Califórnia, Los Angeles (UCLA)^4,7,11,13. Porque o monitoramento óptico da atividade neural é restrito pelas limitações da transmissão de luz⁷ de e para a população neuronal de interesse, um miniscópio foi projetado que requer que uma lente de índice de refração de gradiente objetivo (GRIN) objetiva (ou lente objetiva) seja pré-ancorada na parte inferior do miniscópio para ampliar o campo de visão que é retransmitido de uma lente GRIN de relé (ou lente de relé)^{6,7,8,10,16,17}. Esta lente de relé é implantada na região do cérebro alvo de tal forma que a atividade de fluorescência da região do cérebro alvo é retransmitida para a superfície da lente de relé^{6,7,8,10,16,17}. Aproximadamente 1/4 de um período sinusoidal completo de luz viaja através da lente GRIN objetiva (~ 0,25 pitch) (Figura 1A1), resultando em uma imagem de fluorescência ampliada^6,7. A lente objetiva nem sempre é fixada na parte inferior do miniscópio nem é necessária a implantação da lente de relé^6,7,11,13,15. Especificamente, existem duas configurações: uma com uma lente objetiva fixa no miniscópio e uma lente de relé implantada no cérebro.^{8,10,12,14,16} (Figura 1B1) e outro com apenas uma lente objetiva removível^6,7,11,13,15 (Figura 1B2). No projeto baseado na combinação de objetiva fixa e lente de relé implantada, os sinais de fluorescência do cérebro são trazidos para a superfície superior da lente de relé (Figura 1A1)^{7,8,10,12,14,16}. Posteriormente, a lente objetiva pode ampliar e transmitir o campo visual a partir da superfície superior da lente relé (Figura 1A2). Por outro lado, o design da lente GRIN objetiva removível é mais flexível, o que significa que a pré-implantação de uma lente de relé no cérebro não é obrigatória (Figura 1B2)^6,7,11,13,15. Ao usar um miniscópio baseado em um design de lente objetiva removível, os pesquisadores ainda precisam implantar uma lente na região do cérebro alvo, mas podem implantar uma lente objetiva.^6,7,11,13,15 ou uma lente de relé no cérebro^6,7. A escolha de uma objetiva ou de uma lente de relé para implantação determina a configuração do miniscópio que o pesquisador deve utilizar. Por exemplo, o V3 UCLA Miniscope é baseado em um design de lente GRIN de objetiva removível. Os pesquisadores podem optar por implantar diretamente uma lente objetiva na região do cérebro de interesse e montar o miniscópio "vazio" na lente objetiva.^6,7,11,13,15 (um sistema de uma lente; Figura 1B2) ou para implantar uma lente de relé no cérebro e montar um miniscópio pré-ancorado com uma lente objetiva^6,7 (um sistema de duas lentes; Figura 1B1). O miniscópio funciona então como uma câmera de fluorescência para capturar imagens de transmissão ao vivo de fluorescência neuronal produzidas por um indicador de cálcio geneticamente codificado.^1,2,3. Depois que o miniscópio é conectado a um computador, essas imagens de fluorescência podem ser transferidas para o computador e salvas como clipes de vídeo. Os pesquisadores podem estudar a atividade neuronal analisando as mudanças relativas na fluorescência com alguns pacotes de análise^20,21 ou escrever seus códigos para análise futura.

