Utilizzo di baseplating e un miniscopio preancorato con una lente obiettiva per la ricerca transitoria di calcio nei topi

Riepilogo

Il restringimento del cemento dentale durante la polimerizzazione sposta la piastra di base. Questo protocollo minimizza il problema creando una base iniziale del cemento dentale che lascia spazio per cementare la piastra di base. Settimane dopo, la piastra di base può essere cementata in posizione su questa impalcatura utilizzando poco nuovo cemento, riducendo così il restringimento.

Abstract

I neuroscienziati usano microscopi in miniatura (miniscopi) per osservare l'attività neuronale negli animali che si comportano liberamente. Il team Miniscope dell'Università della California, Los Angeles (UCLA) fornisce risorse aperte ai ricercatori per costruire miniscopi stessi. Il miniscope UCLA V3 è uno dei miniscope open source più popolari attualmente in uso. Permette l'imaging dei transitori di fluorescenza emessi da neuroni geneticamente modificati attraverso una lente obiettiva impiantata sulla corteccia superficiale (un sistema a una lente), o nelle aree cerebrali profonde attraverso una combinazione di una lente relè impiantata nel cervello profondo e una lente obiettiva che è preancorata nel miniscopio per osservare l'immagine trasmessa (un sistema a due lenti). Anche in condizioni ottimali (quando i neuroni esprimono indicatori di fluorescenza e la lente del relè è stata impiantata correttamente), una variazione di volume del cemento dentale tra la piastra di base e il suo attaccamento al cranio durante la polimerizzazione del cemento può causare disallineamento con una distanza alterata tra l'obiettivo e le lenti del relè, con conseguente scarsa qualità dell'immagine. Una piastra di base è una piastra che aiuta a montare il miniscopio sul cranio e fissa la distanza di lavoro tra l'obiettivo e le lenti del relè. Pertanto, i cambiamenti nel volume del cemento dentale attorno alla piastra di base alterano la distanza tra le lenti. Il presente protocollo mira a ridurre al minimo il problema del disallineamento causato dalle variazioni di volume nel cemento dentale. Il protocollo riduce il disallineamento costruendo una base iniziale di cemento dentale durante l'impianto della lente relè. Il tempo di convalescenza dopo l'impianto è sufficiente per la fondazione del cemento dentale per polimerizzare completamente la piastra di base, quindi la piastra di base può essere cementata su questa impalcatura usando il minor cemento nuovo possibile. Nel presente articolo, descriviamo le strategie per il baseplating nei topi per consentire l'imaging dell'attività neuronale con una lente obiettiva ancorata al miniscopio.

Introduzione

I reporter di attività fluorescente sono ideali per l'imaging dell'attività neuronale perché sono sensibili e hanno ampie gamme dinamiche ^1,2,3. Pertanto, un numero crescente di esperimenti utilizza la microscopia a fluorescenza per osservare direttamente l'attività neuronale 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ^,16. Il primo microscopio miniaturizzato a fluorescenza a un fotone (miniscopio) è stato progettato nel 2011 da Mark Schnitzer et ^al.5. Questo miniscopio consente ai ricercatori di monitorare la dinamica della fluorescenza delle cellule cerebellari negli animali che si comportano liberamente⁵ (cioè, senza alcuna restrizione fisica, contenimento della testa, sedazione o anestesia agli animali). Attualmente, la tecnica può essere applicata per monitorare aree cerebrali superficiali come la corteccia 6,8,15,16; aree sottocorticali come l'ippocampo dorsale 8,11,13,14 e lo striato ^6,17; e aree cerebrali profonde come l'ippocampo ventrale¹⁴, l'amigdala 10,18 e l'ipotalamo ^8,12.

