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この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

硬化中の歯科用セメントの収縮は、ベースプレートを変位させます。このプロトコルは、ベースプレートをセメントで固めるスペースを残す歯科用セメントの初期基礎を作成することにより、問題を最小限に抑えます。数週間後、ベースプレートは、ほとんど新しいセメントを使用してこの足場の所定の位置にセメントで固定できるため、収縮が減少します。

要約

神経科学者は、小型顕微鏡(ミニスコープ)を使用して、自由に行動する動物の神経活動を観察します。カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)のミニスコープチームは、研究者が自分でミニスコープを構築するためのオープンリソースを提供しています。V3 UCLAミニスコープは、現在使用されている最も人気のあるオープンソースミニスコープの1つです。表在皮質に埋め込まれた対物レンズ(1レンズシステム)を介して遺伝子組み換えニューロンから放出される蛍光トランジェントのイメージング、または脳深部に埋め込まれたリレーレンズとミニスコープに事前に固定された対物レンズの組み合わせ(2レンズシステム)を介して、脳深部領域のイメージングを可能にします。最適な条件下(ニューロンが蛍光インジケーターを発現し、リレーレンズが適切に埋め込まれている場合)でも、セメント硬化時にベースプレートと頭蓋骨への付着との間の歯科用セメントの体積変化により、対物レンズとリレーレンズの間の距離が変化してずれ、画質が低下する可能性があります。ベースプレートは、ミニスコープを頭蓋骨に取り付け、対物レンズとリレーレンズの間の作動距離を固定するのに役立つプレートです。したがって、ベースプレートの周りの歯科用セメントの体積の変化は、レンズ間の距離を変化させる。本プロトコルは、歯科用セメントの体積変化によって引き起こされるミスアライメントの問題を最小限に抑えることを目的としています。このプロトコルは、リレーレンズの埋め込み中に歯科用セメントの初期基礎を構築することにより、ミスアライメントを低減します。移植後の回復時間は、歯科用セメントの基礎がベースプレートを完全に硬化させるのに十分であるため、できるだけ少ない新しいセメントを使用して、ベースプレートをこの足場にセメントで固定できます。本稿では、ミニスコープに固定された対物レンズで神経活動のイメージングを可能にするマウスのベースプレーティング戦略について説明します。

概要

蛍光活性レポーターは、感度が高く、ダイナミックレンジが大きいため、ニューロン活動のイメージングに最適です1,2,3。そのため、蛍光顕微鏡を使用して神経活動を直接観察する実験が増えています1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、<....

プロトコル

この研究で実施されたすべての手順は、国立台湾大学動物管理使用委員会によって承認されました(承認番号:NTU-109-EL-00029および NTU-108-EL-00158)。

1. 歯科用セメントの体積変化の評価

注意: 歯科用セメントの量の変化は、硬化プロセス中に発生します。移植とベースメッキの前に、歯科用セメントの体積変化をテストします。研究者は、あらゆるブランドの歯科用セメントをテストし、体積変化が最も少ないブランドを使用して地板をセメントで固めることができます。 図 3 に例を示します。

  1. 各歯科用セメント粉末0.5 gを計量し、適切な溶液(1 mL)と混合します。
    注意: 歯科用セメントの説明書で推奨される粉末/液体の比率は、固体の形を得るために0.5 gの粉末と0.25 mLの溶液です。この試験プロトコルは、ピペットチップの容量変化を測定するために混合物を液体の形で吸引できるように、比率を0.5 g/mLに希釈します。
  2. 0.1〜10 μLのピペットチップを使用して2.5 μLの歯科用セメント混合物を除去し、次にピペットチップを光硬化型接着剤で密封します。
  3. チップをラックに置き、歯科用セメント混合物の最上位レベル....

結果

歯科用セメントの体積変化の評価
歯科用セメントの体積は硬化プロセス中に変化するため、GRINレンズの作動距離が約50〜350μmであることを考えると、画像品質に大きな影響を与える可能性があります4,8。したがって、この場合、移植および下地めっき手順の前に、2つの市販の歯科用セメント、テンプロンとトクソがテストされまし?.......