O V3 UCLA Miniscope oferece flexibilidade para os usuários determinarem se devem visualizar a atividade neuronal com um sistema de uma ou duas lentes⁷. A escolha do sistema de gravação é baseada na profundidade e no tamanho da área do cérebro alvo. Em resumo, um sistema de uma lente só pode obter imagens de uma área superficial (menos de aproximadamente 2,5 mm de profundidade) e relativamente grande (maior que aproximadamente 1,8 x 1,8 mm²) porque os fabricantes produzem apenas um certo tamanho de lente objetiva. Em contraste, um sistema de duas lentes pode ser aplicado a qualquer área do cérebro alvo. No entanto, o cimento dentário para colar a placa de base tende a causar desalinhamento com uma distância alterada entre as lentes objetiva e de relé, resultando em uma má qualidade de imagem. Se o sistema de duas lentes estiver sendo usado, duas distâncias de trabalho precisam ser direcionadas com precisão para alcançar a qualidade de imagem ideal (Figura 1A). Essas duas distâncias críticas de trabalho estão entre os neurônios e a superfície inferior da lente de relé e entre a superfície superior da lente de relé e a superfície inferior da lente objetiva (Figura 1A1). Qualquer desalinhamento ou mau posicionamento da lente fora da distância de trabalho resulta em falha de imagem (Figura 1C2). Em contraste, o sistema de uma lente requer apenas uma distância de trabalho precisa. No entanto, o tamanho da lente objetiva limita sua aplicação para o monitoramento de regiões cerebrais profundas (a lente objetiva que se encaixa no miniscópio é de aproximadamente 1,8 ~ 2,0 mm ^6,11,13,15). Portanto, o implante de uma lente objetiva é limitado para a observação da superfície e de regiões cerebrais relativamente grandes, como o córtex^6,15 e o cornu ammonis dorsal 1 (CA1) em camundongos^11,13 . Além disso, uma grande área do córtex deve ser aspirada para atingir o CA1 dorsal^11,13. Devido à limitação da configuração de uma lente que impede a imagem de regiões profundas do cérebro, os sistemas de miniscópio comerciais oferecem apenas um design combinado de lente objetiva / lente de relé (duas lentes). Por outro lado, o miniscópio V3 UCLA pode ser modificado em um sistema de uma lente ou duas lentes, porque sua lente objetiva é removível 6,11,13,15. Em outras palavras, os usuários do miniscópio V3 UCLA podem tirar proveito da lente removível implantando-a no cérebro (criando um sistema de uma lente), ao realizar experimentos envolvendo observações cerebrais superficiais (menos de 2,5 mm de profundidade) ou pré-ancorando-a no miniscópio e implantando uma lente de relé no cérebro (criando um sistema de duas lentes), ao realizar experimentos envolvendo observações cerebrais profundas. O sistema de duas lentes também pode ser aplicado para observar superficialmente o cérebro, mas o pesquisador deve conhecer as distâncias de trabalho precisas entre a lente objetiva e a lente de retransmissão. A principal vantagem do sistema de uma lente é que há uma chance menor de perder as distâncias de trabalho do que com um sistema de duas lentes, uma vez que existem duas distâncias de trabalho que precisam ser direcionadas com precisão para alcançar a qualidade de imagem ideal no sistema de duas lentes (Figura 1A). Portanto, recomendamos o uso de um sistema de uma lente para observações cerebrais superficiais. No entanto, se o experimento exigir imagens na área profunda do cérebro, o pesquisador deve aprender a evitar o desalinhamento das duas lentes.

O protocolo básico para configuração de miniscópios de duas lentes para experimentos inclui o implante de lentes e o baseplating 8,10,16,17. Baseplating é a colagem de uma placa de base na cabeça de um animal para que o miniscópio possa ser eventualmente montado em cima do animal e filmar os sinais de fluorescência dos neurônios (Figura 1B). Esse procedimento envolve o uso de cimento dentário para colar a placa de base no crânio (Figura 1C), mas o encolhimento do cimento dentário pode causar alterações inaceitáveis na distância entre a lente relé implantada e a lente objetiva ^8,17. Se a distância deslocada entre as duas lentes for muito grande, as células não podem ser colocadas em foco.

