Utilisation d’un baseplatage et d’un miniscope préancré avec une lentille objective pour la recherche transitoire de calcium chez la souris

Résumé

Le retrait du ciment dentaire pendant le durcissement déplace la plaque de base. Ce protocole minimise le problème en créant une fondation initiale du ciment dentaire qui laisse de l’espace pour cimenter la plaque de base. Quelques semaines plus tard, la plaque de base peut être cimentée en position sur cet échafaudage en utilisant peu de ciment neuf, réduisant ainsi le retrait.

Résumé

Les neuroscientifiques utilisent des microscopes miniatures (miniscopes) pour observer l’activité neuronale chez les animaux qui se comportent librement. L’équipe Miniscope de l’Université de Californie à Los Angeles (UCLA) fournit des ressources ouvertes aux chercheurs pour construire eux-mêmes des miniscopes. Le V3 UCLA Miniscope est l’un des miniscopes open-source les plus populaires actuellement utilisés. Il permet l’imagerie des transitoires de fluorescence émis par les neurones génétiquement modifiés à travers une lentille objective implantée sur le cortex superficiel (un système à une lentille), ou dans les zones profondes du cerveau grâce à une combinaison d’une lentille relais implantée dans le cerveau profond et d’une lentille objectif qui est préancrée dans le miniscope pour observer l’image relayée (un système à deux lentilles). Même dans des conditions optimales (lorsque les neurones expriment des indicateurs de fluorescence et que la lentille relais a été correctement implantée), un changement de volume du ciment dentaire entre la plaque de base et sa fixation au crâne lors du durcissement du ciment peut provoquer un désalignement avec une distance altérée entre l’objectif et les lentilles relais, entraînant une mauvaise qualité d’image. Une plaque de base est une plaque qui aide à monter le miniscope sur le crâne et fixe la distance de travail entre l’objectif et les lentilles de relais. Ainsi, les changements de volume du ciment dentaire autour de la plaque de base modifient la distance entre les lentilles. Le présent protocole vise à minimiser le problème de désalignement causé par les changements de volume dans le ciment dentaire. Le protocole réduit le désalignement en construisant une fondation initiale en ciment dentaire lors de l’implantation de lentilles relais. Le temps de convalescence après l’implantation est suffisant pour que la fondation du ciment dentaire durcisse complètement la plaque de base, de sorte que la plaque de base peut être cimentée sur cet échafaudage en utilisant le moins de ciment neuf possible. Dans le présent article, nous décrivons des stratégies de baseplatage chez la souris pour permettre l’imagerie de l’activité neuronale avec une lentille objective ancrée dans le miniscope.

Introduction

Les rapporteurs d’activité fluorescents sont idéaux pour l’imagerie de l’activité neuronale car ils sont sensibles et ont de grandes plages dynamiques ^1,2,3. Par conséquent, un nombre croissant d’expériences utilisent la microscopie à fluorescence pour observer directement l’activité neuronale 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ^,16. Le premier microscope à fluorescence monophotonique miniaturisé (miniscope) a été conçu en 2011 par Mark Schnitzer et ^al.5. Ce miniscope permet aux chercheurs de surveiller la dynamique de fluorescence des cellules cérébelleuses chez les animaux^qui se comportent librement 5 (c’est-à-dire sans aucune contrainte physique, appuie-tête, sédation ou anesthésie pour les animaux). Actuellement, la technique peut être appliquée pour surveiller les zones superficielles du cerveau telles que le cortex 6,8,15,16; zones sous-corticales telles que l’hippocampe dorsal 8,11,13,14 et le striatum ^6,17; et les zones profondes du cerveau telles que l’hippocampe ventral 14, l’amygdale 10,18 et l’hypothalamus ^8,12.

