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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Durch das Schrumpfen von Zahnzement während der Aushärtung wird die Grundplatte verdrängt. Dieses Protokoll minimiert das Problem, indem es ein erstes Fundament des Zahnzements schafft, das Platz für die Zementierung der Grundplatte lässt. Wochen später kann die Bodenplatte mit wenig neuem Zement auf diesem Gerüst zementiert werden, wodurch die Schwindung reduziert wird.

Zusammenfassung

Neurowissenschaftler verwenden Miniaturmikroskope (Miniskope), um die neuronale Aktivität in frei agierenden Tieren zu beobachten. Das Miniscope-Team der University of California, Los Angeles (UCLA) stellt Forschern offene Ressourcen zur Verfügung, mit denen sie Miniskope selbst bauen können. Das V3 UCLA Miniscope ist eines der beliebtesten Open-Source-Miniskope, die derzeit im Einsatz sind. Es ermöglicht die Bildgebung der Fluoreszenztransienten, die von genetisch veränderten Neuronen emittiert werden, durch eine Objektivlinse, die in den oberflächlichen Kortex implantiert wird (ein Ein-Linsen-System), oder in tiefen Hirnbereichen durch eine Kombination aus einer Relaislinse, die in das tiefe Gehirn implantiert wird, und einer Objektivlinse, die im Miniskop vorverankert ist, um das weitergeleitete Bild zu beobachten (ein Zwei-Linsen-System). Selbst unter optimalen Bedingungen (wenn Neuronen Fluoreszenzindikatoren exprimieren und die Relaislinse ordnungsgemäß implantiert wurde) kann eine Volumenänderung des Zahnzements zwischen der Grundplatte und ihrer Befestigung am Schädel bei der Zementhärtung zu einer Fehlausrichtung mit einem veränderten Abstand zwischen Objektiv und Relaislinse führen, was zu einer schlechten Bildqualität führt. Eine Grundplatte ist eine Platte, die hilft, das Miniskop auf dem Schädel zu befestigen und den Arbeitsabstand zwischen dem Objektiv und dem Relaisobjektiv zu fixieren. So verändern Änderungen des Volumens des Zahnzements um die Grundplatte herum den Abstand zwischen den Linsen. Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, das Problem der Fehlausrichtung, das durch Volumenänderungen im Zahnzement verursacht wird, zu minimieren. Das Protokoll reduziert die Fehlausrichtung, indem es während der Implantation der Relaislinse ein erstes Fundament aus Zahnzement bildet. Die Rekonvaleszenzzeit nach der Implantation reicht aus, damit das Fundament aus Zahnzement die Grundplatte vollständig aushärten kann, so dass die Grundplatte mit möglichst wenig neuem Zement auf diesem Gerüst zementiert werden kann. Im vorliegenden Artikel beschreiben wir Strategien für die Baseplattierung bei Mäusen, um die Abbildung der neuronalen Aktivität mit einer im Miniskop verankerten Objektivlinse zu ermöglichen.

Einleitung

Fluoreszierende Aktivitätsreporter sind ideal für die Bildgebung der neuronalen Aktivität, da sie empfindlich sind und große Dynamikbereiche 1,2,3 haben. Daher wird in immer mehr Experimenten die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die neuronale Aktivitätdirekt zu beobachten 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. Das erste miniaturisierte Ein-Photonen-Fluoreszenzmikroskop (Miniskop) wurde 2011 von Mark Schnitzer et al.5 entwickelt. Dieses Miniskop ermöglicht es den Forschern, die Fluoreszenzdynamik von Kleinhirnzellen in sich frei verhaltenden Tieren5 zu überwachen (d.h. ohne physische Fesselung, Kopfstütze, Sedierung oder Anästhesie der Tiere). Derzeit kann die Technik angewendet werden, um oberflächliche Hirnareale wie den Cortex 6,8,15,16 zu überwachen; subkortikale Bereiche wie der dorsale Hippocampus 8,11,13,14 und Striatum 6,17; und tiefe Hirnareale wie der ventrale Hippocampus 14, die Amygdala 10,18 und der Hypothalamus 8,12.