Protocolos detalhados para experimentos de imagem de cálcio cerebral profundo usando miniscópios já foram publicados^8,10,16,17. Os autores desses protocolos utilizaram o sistema Inscopix^8,10,16 ou outros projetos personalizados¹⁷ e descreveram os procedimentos experimentais para seleção viral, cirurgia e fixação da placa de base. No entanto, seus protocolos não podem ser aplicados com precisão a outros sistemas de código aberto, como o sistema V3 UCLA Miniscope, NINscope⁶e Finchscope¹⁹. O desalinhamento das duas lentes pode ocorrer durante a gravação em uma configuração de duas lentes com um Miniscópio UCLA devido ao tipo de cimento dentário que é usado para cimentar a placa de base ao crânio^8,17 (Figura 1C). O presente protocolo é necessário porque a distância entre a lente de relé implantada e a lente objetiva é propensa a mudar devido ao encolhimento indesejável do cimento dentário durante o procedimento de baseplating. Durante o baseplating, a distância de trabalho ideal entre a lente de relé implantada e a lente objetiva deve ser encontrada ajustando a distância entre o miniscópio e a parte superior da lente de relé, e a placa de base deve então ser colada neste local ideal. Após o ajuste da distância correta entre a lente objetiva e a lente relé implantada, medidas longitudinais podem ser obtidas na resolução celular (Figura 1B; in vivo gravação). Uma vez que a faixa ideal de distâncias de trabalho de uma lente de relé é pequena (50 - 350 μm)^4,8, o encolhimento excessivo do cimento durante a cura pode dificultar a manutenção da lente objetiva e da lente de relé implantada dentro da faixa apropriada. O objetivo geral deste relatório é fornecer um protocolo para reduzir os problemas de encolhimento.^8,17 que ocorrem durante o procedimento de baseplating e para aumentar a taxa de sucesso das gravações de miniscópio de sinais de fluorescência em uma configuração de duas lentes. A gravação bem-sucedida do miniscópio é definida como a gravação de uma transmissão ao vivo de mudanças relativas perceptíveis na fluorescência de neurônios individuais em um animal que se comporta livremente. Embora diferentes marcas de cimento dental tenham diferentes taxas de encolhimento, os pesquisadores podem selecionar uma marca que tenha sido testada anteriormente^{6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22}. No entanto, nem todas as marcas são fáceis de obter em alguns países / regiões devido aos regulamentos de importação de materiais médicos. Portanto, desenvolvemos métodos para testar as taxas de encolhimento dos cimentos dentários disponíveis e, o que é mais importante, fornecer um protocolo alternativo que minimize o problema de encolhimento. A vantagem sobre o atual protocolo de baseplating é um aumento na taxa de sucesso da imagem de cálcio com ferramentas e cimento que podem ser facilmente obtidos em laboratórios. O miniscópio da UCLA é usado como exemplo, mas o protocolo também é aplicável a outros miniscópios. Neste relato, descrevemos um procedimento de baseplating otimizado e também recomendamos algumas estratégias para o ajuste do sistema de duas lentes do miniscópio UCLA (Figura 2A). Ambos os exemplos de implantação bem-sucedida (n = 3 camundongos) e exemplos de implantação fracassada (n = 2 camundongos) para a configuração de duas lentes com o miniscópio UCLA são apresentados juntamente com as discussões pelas razões dos sucessos e fracassos.

Protocolo

Todos os procedimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Nacional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Nacional de Taiwan (Nº de Aprovação: NTU-109-EL-00029 e NTU-108-EL-00158).

1. Avaliação da alteração volêmica do cimento dentário

NOTA: Alterações no volume de cimento dental ocorrem durante o processo de cura. Testar as alterações de volume do cimento dentário antes da implantação e baseplating. Os pesquisadores podem testar qualquer marca de cimento dental e usar a marca com a menor mudança de volume para cimentar a placa de base. Um exemplo é mostrado na Figura 3.

1. Pesar 0,5 g de cada pó de cimento dentário e misturá-lo com a sua solução adequada (1 ml).
   NOTA: A relação pó/líquido recomendada nas instruções de cimento dentário é de 0,5 g de pó para 0,25 mL da solução para obter uma forma sólida. Este protocolo de ensaio dilui a relação para 0,5 g/ml para que a mistura possa ser aspirada sob a forma líquida, a fim de medir a mudança de volume nas pontas da pipeta.
2. Use as pontas da pipeta de 0,1-10 μL para remover 2,5 μL da mistura de cimento dentário e, em seguida, sele a ponta da pipeta com uma cola de cura leve.
3. Coloque as pontas em uma prateleira, marque os níveis mais altos da mistura de cimento dental e meça o nível da mistura de cimento dental após 40 minutos (vídeo suplementar S1).
4. Além de monitorar as mudanças de nível durante a cura do cimento dentário nas pontas, meça a densidade de cimento dental seco restante. Para calcular a densidade, meça o peso do cimento dentário e meça o volume com o princípio de Arquimedes.
   1. Em resumo, coloque o restante cimento dental seco em um copo cheio de água e pese a água que transborda.
5. Use o cimento dentário com o menor encolhimento para todos os protocolos detalhados abaixo.