Ces dernières années, plusieurs miniscopes open-source ont été développés^{4,5,6,7,11,13,17,19}. Le miniscope peut être assemblé économiquement par les chercheurs s’ils suivent les directives étape par étape fournies par l’équipe Miniscope de l’Université de Californie à Los Angeles (UCLA).^4,7,11,13. Parce que la surveillance optique de l’activité neuronale est limitée par les limites de la transmission de la lumière⁷ vers et depuis la population neuronale d’intérêt, un miniscope a été conçu qui nécessite qu’une lentille d’indice de réfraction de gradient objectif (GRIN) (ou lentille objectif) soit préancrée au bas du miniscope pour agrandir le champ de vision relayé par une lentille GRIN relais (ou lentille relais)^{6,7,8,10,16,17}. Cette lentille relais est implantée dans la région cérébrale cible de sorte que l’activité de fluorescence de la région cérébrale cible est relayée sur la surface de la lentille relais^{6,7,8,10,16,17}. Environ 1/4 d’une période sinusoïdale complète de lumière traverse la lentille GRIN objective (~ 0,25 hauteur) (Graphique 1A1), ce qui donne une image de fluorescence agrandie^6,7. La lentille de l’objectif n’est pas toujours fixée au bas du miniscope et l’implantation de la lentille relais n’est pas nécessaire^6,7,11,13,15. Plus précisément, il existe deux configurations: une avec une lentille d’objectif fixe dans le miniscope et une lentille relais implantée dans le cerveau^{8,10,12,14,16} (Graphique 1B1) et un autre avec juste une lentille d’objectif amovible^6,7,11,13,15 (Figure 1B2). Dans la conception basée sur la combinaison de lentilles relais à objectif fixe et implantées, les signaux de fluorescence du cerveau sont amenés à la surface supérieure de la lentille relais (Graphique 1A1)^{7,8,10,12,14,16}. Par la suite, la lentille de l’objectif peut agrandir et transmettre le champ visuel à partir de la surface supérieure de la lentille relais (Graphique 1A2). D’autre part, la conception de la lentille GRIN objectif amovible est plus flexible, ce qui signifie que la préimplantation d’une lentille relais dans le cerveau n’est pas obligatoire (Figure 1B2)^6,7,11,13,15. Lors de l’utilisation d’un miniscope basé sur une conception de lentille d’objectif amovible, les chercheurs doivent toujours implanter une lentille dans la région du cerveau cible, mais ils peuvent implanter une lentille d’objectif.^6,7,11,13,15 ou une lentille relais dans le cerveau^6,7. Le choix d’un objectif ou d’une lentille relais pour l’implantation détermine la configuration du miniscope que le chercheur doit utiliser. Par exemple, le V3 UCLA Miniscope est basé sur une conception d’objectif amovible GRIN. Les chercheurs peuvent choisir d’implanter directement une lentille d’objectif dans la région cérébrale d’intérêt et de monter le miniscope « vide » sur la lentille de l’objectif.^6,7,11,13,15 (un système à une seule lentille; Figure 1B2) ou d’implanter une lentille relais dans le cerveau et de monter un miniscope préancré avec une lentille objective^6,7 (un système à deux lentilles; Graphique 1B1). Le miniscope fonctionne ensuite comme une caméra à fluorescence pour capturer des images en direct de la fluorescence neuronale produite par un indicateur de calcium génétiquement codé^1,2,3. Une fois le miniscope connecté à un ordinateur, ces images de fluorescence peuvent être transférées sur l’ordinateur et enregistrées sous forme de clips vidéo. Les chercheurs peuvent étudier l’activité neuronale en analysant les changements relatifs de fluorescence avec certains progiciels d’analyse^20,21 ou écrire leurs codes pour une analyse future.

Le V3 UCLA Miniscope offre aux utilisateurs la flexibilité nécessaire pour déterminer s’ils doivent imager l’activité neuronale avec un système à une ou deux lentilles⁷. Le choix du système d’enregistrement est basé sur la profondeur et la taille de la zone cérébrale cible. En bref, un système à objectif unique ne peut imager qu’une zone superficielle (moins de 2,5 mm de profondeur environ) et relativement grande (plus grande qu’environ 1,8 x 1,8 mm²) parce que les fabricants ne produisent qu’une certaine taille de lentille d’objectif. En revanche, un système à deux lentilles peut être appliqué à n’importe quelle zone cérébrale cible. Cependant, le ciment dentaire pour coller la plaque de base a tendance à provoquer un désalignement avec une distance altérée entre l’objectif et les lentilles relais, ce qui entraîne une mauvaise qualité d’image. Si le système à deux lentilles est utilisé, deux distances de travail doivent être ciblées avec précision pour obtenir une qualité d’image optimale (Figure 1A). Ces deux distances de travail critiques se situent entre les neurones et la surface inférieure de la lentille relais, et entre la surface supérieure de la lentille relais et la surface inférieure de la lentille de l’objectif (Figure 1A1). Tout désalignement ou mauvais placement de la lentille en dehors de la distance de travail entraîne une défaillance de l’imagerie (Figure 1C2). En revanche, le système à objectif unique ne nécessite qu’une seule distance de travail précise. Cependant, la taille de la lentille de l’objectif limite son application pour la surveillance des régions profondes du cerveau (la lentille d’objectif qui s’adapte au miniscope est d’environ 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Par conséquent, l’implantation d’une lentille objective est limitée pour l’observation de la surface et de régions cérébrales relativement grandes, telles que le cortex 6,15 et le cornu ammonis dorsal 1 (CA1) chez la souris^[11,13]. De plus, une grande surface du cortex doit être aspirée pour cibler le CA1 dorsal^11,13. En raison de la limitation de la configuration à une lentille qui empêche l’imagerie des régions profondes du cerveau, les systèmes de miniscopes commerciaux n’offrent qu’une conception combinée objectif / lentille relais (deux lentilles). D’autre part, le miniscope V3 UCLA peut être modifié en un système à une ou deux lentilles car son objectif est amovible 6,11,13,15. En d’autres termes, les utilisateurs de miniscopes V3 UCLA peuvent tirer parti de la lentille amovible en l’implantant dans le cerveau (création d’un système à une lentille), lors d’expériences impliquant des observations cérébrales superficielles (moins de 2,5 mm de profondeur), ou en la préancrant dans le miniscope et en implantant une lentille relais dans le cerveau (création d’un système à deux lentilles), lors de la réalisation d’expériences impliquant des observations cérébrales profondes. Le système à deux lentilles peut également être appliqué pour observer superficiellement le cerveau, mais le chercheur doit connaître les distances de travail précises entre la lentille de l’objectif et la lentille relais. Le principal avantage du système à une lentille est qu’il y a moins de chances de manquer les distances de travail qu’avec un système à deux lentilles, étant donné que deux distances de travail doivent être ciblées avec précision pour obtenir une qualité d’image optimale dans le système à deux lentilles (Figure 1A). Par conséquent, nous recommandons d’utiliser un système à une lentille pour les observations superficielles du cerveau. Cependant, si l’expérience nécessite une imagerie dans la zone profonde du cerveau, le chercheur doit apprendre à éviter le désalignement des deux lentilles.