In den letzten Jahren wurden mehrere Open-Source-Miniskope entwickelt4,5,6,7,11,13,17,19. Das Miniskop kann von Forschern kostengünstig zusammengebaut werden, wenn sie die Schritt-für-Schritt-Richtlinien des Miniscope-Teams der University of California, Los Angeles (UCLA) befolgen4,7,11,13. Weil die optische Überwachung der neuronalen Aktivität durch die Grenzen der Lichtdurchlässigkeit eingeschränkt ist7 Zu und von der interessierenden neuronalen Population wurde ein Miniskop entwickelt, bei dem eine GRIN-Linse (oder Objektivlinse) mit objektivem Gradientenbrechungsindex (oder Objektiv) an der Unterseite des Miniskops vorverankert werden muss, um das Sichtfeld zu vergrößern, das von einer Relais-GRIN-Linse (oder Relaislinse) weitergeleitet wird6,7,8,10,16,17. Diese Relaislinse wird in die Zielhirnregion implantiert, so dass die Fluoreszenzaktivität der Zielhirnregion auf die Oberfläche der Relaislinse übertragen wird6,7,8,10,16,17. Ungefähr 1/4 einer vollen sinusförmigen Lichtperiode wandert durch das GRIN-Objektiv (~ 0,25 Tonhöhe) (Abbildung 1A1), was zu einem vergrößerten Fluoreszenzbild führt6,7. Das Objektiv ist nicht immer an der Unterseite des Miniskops befestigt und die Implantation der Relaislinse ist nicht immer notwendig6,7,11,13,15. Konkret gibt es zwei Konfigurationen: eine mit einem festen Objektiv im Miniskop und eine Relaislinse, die in das Gehirn implantiert wird8,10,12,14,16 (Abbildung 1B1) und eine weitere mit nur einem abnehmbaren Objektiv6,7,11,13,15 (Abbildung 1B2). In dem Design, das auf der Kombination aus festem Objektiv und implantierter Relaislinse basiert, werden die Fluoreszenzsignale aus dem Gehirn auf die Oberseite der Relaislinse gebracht (Abbildung 1A1)7,8,10,12,14,16. Anschließend kann die Objektivlinse das Gesichtsfeld von der Oberseite der Relaislinse (Abbildung 1A2). Auf der anderen Seite ist das Design der abnehmbaren GRIN-Objektivlinse flexibler, was bedeutet, dass die Präimplantation einer Relaislinse in das Gehirn nicht zwingend erforderlich ist (Abbildung 1B2)6,7,11,13,15. Bei der Verwendung eines Miniskops, das auf einem abnehmbaren Objektivdesign basiert, müssen die Forscher immer noch eine Linse in die Zielregion des Gehirns implantieren, aber sie können entweder eine Objektivlinse implantieren6,7,11,13,15 oder eine Relaislinse im Gehirn6,7. Die Wahl eines Objektivs oder einer Relaislinse für die Implantation bestimmt die Miniskop-Konfiguration, die der Forscher verwenden muss. Zum Beispiel basiert das V3 UCLA Miniscope auf einem abnehmbaren GRIN-Objektivdesign. Die Forscher können entweder eine Objektivlinse direkt in die interessierende Hirnregion implantieren und das "leere" Miniskop auf das Objektiv montieren6,7,11,13,15 (ein Ein-Linsen-System; Abbildung 1B2) oder um eine Relaislinse in das Gehirn zu implantieren und ein Miniskop zu montieren, das mit einer Objektivlinse vorverankert ist6,7 (ein System mit zwei Linsen; Abbildung 1B1). Das Miniskop arbeitet dann als Fluoreszenzkamera, um Livestream-Bilder der neuronalen Fluoreszenz aufzunehmen, die von einem genetisch kodierten Kalziumindikator erzeugt wird1,2,3. Nachdem das Miniskop an einen Computer angeschlossen wurde, können diese Fluoreszenzbilder auf den Computer übertragen und als Videoclips gespeichert werden. Forscher können die neuronale Aktivität untersuchen, indem sie die relativen Veränderungen der Fluoreszenz mit einigen Analysepaketen analysieren20,21 Oder schreiben Sie ihre Codes für zukünftige Analysen.

Das V3 UCLA Miniscope bietet Anwendern die Flexibilität, zu entscheiden, ob die neuronale Aktivität mit einem Ein- oder Zweilinsensystem abgebildet werden soll7. Die Wahl des Aufzeichnungssystems richtet sich nach der Tiefe und Größe des Zielhirnbereichs. Kurz gesagt, ein Ein-Linsen-System kann nur einen Bereich abbilden, der oberflächlich (weniger als ca. ca. 2,5 mm tief) und relativ groß (größer als ca. 1,8 x 1,8 mm2) ist, da die Hersteller nur eine bestimmte Größe des Objektivs herstellen. Im Gegensatz dazu kann ein Zwei-Linsen-System auf jedes Zielgebiet des Gehirns angewendet werden. Der Zahnzement zum Verkleben der Grundplatte neigt jedoch dazu, bei einem veränderten Abstand zwischen Objektiv und Relaislinse zu einer Fehlausrichtung zu führen, was zu einer schlechten Bildqualität führt. Wenn das Zwei-Linsen-System verwendet wird, müssen zwei Arbeitsabstände genau ausgerichtet werden, um die optimale Abbildungsqualität zu erzielen (Abbildung 1A). Diese beiden kritischen Arbeitsabstände befinden sich zwischen den Neuronen und der unteren Oberfläche der Relaislinse sowie zwischen der Oberseite der Relaislinse und der Unterseite der Objektivlinse (Abbildung 1A1). Jede Fehlausrichtung oder falsche Platzierung des Objektivs außerhalb des Arbeitsabstands führt zu einem Abbildungsfehler (Abbildung 1C2). Im Gegensatz dazu benötigt das Ein-Linsen-System nur einen präzisen Arbeitsabstand. Die Größe des Objektivs begrenzt jedoch seine Anwendung für die Überwachung von tiefen Hirnregionen (das Objektiv, das zum Miniskop passt, ist ungefähr 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Daher ist die Implantation einer Objektivlinse für die Beobachtung der Oberfläche und relativ großer Hirnregionen, wie z.B. des Cortex6,15 und der dorsalen Cornu ammonis 1 (CA1) bei Mäusen11,13 begrenzt. Darüber hinaus muss ein großer Bereich des Kortex abgesaugt werden, um das dorsale CA111,13 anzugreifen. Aufgrund der Einschränkung der Ein-Linsen-Konfiguration, die die Bildgebung tiefer Hirnregionen verhindert, bieten kommerzielle Miniskop-Systeme nur ein kombiniertes Objektiv-/Relaisobjektiv-Design (Zwei-Linsen-Design). Auf der anderen Seite kann das V3 UCLA Miniskop entweder in ein Ein- oder Zwei-Linsen-System umgewandelt werden, da das Objektiv abnehmbar ist 6,11,13,15. Mit anderen Worten, V3 UCLA Miniskop-Benutzer können die abnehmbare Linse nutzen, indem sie sie in das Gehirn implantieren (wodurch ein Ein-Linsen-System entsteht), wenn sie Experimente mit oberflächlichen Gehirnbeobachtungen (weniger als 2,5 mm Tiefe) durchführen oder indem sie sie im Miniskop vorverankern und eine Relaislinse in das Gehirn implantieren (wodurch ein Zwei-Linsen-System entsteht). bei der Durchführung von Experimenten mit Tiefenhirnbeobachtungen. Das Zwei-Linsen-System kann auch für die oberflächliche Beobachtung des Gehirns verwendet werden, aber der Forscher muss die genauen Arbeitsabstände zwischen der Objektivlinse und der Relaislinse kennen. Der Hauptvorteil des Ein-Linsen-Systems besteht darin, dass die Wahrscheinlichkeit, dass die Arbeitsabstände verfehlt werden, geringer ist als bei einem Zwei-Linsen-System, da zwei Arbeitsabstände genau ausgerichtet werden müssen, um eine optimale Abbildungsqualität im Zwei-Linsen-System zu erzielen (Abbildung 1A). Daher empfehlen wir die Verwendung eines Ein-Linsen-Systems für oberflächliche Gehirnbeobachtungen. Wenn das Experiment jedoch eine Bildgebung im Bereich des tiefen Gehirns erfordert, muss der Forscher lernen, eine Fehlausrichtung der beiden Linsen zu vermeiden.