2. Anestesia, implante cirúrgico, injeção viral e baseplating fictício

1. Anestesia
   NOTA: O presente relatório visa otimizar o procedimento cirúrgico e de baseplating para o miniscópio da UCLA; portanto, assumiu-se que o título viral ideal para infectar as regiões-alvo do cérebro era conhecido. Os métodos para encontrar o título viral ideal podem ser encontrados nas etapas 1 a 5 de Resendez et al.⁸. Uma vez que a diluição viral tenha sido otimizada, o implante cirúrgico pode ser iniciado.
   1. Coloque o rato num recipiente de indução e forneça oxigénio (100% a um caudal de ar de 0,2 L/min). Pré-oxigenar o rato durante 5 a 10 min.
   2. Administrar isoflurano a 5% misturado com 100% de oxigénio (taxa de fluxo de ar: 0,2 L/min) até que o rato comece a perder o equilíbrio e seja eventualmente anestesiado.
   3. Remova o rato da câmara de indução e injete atropina (0,04 mg/kg; injeção subcutânea), para evitar a acumulação de saliva e buprenorfina (0,03 mg/kg; injeção subcutânea) como analgésico.
   4. Raspe a cabeça do mouse.
   5. Use máscara, avental estéril e luvas. Prepare um espaço estéril e instrumentos cirúrgicos estéreis para a cirurgia. Estabilize a cabeça do rato (mantenha a anestesia com 3 a 2,5% de isoflurano durante esta etapa) no aparelho estereotáxico. Após os procedimentos analgésicos e anestésicos, certifique-se de que as barras auriculares estabilizem firmemente a cabeça. Fornecer suporte térmico.
   6. Certifique-se de que a cabeça está ajustada em uma posição reta, esterilize a cabeça raspada com betadine e, em seguida, pulverize a cabeça com xilocaína (10%), um analgésico local.
   7. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar a secura.
      NOTA: Use pomada oftálmica para proteção ocular durante todos os eventos anestésicos para prevenir lesões oculares.
   8. Teste o reflexo de dor profunda do animal apertando sua pata traseira. Uma vez que o animal não apresente reflexo de retirada da pata, prossiga com procedimentos cirúrgicos.
   9. Faça uma pequena incisão ao longo do plano sagital médio do crânio (começando de aproximadamente 2 mm anterior ao bregma e terminando aproximadamente 6 mm posterior ao bregma). Em seguida, limpe o tecido conjuntivo no crânio e ancore três parafusos de aço inoxidável nos ossos frontais e interparietais esquerdos.
      1. Neste ponto, reduza o isoflurano para 1-2%. Monitore a taxa de respiração durante todo o procedimento cirúrgico. Se a taxa de respiração for muito lenta (aproximadamente 1/s, dependendo do animal), diminua a concentração de isoflurano.
   10. Execute uma craniotomia para o implante da lente de relé sob um microscópio cirúrgico ou estereomicroscópio usando uma broca de rebarba com um diâmetro de ponta de 0,7 mm. Use uma microbroca para pegar a broca de rebarba e desenhar um contorno da área do círculo pretendida (a espessura total do calvário não precisa ser penetrada).
       NOTA: A lente de relé utilizada no presente protocolo tinha um diâmetro de 1,0 mm, um comprimento ~ 9,0 mm um passo de 1 e uma faixa de distância de trabalho de ~100 μm - 300 μm; portanto, a craniotomia tinha diâmetro de 1,2 mm.
       1. Aprofunde suavemente o contorno até que a dura-máter esteja exposta.
       2. Prepare 3 mL de solução salina estéril em uma seringa de 3 mL e esfrie em um balde de gelo. Lave frequentemente a área exposta com 0,1 mL de solução salina da seringa para resfriar a área e evitar danos causados pelo calor e hemorragia.
   11. Colha e descasque levemente a dura-máter com uma agulha 27G.
   12. Coloque uma marcação em uma agulha contundente de 27 G a 1 mm da ponta e use-a para aspirar cuidadosamente o córtex cerebral, a fim de criar uma janela para o implante da lente 8,11,13,17 (Figura 2B1). Se necessário, faça uma agulha contundente moendo a ponta de uma agulha de injeção 27 G com lixa. Em seguida, conecte a agulha a uma seringa, conecte a seringa a um tubo e conecte o tubo a uma fonte de sucção para criar um vácuo.
       NOTA: A lente de relé é contundente e comprimirá o tecido cerebral quando for colocada na área profunda do cérebro. Assim, a aspiração do córtex reduz o dano tecidual devido ao implante da lente de relé. O córtex tem aproximadamente 1 mm de espessura em camundongos, mas é difícil de visualizar sob um estereomicroscópio. A marca cria um marco para permitir que a profundidade da agulha seja determinada com mais precisão do que apenas com um estereomicroscópio. Além disso, pode-se determinar se a região do córtex foi alcançada ou passada, dependendo da resistência; a porção superior do córtex parece relativamente macia, enquanto a região subcortical parece densa. Portanto, uma vez que a textura comece a parecer mais densa, pare a aspiração (Figura 2B3).