Le protocole de base pour la configuration à deux lentilles des miniscopes pour les expériences comprend l’implantation de lentilles et le placage de base 8,10,16,17. Le placage de base consiste à coller une plaque de base sur la tête d’un animal afin que le miniscope puisse éventuellement être monté sur le dessus de l’animal et filmer les signaux de fluorescence des neurones (Figure 1B). Cette procédure consiste à utiliser du ciment dentaire pour coller la plaque de base sur le crâne (Figure 1C), mais le retrait du ciment dentaire peut provoquer des changements inacceptables dans la distance entre la lentille relais implantée et la lentille objectif ^8,17. Si la distance décalée entre les deux lentilles est trop grande, les cellules ne peuvent pas être mises au point.

Des protocoles détaillés pour des expériences d’imagerie calcique cérébrale profonde utilisant des miniscopes ont déjà été publiés^8,10,16,17. Les auteurs de ces protocoles ont utilisé le système Inscopix^8,10,16 ou d’autres conceptions personnalisées¹⁷ et ont décrit les procédures expérimentales pour la sélection virale, la chirurgie et la fixation de la plaque de base. Cependant, leurs protocoles ne peuvent pas être appliqués avec précision à d’autres systèmes open source, tels que le système V3 UCLA Miniscope, NINscope⁶, et Finchscope¹⁹. Un désalignement des deux lentilles peut se produire pendant l’enregistrement dans une configuration à deux lentilles avec un miniscope UCLA en raison du type de ciment dentaire utilisé pour cimenter la plaque de base au crâne^8,17 (Graphique 1C). Le protocole actuel est nécessaire parce que la distance entre la lentille relais implantée et la lentille objectif est susceptible de se déplacer en raison du retrait indésirable du ciment dentaire pendant la procédure de baseplatage. Pendant le placage, la distance de travail optimale entre la lentille relais implantée et la lentille de l’objectif doit être trouvée en ajustant la distance entre le miniscope et le haut de la lentille relais, et la plaque de base doit ensuite être collée à cet endroit idéal. Une fois la distance correcte entre la lentille de l’objectif et la lentille relais implantée est définie, des mesures longitudinales peuvent être obtenues à la résolution cellulaire (Graphique 1B; in vivo enregistrement). Étant donné que la plage optimale de distances de travail d’une lentille relais est faible (50 - 350 μm)^4,8, un retrait excessif du ciment pendant le durcissement peut rendre difficile le maintien de la lentille de l’objectif et de la lentille relais implantée dans la plage appropriée. L’objectif global de ce rapport est de fournir un protocole pour réduire les problèmes de retrait^8,17 qui se produisent pendant la procédure de baseplatage et pour augmenter le taux de réussite des enregistrements miniscopiques de signaux de fluorescence dans une configuration à deux lentilles. L’enregistrement réussi d’un miniscope est défini comme l’enregistrement d’un flux en direct de changements relatifs notables dans la fluorescence de neurones individuels chez un animal qui se comporte librement. Bien que différentes marques de ciment dentaire aient des taux de retrait différents, les chercheurs peuvent sélectionner une marque qui a déjà été testée.^{6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22}. Cependant, toutes les marques ne sont pas faciles à obtenir dans certains pays / régions en raison des réglementations d’importation pour les matériaux médicaux. Par conséquent, nous avons développé des méthodes pour tester les taux de retrait des ciments dentaires disponibles et, surtout, fournir un protocole alternatif qui minimise le problème de retrait. L’avantage par rapport au protocole actuel de baseplatage est une augmentation du taux de réussite de l’imagerie calcique avec des outils et du ciment qui peuvent être facilement obtenus dans les laboratoires. Le miniscope UCLA est utilisé comme exemple, mais le protocole est également applicable à d’autres miniscopes. Dans ce rapport, nous décrivons une procédure de baseplacage optimisée et recommandons également certaines stratégies pour l’installation du système à deux lentilles miniscope de l’UCLA (Graphique 2A). Des exemples d’implantation réussie (n = 3 souris) et des exemples d’implantation ratée (n = 2 souris) pour la configuration à deux lentilles avec le miniscope UCLA sont présentés avec les discussions sur les raisons des succès et des échecs.