Das Basisprotokoll für die Zwei-Linsen-Konfiguration von Miniskopen für Experimente umfasst die Linsenimplantation und die Baseplattierung 8,10,16,17. Baseplating ist das Aufkleben einer Grundplatte auf den Kopf eines Tieres, so dass das Miniskop schließlich auf dem Tier montiert werden kann und die Fluoreszenzsignale von Neuronen auf Video aufzeichnen kann (Abbildung 1B). Bei diesem Verfahren wird die Grundplatte mit Zahnzement auf den Schädel geklebt (Abbildung 1C), aber das Schrumpfen des Zahnzements kann zu inakzeptablen Veränderungen des Abstands zwischen der implantierten Relaislinse und der Objektivlinseführen 8,17. Ist der verschobene Abstand zwischen den beiden Linsen zu groß, können Zellen nicht scharf gestellt werden.

Detaillierte Protokolle für Experimente zur Calcium-Bildgebung im tiefen Gehirn mit Miniskopen wurden bereits veröffentlicht8,10,16,17. Die Autoren dieser Protokolle haben das Inscopix-System verwendet8,10,16 oder andere kundenspezifische Designs17 und haben die experimentellen Verfahren für die Virusselektion, die Chirurgie und die Grundplattenbefestigung beschrieben. Ihre Protokolle können jedoch nicht präzise auf andere Open-Source-Systeme angewendet werden, wie z. B. das V3 UCLA Miniscope-System, NINscope6und Finchscope19. Eine Fehlausrichtung der beiden Linsen kann während der Aufnahme in einer Zwei-Linsen-Konfiguration mit einem UCLA Miniscope aufgrund der Art des Zahnzements, der verwendet wird, um die Grundplatte mit dem Schädel zu zementieren, auftreten8,17 (Abbildung 1C). Das vorliegende Protokoll ist erforderlich, da der Abstand zwischen der implantierten Relaislinse und der Objektivlinse aufgrund der unerwünschten Schrumpfung von Zahnzement während des Baseplating-Verfahrens anfällig für Verschiebungen ist. Während der Grundierung muss der optimale Arbeitsabstand zwischen der implantierten Relaislinse und der Objektivlinse gefunden werden, indem der Abstand zwischen dem Miniskop und der Oberseite der Relaislinse eingestellt wird, und die Grundplatte sollte dann an dieser idealen Stelle verklebt werden. Nachdem der richtige Abstand zwischen der Objektivlinse und der implantierten Relaislinse eingestellt wurde, können Längsmessungen mit zellulärer Auflösung (Abbildung 1B; in vivo Aufzeichnung). Da der optimale Arbeitsabstand eines Relaisobjektivs klein ist (50 - 350 μm)4,8kann es schwierig sein, das Objektiv und die implantierte Relaislinse im richtigen Bereich zu halten. Das übergeordnete Ziel dieses Berichts ist es, ein Protokoll zur Verringerung der Schrumpfungsprobleme bereitzustellen8,17 die während des Baseplating-Verfahrens auftreten und die Erfolgsrate von Miniscope-Aufnahmen von Fluoreszenzsignalen in einer Zwei-Linsen-Konfiguration erhöhen. Eine erfolgreiche Miniskop-Aufzeichnung ist definiert als die Aufzeichnung eines Livestreams von auffälligen relativen Veränderungen in der Fluoreszenz einzelner Neuronen in einem sich frei verhaltenden Tier. Obwohl verschiedene Marken von Dentzement unterschiedliche Schrumpfungsraten haben, können Forscher eine Marke auswählen, die zuvor getestet wurde6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. Allerdings ist nicht jede Marke in einigen Ländern/Regionen aufgrund der Einfuhrbestimmungen für medizinische Materialien leicht zu erhalten. Daher haben wir Methoden entwickelt, um die Schrumpfraten verfügbarer Zahnzemente zu testen und vor allem ein alternatives Protokoll bereitzustellen, das das Schrumpfungsproblem minimiert. Der Vorteil gegenüber dem derzeitigen Baseplating-Protokoll ist eine Erhöhung der Erfolgsrate der Calcium-Bildgebung mit Werkzeugen und Zement, die in Laboratorien leicht gewonnen werden können. Das UCLA-Miniskop wird als Beispiel verwendet, aber das Protokoll ist auch auf andere Miniskope anwendbar. In diesem Bericht beschreiben wir ein optimiertes Baseplating-Verfahren und empfehlen auch einige Strategien für den Einbau des UCLA Miniskop-Zweilinsensystems (Abbildung 2A). Sowohl Beispiele für erfolgreiche Implantation (n=3 Mäuse) als auch Beispiele für fehlgeschlagene Implantation (n=2 Mäuse) für die Zwei-Linsen-Konfiguration mit dem UCLA-Miniskop werden vorgestellt und die Gründe für die Erfolge und Misserfolge diskutiert.