Negli ultimi anni sono stati sviluppati diversi miniscope open source^{4,5,6,7,11,13,17,19}. Il miniscopio può essere assemblato economicamente dai ricercatori se seguono le linee guida passo-passo fornite dal team Miniscope dell'Università della California, Los Angeles (UCLA)^4,7,11,13. Perché il monitoraggio ottico dell'attività neurale è limitato dalle limitazioni della trasmissione della luce⁷ da e verso la popolazione neuronale di interesse, è stato progettato un miniscopio che richiede una lente a gradiente di rifrazione oggettiva (GRIN) (o lente obiettivo) da preancorare nella parte inferiore del miniscopio per ingrandire il campo visivo che viene trasmesso da una lente GRIN relè (o lente relè)^{6,7,8,10,16,17}. Questa lente relè viene impiantata nella regione cerebrale bersaglio in modo tale che l'attività di fluorescenza della regione cerebrale bersaglio venga trasmessa sulla superficie della lente relè.^{6,7,8,10,16,17}. Circa 1/4 di un periodo sinusoidale completo di luce viaggia attraverso la lente GRIN dell'obiettivo (~ 0,25 passo) (Figura 1A1), ottenendo un'immagine a fluorescenza ingrandita^6,7. La lente dell'obiettivo non è sempre fissata nella parte inferiore del miniscopio né è necessario l'impianto della lente relè.^6,7,11,13,15. Nello specifico, ci sono due configurazioni: una con una lente fissa nel miniscopio e una lente relè impiantata nel cervello^{8,10,12,14,16} (Figura 1B1) e un altro con solo un obiettivo rimovibile^6,7,11,13,15 (Figura 1B2). Nella progettazione basata sull'obiettivo fisso e sulla combinazione di lenti a relè impiantate, i segnali di fluorescenza dal cervello vengono portati sulla superficie superiore della lente del relè (Figura 1A1)^{7,8,10,12,14,16}. Successivamente, la lente dell'obiettivo può ingrandire e trasmettere il campo visivo dalla superficie superiore della lente relè (Figura 1A2). D'altra parte, il design della lente GRIN dell'obiettivo rimovibile è più flessibile, il che significa che il preimpianto di una lente relè nel cervello non è obbligatorio (Figura 1B2)^6,7,11,13,15. Quando si utilizza un miniscopio basato su un design di obiettivo rimovibile, i ricercatori devono ancora impiantare una lente nella regione del cervello bersaglio, ma possono impiantare una lente obiettiva^6,7,11,13,15 o una lente relè nel cervello^6,7. La scelta di un obiettivo o di una lente relè per l'impianto determina la configurazione del miniscopio che il ricercatore deve utilizzare. Ad esempio, il V3 UCLA Miniscope si basa su un obiettivo GRIN rimovibile. I ricercatori possono scegliere di impiantare direttamente una lente obiettiva nella regione cerebrale di interesse e montare il miniscopio "vuoto" sulla lente dell'obiettivo^6,7,11,13,15 (un sistema a una lente; Figura 1B2) o di impiantare una lente relè nel cervello e montare un miniscopio preancorato con una lente obiettiva.^6,7 (un sistema a due lenti; Figura 1B1). Il miniscopio funziona quindi come una fotocamera a fluorescenza per catturare immagini livestream della fluorescenza neuronale prodotta da un indicatore di calcio geneticamente codificato.^1,2,3. Dopo aver collegato il miniscope a un computer, queste immagini a fluorescenza possono essere trasferite al computer e salvate come clip video. I ricercatori possono studiare l'attività neuronale analizzando i cambiamenti relativi nella fluorescenza con alcuni pacchetti di analisi^20,21 o scrivere i loro codici per analisi future.

Il miniscopio V3 UCLA offre agli utenti la flessibilità di determinare se visualizzare l'attività neuronale con un sistema a una o due lenti⁷. La scelta del sistema di registrazione si basa sulla profondità e sulle dimensioni dell'area cerebrale target. In breve, un sistema a una lente può solo visualizzare un'area superficiale (meno di circa 2,5 mm di profondità) e relativamente grande (più grande di circa 1,8 x 1,8 mm²) perché i produttori producono solo una certa dimensione di obiettivo obiettivo. Al contrario, un sistema a due lenti può essere applicato a qualsiasi area cerebrale target. Tuttavia, il cemento dentale per l'incollaggio della piastra di base tende a causare disallineamento con una distanza alterata tra l'obiettivo e le lenti del relè, con conseguente scarsa qualità dell'immagine. Se si utilizza il sistema a due lenti, è necessario puntare con precisione due distanze di lavoro per ottenere la qualità di imaging ottimale (Figura 1A). Queste due distanze di lavoro critiche sono tra i neuroni e la superficie inferiore della lente del relè e tra la superficie superiore della lente del relè e la superficie inferiore della lente dell'obiettivo (Figura 1A1). Qualsiasi disallineamento o posizionamento errato dell'obiettivo al di fuori della distanza di lavoro provoca un errore di imaging (Figura 1C2). Al contrario, il sistema a una lente richiede solo una distanza di lavoro precisa. Tuttavia, la dimensione della lente dell'obiettivo limita la sua applicazione per il monitoraggio delle regioni cerebrali profonde (la lente dell'obiettivo che si adatta al miniscopio è di circa 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Pertanto, l'impianto di una lente obiettiva è limitato per l'osservazione della superficie e di regioni cerebrali relativamente grandi, come la corteccia 6,15 e la cornu ammonis dorsale 1 (CA1) nei topi^11,13 . Inoltre, una vasta area della corteccia deve essere aspirata per colpire il CA1 dorsale^11,13. A causa della limitazione della configurazione a una lente che impedisce l'imaging delle regioni cerebrali profonde, i sistemi miniscope commerciali offrono solo un design combinato obiettivo / obiettivo relè (due lenti). D'altra parte, il miniscopio V3 UCLA può essere modificato in un sistema a una o due lenti perché il suo obiettivo è rimovibile 6,11,13,15. In altre parole, gli utenti del miniscopio V3 UCLA possono sfruttare la lente rimovibile impiantandola nel cervello (creando un sistema a una lente), quando eseguono esperimenti che coinvolgono osservazioni cerebrali superficiali (meno di 2,5 mm di profondità), o preancorandola nel miniscopio e impiantando una lente relè nel cervello (creando un sistema a due lenti), quando si eseguono esperimenti che coinvolgono osservazioni cerebrali profonde. Il sistema a due lenti può anche essere applicato per osservare superficialmente il cervello, ma il ricercatore deve conoscere le distanze di lavoro accurate tra la lente dell'obiettivo e la lente relè. Il vantaggio principale del sistema a una lente è che c'è una minore possibilità di perdere le distanze di lavoro rispetto a un sistema a due lenti, dato che ci sono due distanze di lavoro che devono essere mirate con precisione per ottenere una qualità di imaging ottimale nel sistema a due lenti (Figura 1A). Pertanto, si consiglia di utilizzare un sistema a una lente per le osservazioni cerebrali superficiali. Tuttavia, se l'esperimento richiede l'imaging nell'area profonda del cervello, il ricercatore deve imparare a evitare il disallineamento delle due lenti.