Protocole

Toutes les procédures effectuées dans cette étude ont été approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université nationale de Taïwan (numéro d’approbation : NTU-109-EL-00029 et NTU-108-EL-00158).

1. Évaluation de l’altération volumique du ciment dentaire

REMARQUE: Des changements dans le volume de ciment dentaire se produisent pendant le processus de durcissement. Testez les changements de volume du ciment dentaire avant l’implantation et le placage de base. Les chercheurs peuvent tester n’importe quelle marque de ciment dentaire et utiliser la marque avec le changement de volume le plus faible pour cimenter la plaque de base. Un exemple est présenté à la figure 3.

1. Peser 0,5 g de chaque poudre de ciment dentaire et la mélanger avec sa solution appropriée (1 mL).
   NOTE: Le rapport poudre/liquide recommandé dans les instructions sur le ciment dentaire est de 0,5 g de poudre pour 0,25 mL de solution pour obtenir une forme solide. Ce protocole d’essai dilue le rapport à 0,5 g/mL afin que le mélange puisse être aspiré sous forme liquide afin de mesurer le changement de volume dans les pointes des pipettes.
2. Utilisez des embouts de pipette de 0,1 à 10 μL pour retirer 2,5 μL du mélange de ciment dentaire, puis scellez l’embout de la pipette avec une colle à photopolymérisation.
3. Placez les pointes sur une grille, marquez les niveaux les plus élevés du mélange de ciment dentaire et mesurez le niveau du mélange de ciment dentaire après 40 min (vidéo supplémentaire S1).
4. En plus de surveiller les changements de niveau pendant le durcissement du ciment dentaire dans les pointes, mesurez la densité de ciment dentaire sèche restante. Pour calculer la densité, mesurez le poids du ciment dentaire et mesurez le volume avec le principe d’Archimède.
   1. En bref, placez le ciment dentaire sec restant dans une tasse remplie d’eau et pesez l’eau qui déborde.
5. Utilisez le ciment dentaire avec le moins de retrait pour tous les protocoles détaillés ci-dessous.