Protokoll

Alle in dieser Studie durchgeführten Verfahren wurden vom National Taiwan University Animal Care and Use Committee genehmigt (Zulassungsnummer: NTU-109-EL-00029 und NTU-108-EL-00158).

1. Beurteilung der Volumenveränderung von Zahnzement

HINWEIS: Änderungen des Volumens von Zahnzement treten während des Aushärtungsprozesses auf. Testen Sie die Volumenänderungen von Zahnzement vor der Implantation und Baseplattierung. Forscher können jede Marke von Dentzement testen und die Marke mit der geringsten Volumenänderung verwenden, um die Grundplatte zu zementieren. Ein Beispiel ist in Abbildung 3 dargestellt.

  1. Von jedem Zahnzementpulver werden 0,5 g abgewogen und mit der entsprechenden Lösung (1 ml) gemischt.
    HINWEIS: Das empfohlene Pulver / Flüssigkeit-Verhältnis in der Zahnzementanleitung beträgt 0,5 g Pulver auf 0,25 ml der Lösung, um eine feste Form zu erhalten. Dieses Testprotokoll verdünnt das Verhältnis auf 0,5 g/ml, so dass das Gemisch in flüssiger Form abgesaugt werden kann, um die Volumenänderung in den Pipettenspitzen zu messen.
  2. Verwenden Sie 0,1-10 μL Pipettenspitzen, um 2,5 μL der Zahnzementmischung zu entfernen, und versiegeln Sie dann die Pipettenspitze mit einem leicht härtenden Kleber.
  3. Legen Sie die Spitzen auf ein Gestell, markieren Sie die obersten Ebenen der Dentzement und messen Sie den Füllstand der Dentzement nach 40 min (Ergänzungsvideo S1).
  4. Messen Sie zusätzlich zur Überwachung der Füllstandsänderungen während der Zahnzementaushärtung in den Spitzen die verbleibende trockene Zahnzementdichte. Um die Dichte zu berechnen, messen Sie das Gewicht des Zahnzements und messen Sie das Volumen mit dem Archimedischen Prinzip.
    1. Kurz gesagt, legen Sie den verbleibenden trockenen Zahnzement in eine mit Wasser gefüllte Tasse und wiegen Sie das Wasser, das überläuft.
  5. Verwenden Sie den Zahnzement mit der geringsten Schrumpfung für alle unten aufgeführten Protokolle.