Il protocollo di base per la configurazione a due lenti di miniscopi per esperimenti include l'impianto di lenti e la placcatura di base 8,10,16,17. Il baseplating è l'incollaggio di una piastra di base sulla testa di un animale in modo che il miniscopio possa essere eventualmente montato sopra l'animale e videoregistrare i segnali di fluorescenza dei neuroni (Figura 1B). Questa procedura prevede l'uso di cemento dentale per incollare la piastra di base sul cranio (Figura 1C), ma il restringimento del cemento dentale può causare cambiamenti inaccettabili nella distanza tra la lente relè impiantata e la lente obiettiva ^8,17. Se la distanza spostata tra le due lenti è troppo grande, le celle non possono essere messe a fuoco.

Sono già stati pubblicati protocolli dettagliati per esperimenti di imaging del calcio cerebrale profondo che utilizzano miniscopi^8,10,16,17. Gli autori di questi protocolli hanno utilizzato il sistema Inscopix^8,10,16 o altri disegni personalizzati¹⁷ e hanno descritto le procedure sperimentali per la selezione virale, la chirurgia e l'attaccamento della piastra di base. Tuttavia, i loro protocolli non possono essere applicati con precisione ad altri sistemi open source, come il sistema V3 UCLA Miniscope, NINscope⁶e Finchscope¹⁹. Il disallineamento delle due lenti può verificarsi durante la registrazione in una configurazione a due lenti con un miniscopio UCLA a causa del tipo di cemento dentale che viene utilizzato per cementare la piastra di base al cranio^8,17 (Figura 1C). Il presente protocollo è necessario perché la distanza tra la lente relè impiantata e la lente dell'obiettivo è soggetta a spostarsi a causa del restringimento indesiderato del cemento dentale durante la procedura di placcatura di base. Durante la placcatura di base, la distanza di lavoro ottimale tra la lente relè impiantata e la lente dell'obiettivo deve essere trovata regolando la distanza tra il miniscopio e la parte superiore della lente relè e la piastra di base deve quindi essere incollata in questa posizione ideale. Dopo aver impostato la distanza corretta tra la lente dell'obiettivo e la lente relè impiantata, è possibile ottenere misurazioni longitudinali alla risoluzione cellulare (Figura 1B; in vivo registrazione). Poiché la gamma ottimale di distanze di lavoro di una lente relè è piccola (50 - 350 μm)^4,8, un eccessivo restringimento del cemento durante l'indurimento può rendere difficile mantenere la lente dell'obiettivo e la lente relè impiantata entro l'intervallo appropriato. L'obiettivo generale di questo rapporto è fornire un protocollo per ridurre i problemi di restringimento^8,17 che si verificano durante la procedura di baseplating e per aumentare il tasso di successo delle registrazioni miniscope di segnali di fluorescenza in una configurazione a due lenti. La registrazione di successo del miniscopio è definita come la registrazione di un livestream di notevoli cambiamenti relativi nella fluorescenza dei singoli neuroni in un animale che si comporta liberamente. Sebbene diverse marche di cemento dentale abbiano tassi di restringimento diversi, i ricercatori possono selezionare un marchio che è stato precedentemente testato.^{6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22}. Tuttavia, non tutte le marche sono facili da ottenere in alcuni paesi/regioni a causa delle normative sull'importazione di materiali medici. Pertanto, abbiamo sviluppato metodi per testare i tassi di ritiro dei cementi dentali disponibili e, soprattutto, fornire un protocollo alternativo che minimizzi il problema del restringimento. Il vantaggio rispetto all'attuale protocollo di baseplating è un aumento del tasso di successo dell'imaging del calcio con strumenti e cemento che possono essere facilmente ottenuti in laboratorio. Il miniscope UCLA è usato come esempio, ma il protocollo è applicabile anche ad altri miniscope. In questo rapporto, descriviamo una procedura di baseplating ottimizzata e raccomandiamo anche alcune strategie per il montaggio del sistema a due lenti del miniscopio UCLA (Figura 2A). Vengono presentati sia esempi di impianto riuscito (n = 3 topi) che esempi di impianto fallito (n = 2 topi) per la configurazione a due lenti con il miniscopio UCLA insieme alle discussioni per le ragioni dei successi e dei fallimenti.