2. Anesthésie, implantation chirurgicale, injection virale et baseplatage factice

1. Anesthésie
   NOTE: Le présent rapport vise à optimiser la procédure de chirurgie et de baseplating pour le miniscope UCLA; Par conséquent, on a supposé que le titre viral optimal pour infecter les régions cérébrales cibles était connu. Les méthodes pour trouver le titre viral optimal peuvent être trouvées dans les étapes 1 à 5 de Resendez et al.⁸. Une fois la dilution virale optimisée, l’implantation chirurgicale peut être initiée.
   1. Placez la souris dans un récipient à induction et fournissez de l’oxygène (100% à un débit d’air de 0,2 L / min). Préoxygéner la souris pendant 5 à 10 min.
   2. Administrer 5 % d’isoflurane mélangé à 100 % d’oxygène (débit d’air : 0,2 L/min) jusqu’à ce que la souris commence à perdre l’équilibre et soit éventuellement anesthésiée.
   3. Retirer la souris de la chambre d’induction et injecter de l’atropine (0,04 mg/kg ; injection sous-cutanée), pour éviter l’accumulation de salive et de buprénorphine (0,03 mg/kg ; injection sous-cutanée) comme analgésique.
   4. Rasez la tête de la souris.
   5. Portez un masque, une blouse stérile et des gants. Préparez un espace stérile et des instruments chirurgicaux stériles pour la chirurgie. Stabiliser la tête de la souris (maintenir l’anesthésie avec 3 à 2,5% d’isoflurane pendant cette étape) sur l’appareil stéréotaxique. Après les procédures analgésiques et anesthésiques, assurez-vous que les barres auriculaires stabilisent solidement la tête. Fournir un support thermique.
   6. Assurez-vous que la tête est mise en position droite, stérilisez la tête rasée avec de la bétadine, puis vaporisez la tête avec de la xylocaïne (10%), un analgésique local.
   7. Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse.
      REMARQUE: Utilisez une pommade ophtalmique pour la protection des yeux pendant tous les événements anesthésiques afin de prévenir les blessures oculaires.
   8. Testez le réflexe douloureux profond de l’animal en pinçant sa patte postérieure. Une fois que l’animal ne montre aucun réflexe de retrait de la patte, procédez à des interventions chirurgicales.
   9. Faites une petite incision le long du plan médio-sagittal du crâne (à partir d’environ 2 mm avant le bregma et se terminant à environ 6 mm en arrière du bregma). Ensuite, nettoyez le tissu conjonctif sur le crâne et ancrez trois vis en acier inoxydable sur les os frontaux et interpariétaux gauches.
      1. À ce stade, réduisez l’isoflurane à 1-2%. Surveillez la fréquence respiratoire pendant toute la procédure chirurgicale. Si le rythme respiratoire est trop lent (environ 1/s, selon l’animal), diminuer la concentration d’isoflurane.
   10. Effectuer une craniotomie pour l’implantation de la lentille relais sous un microscope chirurgical ou un stéréomicroscope à l’aide d’une fraise de 0,7 mm de diamètre. Utilisez une microperceuse pour saisir le foret de bavure et dessinez un contour de la zone du cercle prévue (toute l’épaisseur du calvarium n’a pas besoin d’être pénétrée).
       NOTE: La lentille relais utilisée dans le présent protocole avait un diamètre de 1,0 mm, une longueur ~ 9,0 mm un pas de 1 et une plage de distance de travail de ~100 μm - 300 μm; Par conséquent, la craniotomie avait un diamètre de 1,2 mm.
       1. Approfondissez doucement le contour jusqu’à ce que la dure-mère soit exposée.
       2. Préparez 3 mL de solution saline stérile dans une seringue de 3 mL et refroidissez-la dans un seau à glace. Rincez fréquemment la zone exposée avec 0,1 mL de solution saline de la seringue pour refroidir la zone et prévenir les dommages causés par la chaleur et les hémorragies.
   11. Cueillez et décollez légèrement la dure-mère avec une aiguille 27G.
   12. Placez une marque sur une aiguille émoussée de 27 G à 1 mm de l’extrémité et utilisez-la pour aspirer soigneusement le cortex cérébral afin de créer une fenêtre pour l’implantation du cristallin 8,11,13,17 (Figure 2B1). Si nécessaire, fabriquez une aiguille émoussée en broyant la pointe d’une aiguille d’injection de 27 G avec du papier de verre. Ensuite, connectez l’aiguille à une seringue, connectez la seringue à un tube et connectez le tube à une source d’aspiration pour créer un vide.
       REMARQUE: La lentille relais est émoussée et comprime le tissu cérébral lorsqu’elle est placée dans la zone profonde du cerveau. Ainsi, l’aspiration du cortex réduit les lésions tissulaires dues à l’implantation de lentilles relais. Le cortex a une épaisseur d’environ 1 mm chez la souris, mais il est difficile à visualiser au stéréomicroscope. La marque crée un repère pour permettre de déterminer la profondeur de l’aiguille plus précisément qu’avec un stéréomicroscope seul. De plus, on peut déterminer si la région du cortex a été atteinte ou passée en fonction de la résistance; La partie supérieure du cortex est relativement molle, tandis que la région sous-corticale est dense. Par conséquent, une fois que la texture commence à se sentir plus dense, arrêtez l’aspiration (Figure 2B3).