2. Anästhesie, chirurgische Implantation, Virusinjektion und Dummy-Baseplattierung

  1. Anästhesie
    HINWEIS: Der vorliegende Bericht zielt darauf ab, das Operations- und Baseplating-Verfahren für das UCLA-Miniskop zu optimieren. Daher ging man davon aus, dass der optimale Virustiter für die Infektion der Zielhirnregionen bekannt ist. Die Methoden, um den optimalen viralen Titer zu finden, finden sich in den Schritten 1 bis 5 von Resendez et al.8. Sobald die Virusverdünnung optimiert ist, kann die chirurgische Implantation eingeleitet werden.
    1. Legen Sie die Maus in einen Induktionsbehälter und geben Sie Sauerstoff (100% bei einem Luftdurchsatz von 0,2 l/min). Die Maus 5 bis 10 Minuten mit Sauerstoff versorgen.
    2. Verabreichen Sie 5 % Isofluran gemischt mit 100 % Sauerstoff (Luftvolumenstrom: 0,2 l/min), bis die Maus das Gleichgewicht verliert und schließlich betäubt wird.
    3. Nehmen Sie die Maus aus der Induktionskammer und injizieren Sie Atropin (0,04 mg/kg; subkutane Injektion), um die Ansammlung von Speichel und Buprenorphin (0,03 mg/kg; subkutane Injektion) als Analgetikum zu verhindern.
    4. Rasieren Sie den Kopf der Maus.
    5. Tragen Sie eine Maske, ein steriles Kleid und Handschuhe. Bereiten Sie einen sterilen Raum und sterile chirurgische Instrumente für die Operation vor. Stabilisieren Sie den Kopf der Maus (halten Sie die Anästhesie mit 3 bis 2,5% Isofluran während dieses Schritts aufrecht) auf dem stereotaktischen Apparat. Stellen Sie nach den analgetischen und anästhetischen Eingriffen sicher, dass die Ohrstangen den Kopf sicher stabilisieren. Bieten Sie thermische Unterstützung.
    6. Stellen Sie sicher, dass der Kopf in eine gerade Position gebracht wird, sterilisieren Sie den rasierten Kopf mit Betadin und sprühen Sie den Kopf dann mit Xylocain (10%), einem lokalen Analgetikum.
    7. Tragen Sie Veterinärsalbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern.
      HINWEIS: Verwenden Sie Augensalbe zum Augenschutz während aller Anästhesieereignisse, um Augenverletzungen zu vermeiden.
    8. Testen Sie den tiefen Schmerzreflex des Tieres, indem Sie seine Hinterpfote kneifen. Sobald das Tier keinen Pfotenrückzugsreflex zeigt, fahren Sie mit chirurgischen Eingriffen fort.
    9. Machen Sie einen kleinen Schnitt entlang der mittleren sagittalen Ebene des Schädels (beginnend von etwa 2 mm vor dem Bregma und endend etwa 6 mm hinter dem Bregma). Reinigen Sie dann das Bindegewebe am Schädel und verankern Sie drei Edelstahlschrauben an den linken Stirn- und Scheeinelbeinen.
      1. Reduzieren Sie an dieser Stelle das Isofluran auf 1-2%. Überwachen Sie die Atemfrequenz während des gesamten chirurgischen Eingriffs. Wenn die Atemfrequenz zu langsam ist (ca. 1/s, je nach Tier), verringern Sie die Isoflurankonzentration.
    10. Führen Sie eine Kraniotomie für die Relaislinsenimplantation unter einem Operationsmikroskop oder Stereomikroskop mit einem Gratbohrer mit einem Spitzendurchmesser von 0,7 mm durch. Greifen Sie mit einem Mikrobohrer nach dem Gratbohrer und zeichnen Sie einen Umriss der vorgesehenen Kreisfläche (die volle Dicke des Schädeldachs muss nicht durchdrungen werden).
      ANMERKUNG: Die im vorliegenden Protokoll verwendete Relaislinse hatte einen Durchmesser von 1,0 mm, eine Länge ~ 9,0 mm, einen Abstand von 1 und einen Arbeitsabstandsbereich von ~ 100 μm - 300 μm; Daher hatte die Kraniotomie einen Durchmesser von 1,2 mm.
      1. Vertiefen Sie vorsichtig den Umriss, bis die Dura freigelegt ist.
      2. Bereiten Sie 3 ml sterile Kochsalzlösung in einer 3-ml-Spritze vor und kühlen Sie sie in einem Eiskübel ab. Spülen Sie den exponierten Bereich häufig mit 0,1 ml Kochsalzlösung aus der Spritze, um den Bereich zu kühlen und Hitzeschäden und Blutungen zu vermeiden.
    11. Pflücken Sie die Dura leicht und ziehen Sie sie mit einer 27G-Nadel ab.
    12. Eine stumpfe 27-G-Nadel in einem Abstand von 1 mm von der Spitze wird markiert und mit dieser vorsichtig die Hirnrinde abgesaugt, um ein Fenster für die Linsenimplantationzu schaffen 8,11,13,17 (Abbildung 2B1). Machen Sie bei Bedarf eine stumpfe Nadel, indem Sie die Spitze einer 27-g-Injektionsnadel mit Schleifpapier abschleifen. Verbinden Sie dann die Nadel mit einer Spritze, verbinden Sie die Spritze mit einem Schlauch und verbinden Sie den Schlauch mit einer Saugquelle, um ein Vakuum zu erzeugen.
      HINWEIS: Die Relaislinse ist stumpf und komprimiert das Hirngewebe, wenn es in den tiefen Hirnbereich gelegt wird. So reduziert die Aspiration des Kortex die Gewebeschädigung durch die Implantation von Relaislinsen. Der Kortex ist bei Mäusen etwa 1 mm dick, aber unter einem Stereomikroskop schwer zu visualisieren. Die Markierung schafft eine Landmarke, mit der die Tiefe der Nadel genauer bestimmt werden kann als mit einem Stereomikroskop allein. Darüber hinaus kann man je nach Widerstand feststellen, ob die Kortexregion erreicht oder passiert wurde; Der obere Teil des Kortex fühlt sich relativ weich an, während sich die subkortikale Region dicht anfühlt. Sobald sich die Textur dichter anfühlt, stoppen Sie daher die Aspiration (Abbildung 2B3).