   13. Prepare 3 mL de solução salina estéril em uma seringa de 3 mL e esfrie em um balde de gelo. Lave a área com solução salina para parar o sangramento e diminuir a possibilidade de edema cerebral.
2. Injeção de vírus adenoassociado (AAV)
   NOTA: AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE foi utilizado no presente experimento. jGCaMP7s é um indicador de cálcio geneticamente codificado que emite fluorescência verde³. Como o presente estudo utilizou um camundongo do tipo selvagem como sujeito, um vetor viral foi necessário para transfectar os neurônios com o gene indicador de cálcio verde-fluorescente e permitir a expressão. Pesquisadores usando camundongos transgênicos expressando o indicador de cálcio verde-fluorescente como seus sujeitos podem pular o protocolo 2.2.
   1. Monte a agulha interna de um cateter intravenoso (i.v.) de 20 G no braço estereotáxico e puncione lentamente (~100 - 200 μm/min) o cérebro nas coordenadas apropriadas (as mesmas coordenadas usadas durante o implante da lente de relé) (Figura 2B3).
   2. Abaixe a agulha de microinjeção a uma velocidade de 100-200 μm/min no CA1 ventral e infunda (~ 25 nL/min) 200 nL do vetor viral na região alvo (-3,16 mm AP, 3,25 mm ML e -3,50 mm DV do bregma).
   3. Aguarde 10 minutos para permitir que o vírus se difunda e minimizar o fluxo de retorno.
   4. Retire (~100-200 μm/min) a agulha de microinjeção.
3. Implante de lente de relé
   1. Desinfetar a lente do relé com álcool a 75%^10,16 e, em seguida^, enxaguar com solução salina isenta de pirogênio. Mergulhe a lente em solução salina fria livre de pirogênio até a implantação.
      NOTA: Uma lente fria minimiza o edema cerebral quando colocada no cérebro.
   2. Segure a lente do relé usando um grampo de micro buldogue (Figura 2B3) cujos dentes foram cobertos com tubos termoencolhíveis.
      NOTA: O grampo do buldogue pode segurar firmemente a lente sem danificá-la. Consulte Resendez et ^al.8 para o método de fazer a braçadeira de buldogue coberta de tubos.
   3. Coloque lentamente (~100 - 200 μm/min) a lente de relé no topo da região alvo (-3,16 mm AP, 3,50 mm ML e -3,50 mm DV do bregma) e estabilize-a com cimento dental.
4. Baseplating fictício
   NOTA: O objetivo do "baseplating fictício" durante a cirurgia de implantação é criar uma base de cimento dentário, a fim de reduzir a quantidade de cimento dentário que precisa ser aplicado durante o procedimento de baseplating real várias semanas depois. Desta forma, o risco de uma mudança no volume do cimento dentário é minimizado.
   1. Prenda a lente objetiva na parte inferior do miniscópio e monte a placa de base no miniscópio (nesta etapa, a montagem da lente objetiva ancorada, da placa de base e do miniscópio ainda não foi colocada sobre o crânio do mouse).
   2. Enrolar 10 cm de película de parafina em torno do exterior da placa de base (Figura 4A).
   3. Segure o miniscópio com a sonda de braço estereotáxica usando argila adesiva reutilizável.
   4. Alinhe a lente objetiva sobre a lente do relé com o mínimo de espaço possível entre as lentes (Figura 4B).
   5. Use cimento dentário para fixar o posicionamento da placa de base (de modo que o cimento toque apenas o filme de parafina).
   6. Quando o cimento dentário tiver secado, remova o filme.
   7. Remova a placa de base e o miniscópio. A base de cimento dental é oca (Figura 4B).
   8. Para proteger a lente do relé das atividades diárias e de ser arranhada pelo mouse, sele a lente do relé com um pouco de borracha de silicone de moldagem até que a lente do relé seja coberta e cubra a borracha de silicone com uma fina camada de cimento dental (Figura 4B).
   9. Desligue o mouse dos instrumentos estereotáxicos e coloque-o em uma câmara de recuperação.
   10. Injete carprofeno (5 mg/kg; injeção subcutânea) ou meloxicam (1 mg/kg; injeção subcutânea) para analgesia e ceftazidima (25 mg/kg; injeção subcutânea) para prevenir a infeção.
       NOTA: O uso de antibióticos não é uma alternativa a uma técnica asséptica. Antibióticos perioperatórios (ou seja, ceftazidima) podem ser indicados em determinadas circunstâncias, como cirurgias de longa duração ou colocação de implantes crônicos.
   11. Observe o animal até que ele recupere a consciência suficiente para manter a retração esternal.
   12. Ratos domésticos individualmente e injetam meloxicam (1 mg/kg; injeção subcutânea; q24h) durante uma semana para aliviar a dor pós-cirúrgica. Verifique o animal todos os dias após a cirurgia para se certificar de que ele está comendo, bebendo e defecando normalmente.
   13. Realize o baseplating após 3 ou mais semanas.