   13. Préparez 3 mL de solution saline stérile dans une seringue de 3 mL et refroidissez-la dans un seau à glace. Rincez la zone avec une solution saline pour arrêter le saignement et diminuer la possibilité d’œdème cérébral.
2. Injection de virus adéno-associé (AAV)
   NOTE: AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE a été utilisé dans la présente expérience. jGCaMP7s est un indicateur de calcium génétiquement codé qui émet une fluorescence verte³. Parce que la présente étude a utilisé une souris de type sauvage comme sujet, un vecteur viral était nécessaire pour transfecter les neurones avec le gène indicateur de calcium fluorescent vert et permettre l’expression. Les chercheurs utilisant des souris transgéniques exprimant l’indicateur de calcium fluorescent vert comme sujets peuvent sauter le protocole 2.2.
   1. Montez l’aiguille interne d’un cathéter intraveineux (i.v.) de 20 G sur le bras stéréotaxique et percez lentement (~100 - 200 μm/min) le cerveau aux coordonnées appropriées (les mêmes coordonnées utilisées lors de l’implantation de la lentille relais) (Figure 2B3).
   2. Abaisser l’aiguille de microinjection à une vitesse de 100-200 μm/min dans le CA1 ventral et infuser (~ 25 nL/min) 200 nL du vecteur viral dans la région cible (-3,16 mm AP, 3,25 mm ML et -3,50 mm DV du bregma).
   3. Attendez 10 minutes pour permettre au virus de se diffuser et minimiser le reflux.
   4. Retirer (~100-200 μm/min) l’aiguille de micro-injection.
3. Implantation de lentilles relais
   1. Désinfecter la lentille relais avec de l’alcool à 75%^10,16, puis rincer avec une solution saline sans pyrogènes. Trempez la lentille dans une solution saline froide sans pyrogène jusqu’à l’implantation.
      REMARQUE: Une lentille froide minimise l’œdème cérébral lorsqu’elle est placée dans le cerveau.
   2. Tenez la lentille relais à l’aide d’une pince microbulldog (figure 2B3) dont les dents ont été recouvertes d’un tube thermorétractable.
      REMARQUE: La pince bulldog peut maintenir fermement la lentille sans l’endommager. Se référer à Resendez et ^al.8 pour la méthode de fabrication de la pince bulldog recouverte de tubes.
   3. Placez lentement (~100 - 200 μm/min) la lentille relais au-dessus de la région cible (-3,16 mm AP, 3,50 mm ML et -3,50 mm DV à partir du bregma) et stabilisez-la avec du ciment dentaire.
4. Baseplatage factice
   REMARQUE: Le but du « baseplatage factice » pendant la chirurgie d’implantation est de créer une base de ciment dentaire afin de réduire la quantité de ciment dentaire qui doit être appliquée pendant la procédure de baseplatage réel plusieurs semaines plus tard. De cette manière, le risque d’une modification du volume du ciment dentaire est minimisé.
   1. Fixez la lentille de l’objectif au bas du miniscope et assemblez la plaque de base sur le miniscope (dans cette étape, l’assemblage de la lentille d’objectif ancrée, de la plaque de base et du miniscope n’a pas encore été placé sur le crâne de la souris).
   2. Enrouler 10 cm de pellicule de paraffine autour de l’extérieur de la plaque de base (figure 4A).
   3. Tenez le miniscope avec la sonde du bras stéréotaxique à l’aide d’argile adhésive réutilisable.
   4. Alignez l’objectif sur le dessus de la lentille relais avec le moins d’espace possible entre les lentilles (Figure 4B).
   5. Utilisez du ciment dentaire pour sécuriser le positionnement de la plaque de base (de sorte que le ciment ne touche que le film de paraffine).
   6. Lorsque le ciment dentaire a séché, retirez le film.
   7. Retirez la plaque de base et le miniscope. La base de ciment dentaire est creuse (figure 4B).
   8. Pour protéger la lentille relais des activités quotidiennes et des rayures de la souris, scellez la lentille relais avec du caoutchouc de silicone moulé jusqu’à ce que la lentille relais soit recouverte, et couvrez le caoutchouc de silicone avec une fine couche de ciment dentaire (Figure 4B).
   9. Dégagez la souris des instruments stéréotaxiques et placez-la dans une chambre de récupération.
   10. Injecter du carprofène (5 mg/kg; injection sous-cutanée) ou du méloxicam (1 mg/kg; injection sous-cutanée) pour l’analgésie et de la ceftazidime (25 mg / kg; injection sous-cutanée) pour prévenir l’infection.
       NOTE: L’utilisation d’antibiotiques n’est pas une alternative à une technique aseptique. Les antibiotiques périopératoires (c.-à-d. la ceftazidime) peuvent être indiqués dans certaines circonstances, comme les chirurgies de longue durée ou la pose d’implants chroniques.
   11. Observez l’animal jusqu’à ce qu’il retrouve suffisamment de conscience pour maintenir une position couchée sternale.
   12. Domestiquer les souris individuellement et injecter du méloxicam (1 mg / kg; injection sous-cutanée; toutes les 24h) pendant une semaine pour soulager la douleur post-chirurgicale. Vérifiez l’animal tous les jours après la chirurgie pour vous assurer qu’il mange, boit et défèque normalement.
   13. Effectuez le placage de base après 3 semaines ou plus.