    13. Bereiten Sie 3 ml sterile Kochsalzlösung in einer 3-ml-Spritze vor und kühlen Sie sie in einem Eiskübel ab. Spülen Sie den Bereich mit Kochsalzlösung, um die Blutung zu stoppen und die Möglichkeit eines Hirnödems zu verringern.
  2. Adeno-assoziierte Virusinjektion (AAV)
    HINWEIS: AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE wurde im vorliegenden Experiment verwendet. jGCaMP7s ist ein genetisch kodierter Kalziumindikator, der grüne Fluoreszenz3 emittiert. Da die vorliegende Studie eine Wildtyp-Maus als Probanden verwendete, wurde ein viraler Vektor benötigt, um die Neuronen mit dem grün fluoreszierenden Kalzium-Indikatorgen zu transfizieren und die Expression zu ermöglichen. Forscher, die transgene Mäuse verwenden, die den grün fluoreszierenden Kalziumindikator als ihre Probanden exprimieren, können Protokoll 2.2 überspringen.
    1. Montieren Sie die innere Nadel eines 20 G intravenösen (i.v.) Katheters auf den stereotaktischen Arm und punktieren Sie das Gehirn langsam (~100 - 200 μm/min) an den entsprechenden Koordinaten (die gleichen Koordinaten, die bei der Implantation der Relaislinse verwendet werden) (Abbildung 2B3).
    2. Senken Sie die Mikroinjektionsnadel mit einer Geschwindigkeit von 100-200 μm/min in den ventralen CA1 und infundiert (~ 25 nL/min) 200 nL des viralen Vektors in die Zielregion (-3,16 mm AP, 3,25 mm ML und -3,50 mm DV aus dem Bregma).
    3. Warten Sie 10 Minuten, damit das Virus diffundieren kann und der Rückfluss minimiert wird.
    4. Ziehen Sie die Mikroinjektionsnadel (~100-200 μm/min) heraus.
  3. Implantation von Relaislinsen
    1. Desinfizieren Sie die Relaislinse mit 75% Alkohol10,16 und spülen Sie sie anschließend mit pyrogenfreier Kochsalzlösung ab. Weichen Sie die Linse bis zur Implantation in kalter, pyrogenfreier Kochsalzlösung ein.
      HINWEIS: Eine kalte Linse minimiert Hirnödeme, wenn sie in das Gehirn eingesetzt werden.
    2. Halten Sie die Relaislinse mit einer Mikro-Bulldoggenklemme (Abbildung 2B3) fest, deren Zähne mit Schrumpfschläuchen abgedeckt sind.
      HINWEIS: Die Bulldoggenklemme kann das Objektiv fest halten, ohne es zu beschädigen. Siehe Resendez et al.8 für das Verfahren zur Herstellung der mit Schläuchen bedeckten Bulldoggenklemme.
    3. Platzieren Sie die Relaislinse langsam (~100 - 200 μm/min) auf dem Zielbereich (-3,16 mm AP, 3,50 mm ML und -3,50 mm DV vom Bregma) und stabilisieren Sie sie mit Zahnzement.
  4. Dummy-Grundplattierung
    HINWEIS: Der Zweck der "Dummy-Baseplating" während der Implantationsoperation besteht darin, eine Zahnzementbasis zu schaffen, um die Menge an Zahnzement zu reduzieren, die während des eigentlichen Baseplating-Verfahrens einige Wochen später aufgetragen werden muss. Auf diese Weise wird das Risiko einer Veränderung des Volumens des Zahnzements minimiert.
    1. Befestigen Sie das Objektiv an der Unterseite des Miniskops und montieren Sie die Grundplatte auf dem Miniskop (in diesem Schritt wurde die Montage der verankerten Objektivlinse, der Grundplatte und des Miniskops noch nicht über den Schädel der Maus gelegt).
    2. Wickeln Sie 10 cm Paraffinfolie um die Außenseite der Grundplatte (Abbildung 4A).
    3. Halten Sie das Miniskop mit der stereotaktischen Armsonde unter Verwendung von wiederverwendbarem Klebeton fest.
    4. Richten Sie das Objektiv auf der Oberseite der Relaislinse aus, wobei der Abstand zwischen den Linsen so gering wie möglich ist (Abbildung 4B).
    5. Verwenden Sie Zahnzement, um die Positionierung der Grundplatte zu sichern (so, dass der Zement nur die Paraffinfolie berührt).
    6. Wenn der Zahnzement getrocknet ist, entfernen Sie die Folie.
    7. Entfernen Sie die Grundplatte und das Miniskop. Der Zahnzementboden ist hohl (Abbildung 4B).
    8. Um die Relaislinse vor täglichen Aktivitäten und vor Kratzern durch die Maus zu schützen, versiegeln Sie die Relaislinse mit etwas geformtem Silikonkautschuk, bis die Relaislinse bedeckt ist, und bedecken Sie den Silikonkautschuk mit einer dünnen Schicht Zahnzement (Abbildung 4B).
    9. Trennen Sie die Maus von den stereotaktischen Instrumenten und legen Sie sie in eine Aufwachkammer.
    10. Injizieren Sie Carprofen (5 mg/kg; subkutane Injektion) oder Meloxicam (1 mg/kg; subkutane Injektion) zur Analgesie und Ceftazidim (25 mg/kg; subkutane Injektion) zur Vorbeugung einer Infektion.
      HINWEIS: Der Einsatz von Antibiotika ist keine Alternative zu einer aseptischen Technik. Perioperative Antibiotika (z. B. Ceftazidim) können unter bestimmten Umständen indiziert sein, z. B. bei Langzeitoperationen oder beim Einsetzen chronischer Implantate.
    11. Beobachten Sie das Tier, bis es wieder ausreichend Bewusstsein erlangt, um das Brustbein zu erhalten.
    12. Hausmäuse einzeln und injizieren Meloxicam (1 mg/kg; subkutane Injektion; alle 24 Stunden) für eine Woche, um postoperative Schmerzen zu lindern. Überprüfen Sie das Tier jeden Tag nach der Operation, um sicherzustellen, dass es normal isst, trinkt und defäkiert.
    13. Führen Sie nach 3 oder mehr Wochen eine Baseplattierung durch.