3. Baseplating

NOTA: Normalmente, o procedimento de baseplating (Figura 5) não pode ser realizado dentro de 2-3 semanas do procedimento inicial devido ao tempo de recuperação e incubação viral. Os procedimentos de indução para a baseplating são semelhantes aos descritos nas etapas 2.1.1 a 2.1.8. No entanto, o baseplating não é um procedimento invasivo, e o animal requer apenas sedação leve. Portanto, 0,8-1,2% de isoflurano é suficiente, desde que o animal não possa se mover no quadro estereotáxico. Além disso, a anestesia com isoflurano relativamente leve também pode ajudar a facilitar a expressão dos transientes de fluorescência dos neurônios durante o monitoramento⁸ (Vídeo suplementar S2).

1. Corte cuidadosamente a fina camada do telhado de cimento dental com um rongeur ósseo e remova a borracha de silicone. Limpe a superfície da lente do relé com álcool a 75%.
2. Prenda um parafuso ajustado ao lado da placa de base para fixá-lo na parte inferior do miniscópio (Figura 5A1).
   NOTA: A placa de base deve ser apertada de forma segura sob a parte inferior do miniscópio porque a diferença entre uma placa de base apertada e levemente fixada pode causar uma distância inconsistente.
3. Ajuste o slide de foco para estar a aproximadamente 2,7 - 3 mm do invólucro principal (Figura 5A2).
   NOTA: Embora o comprimento possa ser ajustado ainda mais durante o procedimento de baseplating, fixe-o em aproximadamente 2,7 mm, porque ajustar simultaneamente o comprimento do miniscópio e o comprimento ideal entre a lente de relé implantada e a lente objetiva pré-ancorada é muito confuso.
4. Conecte o miniscópio à placa de aquisição de dados e conecte-o a uma porta USB 3.0 (ou versão superior) em um computador.
5. Execute o software de aquisição de dados desenvolvido pela equipe da UCLA.
6. Ajuste a exposição para 255, o ganho para 64x e o LED de excitação para 5%. Essas configurações são recomendadas para o baseplating inicial; as configurações específicas variam dependendo das regiões do cérebro e dos níveis de expressão do indicador de cálcio geneticamente codificado.
7. Clique no botão Conectar para conectar o miniscópio ao software de aquisição de dados e assistir à transmissão ao vivo.
8. Alinhe a lente objetiva do miniscópio à lente do relé manualmente e comece a procurar os sinais de fluorescência (Figura 5B₁).
   NOTA: Inicialmente, a busca manual pelo sinal de fluorescência facilita os ajustes. Como um sistema AAV foi utilizado para expressar o indicador de cálcio geneticamente codificado, tanto o tipo promotor quanto o sorotipo AAV afetaram a eficiência da transfecção^23,24. Os pesquisadores devem precisar verificar a expressão do indicador de cálcio, encontrando neurônios individuais que mostram mudanças na fluorescência antes de prosseguir com experimentos futuros.
9. Perfure o cimento dentário em qualquer lugar onde ele bloqueie o miniscópio (opcional).
10. Assista à transmissão ao vivo do software de aquisição de dados e use a margem da lente de relé como um ponto de referência (Vídeo suplementar S2). A margem da lente de relé aparece como um círculo cinza semelhante à lua no monitor (Figura 5B1; setas brancas).