3. Revêtement de base

REMARQUE : Habituellement, la procédure de baseplating (Figure 5) ne peut pas être effectuée dans les 2 à 3 semaines suivant la procédure initiale en raison du temps de récupération et d’incubation virale. Les procédures d’induction pour le placage de base sont semblables à celles décrites aux étapes 2.1.1 à 2.1.8. Cependant, le placage de base n’est pas une procédure invasive et l’animal ne nécessite qu’une légère sédation. Par conséquent, 0,8-1,2% d’isoflurane est suffisant, tant que l’animal ne peut pas se déplacer sur le cadre stéréotaxique. De plus, une anesthésie à l’isoflurane relativement légère peut également aider à faciliter l’expression des transitoires de fluorescence des neurones lors de la surveillance⁸ (vidéo supplémentaire S2).

1. Coupez soigneusement la fine couche du toit en ciment dentaire avec un rongeur en os et retirez le caoutchouc de silicone. Nettoyez la surface de la lentille relais avec de l’alcool à 75 %.
2. Fixez une vis à côté de la plaque de base pour la fixer au bas du miniscope (figure 5A1).
   REMARQUE: La plaque de base doit être serrée solidement sous le bas du miniscope car la différence entre une plaque de base serrée et légèrement fixée peut entraîner une distance incohérente.
3. Réglez la lame de mise au point pour qu’elle se trouve à environ 2,7 à 3 mm du boîtier principal (Figure 5A2).
   REMARQUE: Bien que la longueur puisse être ajustée davantage pendant la procédure de base, fixez-la à environ 2,7 mm, car ajuster simultanément la longueur du miniscope et la longueur optimale entre la lentille relais implantée et la lentille d’objectif préancrée est très déroutant.
4. Connectez le miniscope à la carte d’acquisition de données et branchez-le sur un port USB 3.0 (ou version supérieure) d’un ordinateur.
5. Exécutez le logiciel d’acquisition de données développé par l’équipe UCLA.
6. Ajustez l’exposition à 255, le gain à 64x et la LED d’excitation à 5%. Ces réglages sont recommandés pour le placage initial ; Les paramètres spécifiques varieront en fonction des régions du cerveau et des niveaux d’expression de l’indicateur de calcium génétiquement codé.
7. Cliquez sur le bouton Connecter pour connecter le miniscope au logiciel d’acquisition de données et regarder le livestream.
8. Alignez manuellement la lentille de l’objectif du miniscope sur la lentille relais et commencez à rechercher les signaux de fluorescence (Figure 5B₁).
   REMARQUE: Au départ, la recherche manuelle du signal de fluorescence facilite les réglages. Étant donné qu’un système AAV a été utilisé pour exprimer l’indicateur de calcium génétiquement codé, le type promoteur et le sérotype AAV ont affecté l’efficacité de la transfection^23,24. Les chercheurs devraient avoir besoin de vérifier l’expression de l’indicateur de calcium en trouvant des neurones individuels qui montrent des changements de fluorescence avant de procéder à de futures expériences.
9. Percez le ciment dentaire à n’importe quel endroit où il bloque le miniscope (facultatif).
10. Regardez le flux en direct du logiciel d’acquisition de données et utilisez la marge de la lentille relais comme point de repère (vidéo supplémentaire S2). La marge de la lentille relais apparaît sous la forme d’un cercle gris semblable à une lune sur le moniteur (Figure 5B1 ; flèches blanches).
11. Une fois la lentille de relais trouvée, ajustez soigneusement les différents angles et distances du miniscope jusqu’à ce que les signaux de fluorescence soient trouvés.
    REMARQUE: Les images des neurones sont plus blanches que l’arrière-plan. Une forme neuronale précise indique que les neurones se trouvent parfaitement sur le plan focal de la lentille relais. Les neurones ronds suggèrent qu’ils étaient près du plan focal. La forme neuronale est différente à travers le cerveau, ici le CA1 ventral est montré à titre d’exemple.
12. Si aucun neurone individuel ne présente de changements de fluorescence en fonction du temps, refermez la base avec du caoutchouc de silicone. La fluorescence n’est pas observée car la période d’incubation dépend également de la propriété du virus^23,24. Effectuez les étapes 3.1 à 3.12 après une semaine supplémentaire. (Ceci est facultatif).
13. Tenez le miniscope dans la position optimale et déplacez le bras stéréotaxique avec une pâte adhésive réutilisable vers le miniscope (Figure 5B2). Collez le miniscope au bras stéréotaxique avec de la pâte adhésive réutilisable.
14. Ajustez légèrement les bras x, y et z pour rechercher la meilleure vue (vidéo supplémentaire S2). Ensuite, réglez l’angle entre la surface de l’objectif et la lentille relais en tournant la barre d’oreille, la barre dentaire ou l’argile adhésive réutilisable sur l’axe z. L’expression virale et l’implantation de lentilles réussissent lorsqu’au moins une cellule présente des transitoires de fluorescence (Figure 6A; Vidéo supplémentaire S2) pendant le placage de base (qui dépend également de la zone du cerveau, comme le CA1).
    REMARQUE : Si le moniteur affiche uniquement des globules blancs mais pas de transitoires, il existe une autre cause (voir Figure 6B, C, Vidéos supplémentaires S4, S5, la section Résultats et la section de dépannage).
15. Cimenter la plaque de base (figure 5B2) avec le ciment dentaire.
16. Surveillez la région d’intérêt pendant la cimentation pour vous assurer que la position optimale ne change pas.
17. Utilisez la plus petite quantité possible de ciment tout en collant fermement la plaque de base sur la base de ciment dentaire (figure 5B2). Appliquez une deuxième et une troisième couche de ciment autour de la plaque de base, mais veillez à ne pas affecter la lentille GRIN.
    REMARQUE: L’application de ciment sur la plaque de base est plus facile à cette étape puisque la base de la plaque de base a été formée pendant la procédure de placage factice.
18. Détachez soigneusement le miniscope de la plaque de base lorsque le ciment est durci. Ensuite, vissez un capuchon de protection.
19. Déplacez l’animal dans une cage de récupération. Observez l’animal jusqu’à ce qu’il retrouve suffisamment de conscience pour maintenir une position couchée sternale.
20. Souris domestiques individuellement. Assurez-vous qu’il mange, boit et défèque normalement tous les jours. Attendez 5 jours pour que la souris se rétablisse complètement, puis vérifiez l’imagerie calcique.
    REMARQUE: Il n’y a qu’une petite quantité de ciment dentaire qui maintient la plaque de base. Par conséquent, si la plaque de base s’est considérablement déplacée depuis la procédure de baseplatage, retirez le ciment dentaire avec une perceuse et effectuez à nouveau la procédure de baseplatage.
21. Anesthésier (par injection intrapéritonéale d’un mélange kétamine (87 mg/kg)/xylazine (13 mg/kg)) et perfuser²⁵ l’animal lorsque toutes les expériences sont terminées.