Protocollo

Tutte le procedure eseguite in questo studio sono state approvate dal National Taiwan University Animal Care and Use Committee (approvazione n.: NTU-109-EL-00029 e NTU-108-EL-00158).

1. Valutazione dell'alterazione volumetrica del cemento dentale

NOTA: Durante il processo di polimerizzazione si verificano cambiamenti nel volume del cemento dentale. Testare le variazioni di volume del cemento dentale prima dell'impianto e della placcatura di base. I ricercatori possono testare qualsiasi marca di cemento dentale e utilizzare il marchio con il più basso cambiamento di volume per cementare la piastra di base. Un esempio è illustrato nella Figura 3.

1. Pesare 0,5 g di ogni polvere di cemento dentale e mescolarla con la sua soluzione appropriata (1 ml).
   NOTA: Il rapporto polvere/liquido raccomandato nelle istruzioni per il cemento dentale è di 0,5 g di polvere per 0,25 ml della soluzione per ottenere una forma solida. Questo protocollo di prova diluisce il rapporto a 0,5 g/ml in modo che la miscela possa essere aspirata in forma liquida per misurare la variazione di volume nelle punte delle pipette.
2. Utilizzare punte per pipette da 0,1 a 10 μL per rimuovere 2,5 μL della miscela di cemento dentale, quindi sigillare la punta della pipetta con una colla fotopolimerizzante.
3. Posizionare le punte su un rack, contrassegnare i livelli più alti della miscela di cemento dentale e misurare il livello della miscela di cemento dentale dopo 40 minuti (video supplementare S1).
4. Oltre a monitorare le variazioni di livello durante la polimerizzazione del cemento dentale nelle punte, misurare la densità residua del cemento dentale secco. Per calcolare la densità, misurare il peso del cemento dentale e misurare il volume con il principio di Archimede.
   1. In breve, posizionare il cemento dentale asciutto rimanente in una tazza piena d'acqua e pesare l'acqua che trabocca.
5. Utilizzare il cemento dentale con il minimo restringimento per tutti i protocolli descritti di seguito.