ディスカッション

本報告では、2レンズUCLAミニスコープシステムを使用する研究者向けの詳細な実験プロトコルについて説明します。私たちのプロトコルで設計されたツールは、 in vivo カルシウムイメージングを試したい研究室にとって比較的手頃な価格です。ウイルス注入、レンズ埋め込み、ダミーベースメッキ、ベースメッキなどの一部のプロトコルは、カルシウムイメージングの成功率を向上さ?.......

開示事項

これは業界が支援する研究ではありません。著者らは、金銭的利益相反は報告していない。

謝辞

この作業は、台湾科学技術部(108-2320-B-002 -074、109-2320-B-002-023-MY2)の支援を受けました。

....

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.7-mm drill bit #19008-07Fine Science Tools; USAfor surgery
0.1–10 μl pipette tips104-Q; QSPFisher Scientific; Singaporefor testing dental cement
20 G IV cathater#SR-OX2032CATerumo Corporation; Tokyo, Japanfor surgery
27 G needleAGANI, AN*2713RTerumo Corporation; Tokyo, Japanfor surgery
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE#104487-AAV9; 1.5*10^13Addgene viral prep; MA, USAfor viral injection
Atropine sulfateAstart; Hsinchu, Taiwanfor surgery/dummy baseplating/baseplating
BaseplateV3http://miniscope.orgfor dummy baseplating/baseplating
BLU TACK#30840350Bostik; Chelsea, Massachusetts, USAReusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating
Bone Rongeur Friedman13 cmDiener; Tuttlingen, Germanyfor baseplating
BuprenorphineINDIVIOR; UKfor surgery
CarprofenRimadylZoetis; Exton, PAanalgesia
CeftazidimeTaiwan Biotech; Taiwanprevent infection
Data Acquisition PCB for UCLA Miniscopepurchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daqfor baseplating
Dental cement setTempronGC Corp; Tokyo, Japanfor testing dental cement
Dental cement setTokuso CurefastTokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japanfor testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating
Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors#51673Stoelting Co; Illinois, USAfor surgery/dummy baseplating/baseplating
Duratear ointmentAlcon; Geneva, Switzerlandfor surgery/dummy baseplating/baseplating
IbuprofenYungShin; Taiwananalgesia
IsofluranePanion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwanfor surgery/dummy baseplating/baseplating
InscopixnVista SystemInscopix; Palo Alto, CAfor comparison with V3 UCLA Miniscope
KetaminePfizer; NY, NYfor euthanasia
Normal salinefor surgery
Micro bulldog clamps#12.102.04Dimedo; Tuttlingen, Germanyfor lens implantation
Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge#88400Hamilton; Bonaduz, Switzerlandfor viral injection
Molding silicone rubberZA22 ThixoZhermack; Badia Polesine, Italyfor dummy baseplating
Objective Gradient index (GRIN) lens#64519Edmund Optics; NJ, USAfor dummy baseplating/baseplating
Parafilm#PM996Bemis; Neenah, USAfor dummy baseplating
Portable Suction#DF-750Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwanfor surgery
Relay GRIN lens#1050-002177Inscopix; Palo Alto, CA, USAfor dummy baseplating/baseplating
Stainless steel anchor screws1.00 mm diameter, total length 3.00 mmfor surgery
Stereo microscope#SL720Sage Vison; New Taipei City, Taiwanfor surgery/dummy baseplating/baseplating
Stereotaxic apparatus#51673Stoelting; IL, USAfor surgery/dummy baseplating/baseplating
UV Cure Adhesive#3321Loctite; Düsseldorf, Germanyfor testing dental cement
V3 UCLA Miniscopepurchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-componentsfor surgery/dummy baseplating/baseplating
XylazineX1126Sigma-Aldrich; St. Louis, MOfor euthanasia
Xylocaine pump spray 10%AstraZeneca; Södertälje, Swedenfor surgery

参考文献

  1. Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
  2. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons.

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