Résultats

Évaluation de l’altération du volume du ciment dentaire
Étant donné que le volume de ciment dentaire change au cours du processus de durcissement, cela peut avoir un impact significatif sur la qualité de l’imagerie, étant donné que la distance de travail d’une lentille GRIN est d’environ 50 à 350 μm ^4,8. Par conséquent, deux ciments dentaires disponibles dans le commerce ont été testés dans ce cas, Tempron et Tokuso, avant...

Discussion

Le présent rapport décrit un protocole expérimental détaillé pour les chercheurs utilisant le système Miniscope UCLA à deux lentilles. Les outils conçus dans notre protocole sont relativement abordables pour tout laboratoire qui souhaite essayer l’imagerie calcique in vivo . Certains protocoles, tels que l’injection virale, l’implantation de lentilles, le baseplating factice et le baseplating, pourraient également être utilisés pour d’autres versions du système miniscope afin d’améliorer l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7-mm drill bit	#19008-07	Fine Science Tools; USA	for surgery
0.1–10 μl pipette tips	104-Q; QSP	Fisher Scientific; Singapore	for testing dental cement
20 G IV cathater	#SR-OX2032CA	Terumo Corporation; Tokyo, Japan	for surgery
27 G needle	AGANI, AN*2713R	Terumo Corporation; Tokyo, Japan	for surgery
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE	#104487-AAV9; 1.5*10^13	Addgene viral prep; MA, USA	for viral injection
Atropine sulfate		Astart; Hsinchu, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Baseplate	V3	http://miniscope.org	for dummy baseplating/baseplating
BLU TACK	#30840350	Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA	Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating
Bone Rongeur Friedman	13 cm	Diener; Tuttlingen, Germany	for baseplating
Buprenorphine		INDIVIOR; UK	for surgery
Carprofen	Rimadyl	Zoetis; Exton, PA	analgesia
Ceftazidime		Taiwan Biotech; Taiwan	prevent infection
Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope	purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq		for baseplating
Dental cement set	Tempron	GC Corp; Tokyo, Japan	for testing dental cement
Dental cement set	Tokuso Curefast	Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan	for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating
Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors	#51673	Stoelting Co; Illinois, USA	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Duratear ointment		Alcon; Geneva, Switzerland	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Ibuprofen		YungShin; Taiwan	analgesia
Isoflurane		Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Inscopix	nVista System	Inscopix; Palo Alto, CA	for comparison with V3 UCLA Miniscope
Ketamine		Pfizer; NY, NY	for euthanasia
Normal saline			for surgery
Micro bulldog clamps	#12.102.04	Dimedo; Tuttlingen, Germany	for lens implantation
Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge	#88400	Hamilton; Bonaduz, Switzerland	for viral injection
Molding silicone rubber	ZA22 Thixo	Zhermack; Badia Polesine, Italy	for dummy baseplating
Objective Gradient index (GRIN) lens	#64519	Edmund Optics; NJ, USA	for dummy baseplating/baseplating
Parafilm	#PM996	Bemis; Neenah, USA	for dummy baseplating
Portable Suction	#DF-750	Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan	for surgery
Relay GRIN lens	#1050-002177	Inscopix; Palo Alto, CA, USA	for dummy baseplating/baseplating
Stainless steel anchor screws	1.00 mm diameter, total length 3.00 mm		for surgery
Stereo microscope	#SL720	Sage Vison; New Taipei City, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Stereotaxic apparatus	#51673	Stoelting; IL, USA	for surgery/dummy baseplating/baseplating
UV Cure Adhesive	#3321	Loctite; Düsseldorf, Germany	for testing dental cement
V3 UCLA Miniscope	purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components		for surgery/dummy baseplating/baseplating
Xylazine	X1126	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	for euthanasia
Xylocaine pump spray 10%		AstraZeneca; Södertälje, Sweden	for surgery