2. Anestesia, impianto chirurgico, iniezione virale e baseplating fittizio

1. Anestesia
   NOTA: Il presente rapporto mira a ottimizzare la chirurgia e la procedura di baseplating per il miniscopio UCLA; Pertanto, si presumeva che fosse noto il titolo virale ottimale per infettare le regioni cerebrali bersaglio. I metodi per trovare il titolo virale ottimale possono essere trovati nei passaggi da 1 a 5 di Resendez et al.⁸. Una volta ottimizzata la diluizione virale, è possibile iniziare l'impianto chirurgico.
   1. Posizionare il mouse in un contenitore a induzione e fornire ossigeno (100% con una portata d'aria di 0,2 L/min). Preossigenare il mouse per 5-10 minuti.
   2. Somministrare isoflurano al 5% miscelato con ossigeno al 100% (portata d'aria: 0,2 L/min) fino a quando il topo inizia a perdere l'equilibrio e viene infine anestetizzato.
   3. Rimuovere il topo dalla camera di induzione e iniettare atropina (0,04 mg/kg; iniezione sottocutanea), per prevenire l'accumulo di saliva e buprenorfina (0,03 mg/kg; iniezione sottocutanea) come analgesico.
   4. Rasare la testa del mouse.
   5. Indossare una maschera, un camice sterile e guanti. Preparare uno spazio sterile e strumenti chirurgici sterili per la chirurgia. Stabilizzare la testa del topo (mantenere l'anestesia con isoflurano dal 3 al 2,5% durante questa fase) sull'apparato stereotassico. Dopo le procedure analgesiche e anestetiche, assicurarsi che le barre auricolari stabilizzino saldamente la testa. Fornire supporto termico.
   6. Assicurarsi che la testa sia impostata in posizione diritta, sterilizzare la testa rasata con betadine e quindi spruzzare la testa con xilocaina (10%), un analgesico locale.
   7. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza.
      NOTA: Utilizzare unguento oftalmico per la protezione degli occhi durante tutti gli eventi anestetici per prevenire lesioni oculari.
   8. Prova il riflesso del dolore profondo dell'animale pizzicando la zampa posteriore. Una volta che l'animale non mostra alcun riflesso di ritiro della zampa, procedere con le procedure chirurgiche.
   9. Fare una piccola incisione lungo il piano medio-sagittale del cranio (partendo da circa 2 mm anteriormente al bregma e terminando circa 6 mm posteriormente al bregma). Quindi, pulire il tessuto connettivo sul cranio e ancorare tre viti in acciaio inossidabile sulle ossa frontali e interparietali sinistre.
      1. A questo punto, ridurre l'isoflurano all'1-2%. Monitorare la frequenza respiratoria durante l'intera procedura chirurgica. Se la frequenza respiratoria è troppo lenta (circa 1/s, a seconda dell'animale), diminuire la concentrazione di isoflurano.
   10. Eseguire una craniotomia per l'impianto della lente relè al microscopio chirurgico o stereomicroscopio utilizzando un trapano di bava con un diametro della punta di 0,7 mm. Utilizzare un micro-trapano per afferrare la punta del trapano e disegnare un contorno dell'area circolare prevista (l'intero spessore del calvario non deve essere penetrato).
       NOTA: La lente relè utilizzata nel presente protocollo aveva un diametro di 1,0 mm, una lunghezza ~ 9,0 mm un passo di 1 e un intervallo di distanza di lavoro di ~ 100 μm - 300 μm; Pertanto, la craniotomia aveva un diametro di 1,2 mm.
       1. Approfondisci delicatamente il contorno fino a quando la dura è esposta.
       2. Preparare 3 ml di soluzione salina sterile in una siringa da 3 ml e raffreddarla in un secchiello per il ghiaccio. Risciacquare frequentemente l'area esposta con 0,1 ml di soluzione salina dalla siringa per raffreddare l'area e prevenire danni da calore ed emorragie.
   11. Prelevare e staccare leggermente la dura con un ago da 27G.
   12. Mettere una marcatura su un ago smussato da 27 G a 1 mm dalla punta e usarlo per aspirare attentamente la corteccia cerebrale al fine di creare una finestra per l'impianto della lente 8,11,13,17 (Figura 2B1). Se necessario, fare un ago smussato macinando la punta di un ago per iniezione da 27 G con carta vetrata. Quindi, collegare l'ago a una siringa, collegare la siringa a un tubo e collegare il tubo a una fonte di aspirazione per creare un vuoto.
       NOTA: La lente del relè è smussata e comprime il tessuto cerebrale quando viene posizionato nell'area cerebrale profonda. Pertanto, l'aspirazione della corteccia riduce il danno tissutale dovuto all'impianto della lente del relè. La corteccia è spessa circa 1 mm nei topi, ma è difficile da visualizzare con uno stereomicroscopio. Il marchio crea un punto di riferimento per consentire di determinare la profondità dell'ago in modo più preciso rispetto a un solo stereomicroscopio. Inoltre, si può determinare se la regione della corteccia è stata raggiunta o superata a seconda della resistenza; La parte superiore della corteccia si sente relativamente morbida, mentre la regione sottocorticale si sente densa. Pertanto, una volta che la texture inizia a sentirsi più densa, interrompere l'aspirazione (Figura 2B3).