11. Uma vez que a lente de relé é encontrada, ajuste cuidadosamente os vários ângulos e distâncias do miniscópio até que os sinais de fluorescência sejam encontrados.
    NOTA: As imagens dos neurônios são mais brancas do que o fundo. Uma forma neuronal precisa indica que os neurônios se encontram perfeitamente no plano focal da lente de relé. Neurônios redondos sugerem que eles estavam perto do plano focal. A forma neuronal é diferente em todo o cérebro, aqui CA1 ventral é mostrado como um exemplo.
12. Se nenhum neurônio individual apresentar alterações na fluorescência em função do tempo, sele novamente a base com borracha de silicone. A fluorescência não é observada porque o período de incubação também é dependente da propriedade do vírus^23,24. Execute as etapas 3.1-3.12 após uma semana adicional. (Isso é opcional).
13. Segure o miniscópio na posição ideal e mova o braço estereotáxico com uma argila adesiva reutilizável em direção ao miniscópio (Figura 5B2). Adere o miniscópio ao braço estereotáxico com argila adesiva reutilizável.
14. Ajuste ligeiramente os braços x, y e z para procurar a melhor visualização (vídeo suplementar S2). Em seguida, ajuste o ângulo entre a superfície da lente objetiva e a lente de relé girando a barra auricular, a barra do dente ou a argila adesiva reutilizável no eixo z. A expressão viral e o implante de lentes são bem-sucedidos quando pelo menos uma célula exibe transientes de fluorescência (Figura 6A; Vídeo suplementar S2) durante a baseplating (que também depende da área do cérebro, como o CA1).
    Observação : se o monitor mostrar apenas células brancas, mas sem transientes, há outra causa (consulte a Figura 6B,C, Vídeos suplementares S4,S5, a seção Resultados e a seção Solução de problemas).
15. Cimento da placa de base (Figura 5B2) com o cimento dental.
16. Monitore a região de interesse durante a cimentação para garantir que a posição ideal não mude.
17. Use a menor quantidade possível de cimento enquanto ainda cola firmemente a placa de base na base de cimento dentário (Figura 5B2). Aplique uma segunda e terceira camada de cimento ao redor da placa de base, mas tenha cuidado para não afetar a lente GRIN.
    NOTA: A aplicação de cimento na placa de base é mais fácil nesta etapa, uma vez que a base da placa de base foi formada durante o procedimento de revestimento fictício.
18. Retire cuidadosamente o miniscópio da placa de base quando o cimento estiver curado. Em seguida, parafuse uma tampa protetora.
19. Mova o animal para uma gaiola de recuperação. Observe o animal até que ele recupere a consciência suficiente para manter a retração esternal.
20. Ratos domésticos individualmente. Certifique-se de que ele está comendo, bebendo e defecando normalmente todos os dias. Aguarde 5 dias para que o rato recupere totalmente e, em seguida, verifique a imagem de cálcio.
    NOTA: Há apenas uma pequena quantidade de cimento dental segurando a placa de base. Portanto, se a placa de base tiver mudado consideravelmente desde o procedimento de baseplating, remova o cimento dentário com uma broca execute o procedimento de baseplating novamente.
21. Anestesiar (por injeção intraperitoneal de uma mistura de cetamina (87 mg/kg) /xilazina (13 mg/kg)) e perfundir²⁵ o animal quando todas as experiências estiverem concluídas.