3. Grundbeschichtung

HINWEIS: In der Regel kann das Baseplating-Verfahren (Abbildung 5) aufgrund der Erholungs- und Virusinkubationszeit nicht innerhalb von 2-3 Wochen nach dem ersten Eingriff durchgeführt werden. Die Induktionsverfahren für die Grundplattierung ähneln denen, die in den Schritten 2.1.1 bis 2.1.8 beschrieben sind. Die Bodenbeschichtung ist jedoch kein invasives Verfahren, und das Tier benötigt nur eine leichte Sedierung. Daher sind 0,8-1,2% Isofluran ausreichend, solange sich das Tier nicht auf dem stereotaktischen Rahmen bewegen kann. Darüber hinaus kann eine relativ leichte Isofluran-Anästhesie auch dazu beitragen, die Expression der Fluoreszenztransienten von Neuronen während des Monitoringszu erleichtern 8 (Ergänzendes Video S2).

  1. Schneiden Sie die dünne Schicht des Dentalzementdaches vorsichtig mit einem Knochenrongeur und entfernen Sie den Silikonkautschuk. Reinigen Sie die Oberfläche der Relaislinse mit 75% igem Alkohol.
  2. Befestigen Sie eine Stellschraube neben der Grundplatte, um sie an der Unterseite des Miniskops zu befestigen (Abbildung 5A1).
    HINWEIS: Die Grundplatte muss sicher unter der Unterseite des Miniskops festgezogen werden, da der Unterschied zwischen einer festgezogenen und einer leicht befestigten Grundplatte zu einem ungleichmäßigen Abstand führen kann.
  3. Stellen Sie den Fokusschlitten so ein, dass er ca. 2,7 bis 3 mm vom Hauptgehäuse entfernt ist (Abbildung 5A2).
    HINWEIS: Obwohl die Länge während des Grundplattierungsvorgangs weiter eingestellt werden kann, fixieren Sie sie auf ca. 2,7 mm, da das gleichzeitige Einstellen der Miniskoplänge und der optimalen Länge zwischen der implantierten Relaislinse und der vorverankerten Objektivlinse sehr verwirrend ist.
  4. Schließen Sie das Miniskop an die Datenerfassungskarte an und schließen Sie es an einen USB 3.0-Anschluss (oder höher) an einem Computer an.
  5. Führen Sie die vom UCLA-Team entwickelte Datenerfassungssoftware aus.
  6. Stellen Sie die Belichtung auf 255, die Verstärkung auf 64x und die Anregungs-LED auf 5% ein. Diese Einstellungen werden für die anfängliche Grundplattierung empfohlen. Die spezifischen Einstellungen variieren in Abhängigkeit von den Hirnregionen und den Expressionsniveaus des genetisch kodierten Kalziumindikators.
  7. Klicken Sie auf die Schaltfläche Verbinden , um das Miniskop mit der Datenerfassungssoftware zu verbinden und den Livestream anzusehen.
  8. Richten Sie das Miniskop-Objektiv von Hand auf das Relaisobjektiv aus und beginnen Sie mit der Suche nach den Fluoreszenzsignalen (Abbildung 5B1).
    HINWEIS: Die manuelle Suche nach dem Fluoreszenzsignal erleichtert zunächst die Anpassung. Da ein AAV-System verwendet wurde, um den genetisch kodierten Kalziumindikator zu exprimieren, beeinflussten sowohl der Promotortyp als auch der AAV-Serotyp die Effizienz der Transfektion23,24. Die Forscher sollten die Expression des Kalziumindikators überprüfen müssen, indem sie einzelne Neuronen finden, die Veränderungen in der Fluoreszenz zeigen, bevor sie mit zukünftigen Experimenten fortfahren.
  9. Bohren Sie den Zahnzement an einer beliebigen Stelle aus, an der er das Miniskop blockiert (optional).
  10. Sehen Sie sich den Live-Stream der Datenerfassungssoftware an und nutzen Sie den Rand der Relaislinse als Orientierungspunkt (Ergänzungsvideo S2). Der Rand der Relaislinse erscheint als mondähnlicher grauer Kreis auf dem Monitor (Abbildung 5B1; weiße Pfeile).
  11. Sobald die Relaislinse gefunden wurde, stellen Sie die verschiedenen Winkel und Abstände des Miniskops sorgfältig ein, bis die Fluoreszenzsignale gefunden werden.
    HINWEIS: Die Bilder der Neuronen sind weißer als der Hintergrund. Eine präzise neuronale Form zeigt an, dass die Neuronen perfekt auf der Brennebene der Relaislinse liegen. Runde Neuronen deuten darauf hin, dass sie sich in der Nähe der Brennebene befanden. Die neuronale Form ist im Gehirn unterschiedlich, hier wird ventrales CA1 als Beispiel gezeigt.
  12. Wenn kein einzelnes Neuron Veränderungen der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Zeit aufweist, verschließen Sie die Basis mit Silikonkautschuk. Eine Fluoreszenz wird nicht beobachtet, da die Inkubationszeit auch von der Eigenschaft des Virus23,24 abhängt. Führen Sie die Schritte 3.1-3.12 nach einer weiteren Woche durch. (Dies ist optional).
  13. Halten Sie das Miniskop in der optimalen Position, und bewegen Sie den stereotaktischen Arm mit einer wiederverwendbaren Klebemasse in Richtung des Miniskops (Abbildung 5B2). Kleben Sie das Miniskop mit wiederverwendbarer Klebemasse auf den stereotaktischen Arm.
  14. Passen Sie die x-, y- und z-Arme leicht an, um nach der besten Ansicht zu suchen (ergänzendes Video S2). Passen Sie als Nächstes den Winkel zwischen der Oberfläche der Objektivlinse und der Relaislinse an, indem Sie die Ohrstange, die Zahnstange oder die wiederverwendbare Klebemasse auf der Z-Achse drehen. Die virale Expression und Linsenimplantation ist erfolgreich, wenn mindestens eine Zelle Fluoreszenztransienten aufweist (Abbildung 6A; Ergänzendes Video S2) während der Grundbeschichtung (die auch von der Region des Gehirns abhängt, wie z.B. die CA1).
    HINWEIS: Wenn der Monitor nur weiße Zellen, aber keine Transienten anzeigt, liegt eine andere Ursache vor (siehe Abbildung 6B, C, Ergänzende Videos S4, S5, Abschnitt "Ergebnisse" und Abschnitt "Fehlerbehebung").
  15. Zementieren Sie die Grundplatte (Abbildung 5B2) mit dem Zahnzement.
  16. Überwachen Sie den interessierenden Bereich während der Zementierung, um sicherzustellen, dass sich die optimale Position nicht ändert.
  17. Verwenden Sie die kleinstmögliche Menge Zement und verkleben Sie die Grundplatte dennoch fest auf die Zahnzementbasis (Abbildung 5B2). Tragen Sie eine zweite und dritte Schicht Zement um die Grundplatte auf, aber achten Sie darauf, die GRIN-Linse nicht zu beeinträchtigen.
    HINWEIS: Das Auftragen von Zement auf die Grundplatte ist in diesem Schritt einfacher, da die Basis der Grundplatte während des Dummy-Beschichtungsvorgangs geformt wurde.
  18. Lösen Sie das Miniskop vorsichtig von der Grundplatte, wenn der Zement ausgehärtet ist. Schrauben Sie dann eine Schutzkappe auf.
  19. Bringen Sie das Tier in einen Aufwachkäfig. Beobachten Sie das Tier, bis es wieder ausreichend Bewusstsein erlangt, um das Brustbein zu erhalten.
  20. Hausmäuse einzeln. Stellen Sie sicher, dass es jeden Tag normal isst, trinkt und defäkiert. Warten Sie 5 Tage, bis sich die Maus vollständig erholt hat, und überprüfen Sie dann die Kalziumbildgebung.
    HINWEIS: Es gibt nur eine kleine Menge Zahnzement, der die Grundplatte hält. Wenn sich die Grundplatte seit dem Baseplattierungsverfahren erheblich verschoben hat, entfernen Sie den Zahnzement mit einem Bohrer und führen Sie den Baseplattierungsvorgang erneut durch.
  21. Anästhesieren (durch intraperitoneale Injektion eines Gemischs aus Ketamin (87 mg/kg)/Xylazin (13 mg/kg)) und Perfusion25 des Tieres, wenn alle Versuche durchgeführt sind.