   13. Preparare 3 ml di soluzione salina sterile in una siringa da 3 ml e raffreddarla in un secchiello per il ghiaccio. Risciacquare l'area con soluzione salina per fermare l'emorragia e ridurre la possibilità di edema cerebrale.
2. Iniezione di virus adeno-associati (AAV)
   NOTA: AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE è stato utilizzato nel presente esperimento. jGCaMP7s è un indicatore di calcio geneticamente codificato che emette fluorescenza verde³. Poiché il presente studio ha utilizzato un topo wild-type come soggetto, era necessario un vettore virale per trasfettare i neuroni con il gene indicatore di calcio fluorescente verde e consentire l'espressione. I ricercatori che utilizzano topi transgenici che esprimono l'indicatore di calcio verde-fluorescente come soggetti possono saltare il protocollo 2.2.
   1. Montare l'ago interno di un catetere endovenoso da 20 G (e.v.) sul braccio stereotassico e perforare lentamente (~100 - 200 μm/min) il cervello alle coordinate appropriate (le stesse coordinate utilizzate durante l'impianto del relente) (Figura 2B3).
   2. Abbassare l'ago di microiniezione ad una velocità di 100-200 μm/min nel CA1 ventrale e infondere (~ 25 nL/min) 200 nL del vettore virale nella regione bersaglio (-3,16 mm AP, 3,25 mm ML e -3,50 mm DV dal bregma).
   3. Attendere 10 minuti per consentire al virus di diffondersi e ridurre al minimo il flusso di ritorno.
   4. Prelevare (~100-200 μm/min) l'ago per microiniezione.
3. Impianto di lenti a relè
   1. Disinfettare la lente del relè con alcool al 75%^10,16 e quindi risciacquare con soluzione salina priva di pirogeni. Immergere la lente in soluzione salina fredda priva di pirogeni fino all'impianto.
      NOTA: Una lente fredda riduce al minimo l'edema cerebrale quando viene inserita nel cervello.
   2. Tenere la lente del relè usando un micro morsetto bulldog (Figura 2B3) i cui denti sono stati coperti con tubi termorestringenti.
      NOTA: il morsetto bulldog può tenere saldamente l'obiettivo senza danneggiarlo. Fare riferimento a Resendez et ^al.8 per il metodo per realizzare il morsetto bulldog coperto di tubi.
   3. Posizionare lentamente (~100 - 200 μm/min) la lente relè sopra la regione target (-3,16 mm AP, 3,50 mm ML e -3,50 mm DV dal bregma) e stabilizzarla con cemento dentale.
4. Baseplating fittizio
   NOTA: Lo scopo del "dummy baseplating" durante l'intervento chirurgico di impianto è quello di creare una base di cemento dentale al fine di ridurre la quantità di cemento dentale che deve essere applicata durante la procedura di baseplating reale diverse settimane dopo. In questo modo, il rischio di un cambiamento nel volume del cemento dentale è ridotto al minimo.
   1. Fissare la lente dell'obiettivo sul fondo del miniscopio e assemblare la piastra di base sul miniscopio (in questa fase, l'assemblaggio della lente dell'obiettivo ancorato, della piastra di base e del miniscopio non è ancora stato posizionato sul cranio del topo).
   2. Avvolgere 10 cm di pellicola di paraffina intorno all'esterno della piastra di base (Figura 4A).
   3. Tenere il miniscopio con la sonda da braccio stereotassica utilizzando argilla adesiva riutilizzabile.
   4. Allineare l'obiettivo sulla parte superiore dell'obiettivo con il minor spazio possibile tra gli obiettivi (Figura 4B).
   5. Utilizzare il cemento dentale per fissare il posizionamento della piastra di base (in modo tale che il cemento tocchi solo il film di paraffina).
   6. Quando il cemento dentale si è asciugato, rimuovere la pellicola.
   7. Rimuovere la piastra di base e il miniscopio. La base del cemento dentale è cava (Figura 4B).
   8. Per proteggere la lente del relè dalle attività quotidiane e dai graffi del mouse, sigillare la lente del relè con una gomma siliconica stampata fino a coprire la lente del relè e coprire la gomma siliconica con un sottile strato di cemento dentale (Figura 4B).
   9. Sganciare il mouse dagli strumenti stereotassici e collocarlo in una camera di recupero.
   10. Iniettare carprofen (5 mg/kg; iniezione sottocutanea) o meloxicam (1 mg/kg; iniezione sottocutanea) per analgesia e ceftazidima (25 mg/kg; iniezione sottocutanea) per prevenire l'infezione.
       NOTA: L'uso di antibiotici non è un'alternativa a una tecnica asettica. Gli antibiotici perioperatori (cioè ceftazidima) possono essere indicati in determinate circostanze, come interventi chirurgici di lunga durata o posizionamento di impianti cronici.
   11. Guarda l'animale fino a quando non riacquista sufficiente coscienza per mantenere la recumenza sternale.
   12. Ospitare i topi singolarmente e iniettare meloxicam (1 mg/kg; iniezione sottocutanea; q24h) per una settimana per alleviare il dolore post-chirurgico. Controlla l'animale ogni giorno dopo l'intervento chirurgico per assicurarti che stia mangiando, bevendo e defecando normalmente.
   13. Eseguire la placcatura di base dopo 3 o più settimane.

