Uso de placas base y un miniscopio preanclado con una lente objetiva para la investigación transitoria de calcio en ratones

Resumen

La contracción del cemento dental durante el curado desplaza la placa base. Este protocolo minimiza el problema al crear una base inicial del cemento dental que deja espacio para cementar la placa base. Semanas más tarde, la placa base se puede cementar en posición en este andamio con poco cemento nuevo, reduciendo así la contracción.

Resumen

Los neurocientíficos usan microscopios en miniatura (miniscopios) para observar la actividad neuronal en animales que se comportan libremente. El equipo de Miniscopios de la Universidad de California, Los Ángeles (UCLA) proporciona recursos abiertos para que los investigadores construyan miniscopios ellos mismos. El V3 UCLA Miniscope es uno de los miniscopios de código abierto más populares actualmente en uso. Permite obtener imágenes de los transitorios de fluorescencia emitidos por neuronas modificadas genéticamente a través de una lente objetiva implantada en la corteza superficial (un sistema de una lente), o en áreas cerebrales profundas a través de una combinación de una lente de relé implantada en el cerebro profundo y una lente objetiva que está preanclada en el miniscopio para observar la imagen transmitida (un sistema de dos lentes). Incluso en condiciones óptimas (cuando las neuronas expresan indicadores de fluorescencia y la lente del relé se ha implantado correctamente), un cambio de volumen del cemento dental entre la placa base y su unión al cráneo tras el curado con cemento puede causar una desalineación con una distancia alterada entre el objetivo y las lentes del relé, lo que resulta en una mala calidad de imagen. Una placa base es una placa que ayuda a montar el miniscopio en el cráneo y fija la distancia de trabajo entre el objetivo y las lentes del relé. Por lo tanto, los cambios en el volumen del cemento dental alrededor de la placa base alteran la distancia entre las lentes. El presente protocolo tiene como objetivo minimizar el problema de desalineación causado por los cambios de volumen en el cemento dental. El protocolo reduce la desalineación mediante la construcción de una base inicial de cemento dental durante la implantación de lentes de relé. El tiempo de convalecencia después de la implantación es suficiente para que la base del cemento dental cure completamente la placa base, por lo que la placa base se puede cementar en este andamio utilizando la menor cantidad de cemento nuevo posible. En el presente artículo, describimos estrategias para el recubrimiento de base en ratones para permitir la obtención de imágenes de la actividad neuronal con una lente objetiva anclada en el miniscopio.

Introducción

Los reporteros de actividad fluorescente son ideales para obtener imágenes de la actividad neuronal porque son sensibles y tienen grandes rangos dinámicos ^1,2,3. Por lo tanto, un número creciente de experimentos están utilizando microscopía de fluorescencia para observar directamente la actividad neuronal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ^....

Protocolo

Todos los procedimientos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Nacional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Taiwán (Nº de aprobación: NTU-109-EL-00029 y NTU-108-EL-00158).

1. Evaluación de la alteración volumétrica del cemento dental

NOTA: Los cambios en el volumen de cemento dental ocurren durante el proceso de curado. Pruebe los cambios de volumen del cemento dental antes de la implantación y el revestimiento base. Los investigadores pueden probar cualquier marca de cemento dental y usar la marca con el cambio de volumen más bajo para cementa....

Resultados

Evaluación de la alteración del volumen de cemento dental
Dado que el volumen del cemento dental cambia durante el proceso de curado, puede afectar significativamente la calidad de la imagen, dado que la distancia de trabajo de una lente GRIN es de aproximadamente 50 a 350 μm ^4,8. Por lo tanto, se probaron dos cementos dentales disponibles comercialmente en este caso, Tempron y Tokuso, antes del procedimiento de implantación y recubrimient.......

Discusión

El presente informe describe un protocolo experimental detallado para los investigadores que utilizan el sistema de miniscopio UCLA de dos lentes. Las herramientas diseñadas en nuestro protocolo son relativamente asequibles para cualquier laboratorio que desee probar imágenes de calcio in vivo . Algunos protocolos, como la inyección viral, la implantación de lentes, el recubrimiento base ficticio y el recubrimiento base, también podrían usarse para otras versiones del sistema de miniscopio para mejorar la .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7-mm drill bit	#19008-07	Fine Science Tools; USA	for surgery
0.1–10 μl pipette tips	104-Q; QSP	Fisher Scientific; Singapore	for testing dental cement
20 G IV cathater	#SR-OX2032CA	Terumo Corporation; Tokyo, Japan	for surgery
27 G needle	AGANI, AN*2713R	Terumo Corporation; Tokyo, Japan	for surgery
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE	#104487-AAV9; 1.5*10^13	Addgene viral prep; MA, USA	for viral injection
Atropine sulfate		Astart; Hsinchu, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Baseplate	V3	http://miniscope.org	for dummy baseplating/baseplating
BLU TACK	#30840350	Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA	Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating
Bone Rongeur Friedman	13 cm	Diener; Tuttlingen, Germany	for baseplating
Buprenorphine		INDIVIOR; UK	for surgery
Carprofen	Rimadyl	Zoetis; Exton, PA	analgesia
Ceftazidime		Taiwan Biotech; Taiwan	prevent infection
Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope	purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq		for baseplating
Dental cement set	Tempron	GC Corp; Tokyo, Japan	for testing dental cement
Dental cement set	Tokuso Curefast	Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan	for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating
Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors	#51673	Stoelting Co; Illinois, USA	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Duratear ointment		Alcon; Geneva, Switzerland	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Ibuprofen		YungShin; Taiwan	analgesia
Isoflurane		Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Inscopix	nVista System	Inscopix; Palo Alto, CA	for comparison with V3 UCLA Miniscope
Ketamine		Pfizer; NY, NY	for euthanasia
Normal saline			for surgery
Micro bulldog clamps	#12.102.04	Dimedo; Tuttlingen, Germany	for lens implantation
Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge	#88400	Hamilton; Bonaduz, Switzerland	for viral injection
Molding silicone rubber	ZA22 Thixo	Zhermack; Badia Polesine, Italy	for dummy baseplating
Objective Gradient index (GRIN) lens	#64519	Edmund Optics; NJ, USA	for dummy baseplating/baseplating
Parafilm	#PM996	Bemis; Neenah, USA	for dummy baseplating
Portable Suction	#DF-750	Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan	for surgery
Relay GRIN lens	#1050-002177	Inscopix; Palo Alto, CA, USA	for dummy baseplating/baseplating
Stainless steel anchor screws	1.00 mm diameter, total length 3.00 mm		for surgery
Stereo microscope	#SL720	Sage Vison; New Taipei City, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Stereotaxic apparatus	#51673	Stoelting; IL, USA	for surgery/dummy baseplating/baseplating
UV Cure Adhesive	#3321	Loctite; Düsseldorf, Germany	for testing dental cement
V3 UCLA Miniscope	purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components		for surgery/dummy baseplating/baseplating
Xylazine	X1126	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	for euthanasia
Xylocaine pump spray 10%		AstraZeneca; Södertälje, Sweden	for surgery