Resultados

Avaliação da alteração do volume de cimento dentário
Uma vez que o volume de cimento dentário muda durante o processo de cura, pode impactar significativamente a qualidade da imagem, uma vez que a distância de trabalho de uma lente GRIN é de aproximadamente 50 a 350 μm ^4,8. Portanto, dois cimentos dentários comercialmente disponíveis foram testados neste caso, Tempron e Tokuso, antes do procedimento de implantação e baseplating (<...

Discussão

O presente relatório descreve um protocolo experimental detalhado para pesquisadores que usam o sistema UCLA Miniscope de duas lentes. As ferramentas projetadas em nosso protocolo são relativamente acessíveis para qualquer laboratório que deseje experimentar imagens de cálcio in vivo. Alguns protocolos, como injeção viral, implantação de lentes, baseplating fictício e baseplating, também podem ser usados para outras versões do sistema miniscópio para melhorar a taxa de sucesso da imagem de cálcio. ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7-mm drill bit	#19008-07	Fine Science Tools; USA	for surgery
0.1–10 μl pipette tips	104-Q; QSP	Fisher Scientific; Singapore	for testing dental cement
20 G IV cathater	#SR-OX2032CA	Terumo Corporation; Tokyo, Japan	for surgery
27 G needle	AGANI, AN*2713R	Terumo Corporation; Tokyo, Japan	for surgery
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE	#104487-AAV9; 1.5*10^13	Addgene viral prep; MA, USA	for viral injection
Atropine sulfate		Astart; Hsinchu, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Baseplate	V3	http://miniscope.org	for dummy baseplating/baseplating
BLU TACK	#30840350	Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA	Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating
Bone Rongeur Friedman	13 cm	Diener; Tuttlingen, Germany	for baseplating
Buprenorphine		INDIVIOR; UK	for surgery
Carprofen	Rimadyl	Zoetis; Exton, PA	analgesia
Ceftazidime		Taiwan Biotech; Taiwan	prevent infection
Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope	purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq		for baseplating
Dental cement set	Tempron	GC Corp; Tokyo, Japan	for testing dental cement
Dental cement set	Tokuso Curefast	Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan	for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating
Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors	#51673	Stoelting Co; Illinois, USA	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Duratear ointment		Alcon; Geneva, Switzerland	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Ibuprofen		YungShin; Taiwan	analgesia
Isoflurane		Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Inscopix	nVista System	Inscopix; Palo Alto, CA	for comparison with V3 UCLA Miniscope
Ketamine		Pfizer; NY, NY	for euthanasia
Normal saline			for surgery
Micro bulldog clamps	#12.102.04	Dimedo; Tuttlingen, Germany	for lens implantation
Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge	#88400	Hamilton; Bonaduz, Switzerland	for viral injection
Molding silicone rubber	ZA22 Thixo	Zhermack; Badia Polesine, Italy	for dummy baseplating
Objective Gradient index (GRIN) lens	#64519	Edmund Optics; NJ, USA	for dummy baseplating/baseplating
Parafilm	#PM996	Bemis; Neenah, USA	for dummy baseplating
Portable Suction	#DF-750	Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan	for surgery
Relay GRIN lens	#1050-002177	Inscopix; Palo Alto, CA, USA	for dummy baseplating/baseplating
Stainless steel anchor screws	1.00 mm diameter, total length 3.00 mm		for surgery
Stereo microscope	#SL720	Sage Vison; New Taipei City, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Stereotaxic apparatus	#51673	Stoelting; IL, USA	for surgery/dummy baseplating/baseplating
UV Cure Adhesive	#3321	Loctite; Düsseldorf, Germany	for testing dental cement
V3 UCLA Miniscope	purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components		for surgery/dummy baseplating/baseplating
Xylazine	X1126	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	for euthanasia
Xylocaine pump spray 10%		AstraZeneca; Södertälje, Sweden	for surgery