3. Baseplating

NOTA: Di solito, la procedura di baseplating (Figura 5) non può essere eseguita entro 2-3 settimane dalla procedura iniziale a causa del recupero e del tempo di incubazione virale. Le procedure di induzione per la placcatura di base sono simili a quelle descritte nei punti da 2.1.1 a 2.1.8. Tuttavia, la placcatura di base non è una procedura invasiva e l'animale richiede solo una leggera sedazione. Pertanto, lo 0,8-1,2% di isoflurano è sufficiente, purché l'animale non possa muoversi sul telaio stereotassico. Inoltre, l'anestesia isoflurana relativamente leggera può anche aiutare a facilitare l'espressione dei transitori di fluorescenza dei neuroni durante il monitoraggio⁸ (Video supplementare S2).

1. Tagliare con cura lo strato sottile del tetto in cemento dentale con un rongeur osseo e rimuovere la gomma siliconica. Pulire la superficie della lente del relè con alcool al 75%.
2. Fissare una vite di fissaggio accanto alla piastra di base per fissarla alla parte inferiore del miniscopio (Figura 5A1).
   NOTA: La piastra di base deve essere serrata saldamente sotto la parte inferiore del miniscopio perché la differenza tra una piastra di base serrata e leggermente fissata può causare una distanza incoerente.
3. Regolare la slitta di messa a fuoco in modo che si trovi a circa 2,7 - 3 mm dall'alloggiamento principale (Figura 5A2).
   NOTA: Sebbene la lunghezza possa essere ulteriormente regolata durante la procedura di placcatura di base, fissarla a circa 2,7 mm, perché la regolazione simultanea della lunghezza del miniscopio e della lunghezza ottimale tra la lente relè impiantata e la lente dell'obiettivo preancorata è molto confusa.
4. Collegare il miniscope alla scheda di acquisizione dati e collegarlo a una porta USB 3.0 (o versione successiva) su un computer.
5. Eseguire il software di acquisizione dati sviluppato dal team UCLA.
6. Regolare l'esposizione a 255, il guadagno a 64x e il LED di eccitazione al 5%. Queste impostazioni sono consigliate per la placcatura di base iniziale; Le impostazioni specifiche variano a seconda delle regioni del cervello e dei livelli di espressione dell'indicatore di calcio geneticamente codificato.
7. Fare clic sul pulsante Connetti per collegare il miniscope al software di acquisizione dati e guardare il livestream.
8. Allineare manualmente la lente dell'obiettivo del miniscopio alla lente del relè e iniziare a cercare i segnali di fluorescenza (Figura 5B₁).
   NOTA: Inizialmente, la ricerca manuale del segnale di fluorescenza facilita le regolazioni. Poiché è stato utilizzato un sistema AAV per esprimere l'indicatore di calcio geneticamente codificato, sia il tipo di promotore che il sierotipo AAV hanno influenzato l'efficienza della trasfezione^23,24. I ricercatori dovrebbero verificare l'espressione dell'indicatore di calcio trovando singoli neuroni che mostrano cambiamenti nella fluorescenza prima di procedere con esperimenti futuri.
9. Forare il cemento dentale in qualsiasi punto in cui blocca il miniscopio (opzionale).
10. Guarda il live streaming del software di acquisizione dati e utilizza il margine dell'obiettivo relè come punto di riferimento (video supplementare S2). Il margine dell'obiettivo relè appare come un cerchio grigio simile a una luna sul monitor (Figura 5B1; frecce bianche).
11. Una volta trovata la lente del relè, regolare attentamente i vari angoli e distanze del miniscopio fino a trovare i segnali di fluorescenza.
    NOTA: Le immagini dei neuroni sono più bianche dello sfondo. Una precisa forma neuronale indica che i neuroni si trovano perfettamente sul piano focale della lente del relè. I neuroni rotondi suggeriscono che erano vicini al piano focale. La forma neuronale è diversa in tutto il cervello, qui CA1 ventrale è mostrato come esempio.
12. Se nessun singolo neurone mostra cambiamenti nella fluorescenza in funzione del tempo, richiudere la base con gomma siliconica. La fluorescenza non viene osservata perché il periodo di incubazione dipende anche dalla proprietà del virus^23,24. Eseguire i passaggi 3.1-3.12 dopo un'ulteriore settimana. (Questo è facoltativo).
13. Tenere il miniscopio nella posizione ottimale e spostare il braccio stereotassico con un'argilla adesiva riutilizzabile verso il miniscopio (Figura 5B2). Far aderire il miniscopio al braccio stereotassico con argilla adesiva riutilizzabile.
14. Regolare leggermente i bracci x, y e z per cercare la visualizzazione migliore (video supplementare S2). Quindi, regolare l'angolo tra la superficie dell'obiettivo e l'obiettivo del relè ruotando la barra auricolare, la barra del dente o l'argilla adesiva riutilizzabile sull'asse z. L'espressione virale e l'impianto del cristallino hanno successo quando almeno una cellula mostra transitori di fluorescenza (Figura 6A; Video supplementare S2) durante il baseplating (che dipende anche dall'area del cervello, come il CA1).
    NOTA: se il monitor mostra solo globuli bianchi ma nessun transitorio, esiste un'altra causa (vedere la Figura 6B, C, Video supplementari S4,S5, la sezione Risultati e la sezione Risoluzione dei problemi).
15. Cementare la piastra di base (Figura 5B2) con il cemento dentale.
16. Monitorare la regione di interesse durante la cementazione per assicurarsi che la posizione ottimale non cambi.
17. Utilizzare la minor quantità possibile di cemento incollando saldamente la piastra di base sulla base di cemento dentale (Figura 5B2). Applicare un secondo e un terzo strato di cemento attorno alla piastra di base, ma fare attenzione a non influenzare la lente GRIN.
    NOTA: L'applicazione del cemento alla piastra di base è più semplice in questa fase poiché la base della piastra di base è stata formata durante la procedura di placcatura fittizia.
18. Staccare con attenzione il miniscopio dalla piastra di base quando il cemento è indurito. Quindi, avvitare un cappuccio protettivo.
19. Sposta l'animale in una gabbia di recupero. Guarda l'animale fino a quando non riacquista sufficiente coscienza per mantenere la recumenza sternale.
20. Topi domestici individualmente. Assicurati che stia mangiando, bevendo e defecando normalmente ogni giorno. Attendere 5 giorni affinché il mouse si riprenda completamente e quindi controllare l'imaging del calcio.
    NOTA: C'è solo una piccola quantità di cemento dentale che tiene la piastra di base. Pertanto, se la piastra di base si è spostata considerevolmente dalla procedura di baseplating, rimuovere il cemento dentale con un trapano eseguire nuovamente la procedura di baseplating.
21. Anestetizzare (mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina (87 mg/kg) / xilazina (13 mg/kg)) e perfondere²⁵ l'animale quando tutti gli esperimenti sono fatti.

Risultati

Valutazione dell'alterazione del volume del cemento dentale
Poiché il volume del cemento dentale cambia durante il processo di polimerizzazione, può influire in modo significativo sulla qualità dell'immagine, dato che la distanza di lavoro di una lente GRIN è di circa 50-350 μm ^4,8. Pertanto, in questo caso sono stati testati due cementi dentali disponibili in commercio, Tempron e Tokuso, prima della procedura di impianto e di baseplating...

Discussione

Il presente rapporto descrive un protocollo sperimentale dettagliato per i ricercatori che utilizzano il sistema Miniscope UCLA a due lenti. Gli strumenti progettati nel nostro protocollo sono relativamente convenienti per qualsiasi laboratorio che desideri provare l'imaging del calcio in vivo . Alcuni protocolli, come l'iniezione virale, l'impianto di lenti, il baseplating fittizio e il baseplating, potrebbero anche essere utilizzati per altre versioni del sistema miniscope per migliorare il tasso di successo d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7-mm drill bit	#19008-07	Fine Science Tools; USA	for surgery
0.1–10 μl pipette tips	104-Q; QSP	Fisher Scientific; Singapore	for testing dental cement
20 G IV cathater	#SR-OX2032CA	Terumo Corporation; Tokyo, Japan	for surgery
27 G needle	AGANI, AN*2713R	Terumo Corporation; Tokyo, Japan	for surgery
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE	#104487-AAV9; 1.5*10^13	Addgene viral prep; MA, USA	for viral injection
Atropine sulfate		Astart; Hsinchu, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Baseplate	V3	http://miniscope.org	for dummy baseplating/baseplating
BLU TACK	#30840350	Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA	Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating
Bone Rongeur Friedman	13 cm	Diener; Tuttlingen, Germany	for baseplating
Buprenorphine		INDIVIOR; UK	for surgery
Carprofen	Rimadyl	Zoetis; Exton, PA	analgesia
Ceftazidime		Taiwan Biotech; Taiwan	prevent infection
Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope	purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq		for baseplating
Dental cement set	Tempron	GC Corp; Tokyo, Japan	for testing dental cement
Dental cement set	Tokuso Curefast	Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan	for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating
Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors	#51673	Stoelting Co; Illinois, USA	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Duratear ointment		Alcon; Geneva, Switzerland	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Ibuprofen		YungShin; Taiwan	analgesia
Isoflurane		Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Inscopix	nVista System	Inscopix; Palo Alto, CA	for comparison with V3 UCLA Miniscope
Ketamine		Pfizer; NY, NY	for euthanasia
Normal saline			for surgery
Micro bulldog clamps	#12.102.04	Dimedo; Tuttlingen, Germany	for lens implantation
Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge	#88400	Hamilton; Bonaduz, Switzerland	for viral injection
Molding silicone rubber	ZA22 Thixo	Zhermack; Badia Polesine, Italy	for dummy baseplating
Objective Gradient index (GRIN) lens	#64519	Edmund Optics; NJ, USA	for dummy baseplating/baseplating
Parafilm	#PM996	Bemis; Neenah, USA	for dummy baseplating
Portable Suction	#DF-750	Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan	for surgery
Relay GRIN lens	#1050-002177	Inscopix; Palo Alto, CA, USA	for dummy baseplating/baseplating
Stainless steel anchor screws	1.00 mm diameter, total length 3.00 mm		for surgery
Stereo microscope	#SL720	Sage Vison; New Taipei City, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Stereotaxic apparatus	#51673	Stoelting; IL, USA	for surgery/dummy baseplating/baseplating
UV Cure Adhesive	#3321	Loctite; Düsseldorf, Germany	for testing dental cement
V3 UCLA Miniscope	purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components		for surgery/dummy baseplating/baseplating
Xylazine	X1126	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	for euthanasia
Xylocaine pump spray 10%		AstraZeneca; Södertälje, Sweden	for surgery