Ergebnisse

Beurteilung der Volumenveränderung des Dentzement
Da sich das Volumen des Zahnzement während des Aushärtungsprozesses ändert, kann dies die Abbildungsqualität erheblich beeinträchtigen, da der Arbeitsabstand einer GRIN-Linse etwa 50 bis 350 μm 4,8 beträgt. Daher wurden in diesem Fall zwei kommerziell erhältliche Zahnzemente, Tempron und Tokuso, vor der Implantation und Baseplattierung getestet (Abbildung 5

Diskussion

Der vorliegende Bericht beschreibt ein detailliertes Versuchsprotokoll für Forscher, die das zweilinsige UCLA Miniscope-System verwenden. Die in unserem Protokoll entwickelten Werkzeuge sind relativ erschwinglich für jedes Labor, das die In-vivo-Calcium-Bildgebung ausprobieren möchte. Einige Protokolle, wie z. B. Virusinjektion, Linsenimplantation, Dummy-Baseplating und Baseplating, könnten auch für andere Versionen des Miniscope-Systems verwendet werden, um die Erfolgsrate der Kalzium-Bildgebung zu verbess...

Offenlegungen

Dies ist keine von der Industrie unterstützte Studie. Die Autoren berichten von keinen finanziellen Interessenkonflikten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan (108-2320-B-002-074, 109-2320-B-002-023-MY2) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.7-mm drill bit #19008-07Fine Science Tools; USAfor surgery
0.1–10 μl pipette tips104-Q; QSPFisher Scientific; Singaporefor testing dental cement
20 G IV cathater#SR-OX2032CATerumo Corporation; Tokyo, Japanfor surgery
27 G needleAGANI, AN*2713RTerumo Corporation; Tokyo, Japanfor surgery
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE#104487-AAV9; 1.5*10^13Addgene viral prep; MA, USAfor viral injection
Atropine sulfateAstart; Hsinchu, Taiwanfor surgery/dummy baseplating/baseplating
BaseplateV3http://miniscope.orgfor dummy baseplating/baseplating
BLU TACK#30840350Bostik; Chelsea, Massachusetts, USAReusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating
Bone Rongeur Friedman13 cmDiener; Tuttlingen, Germanyfor baseplating
BuprenorphineINDIVIOR; UKfor surgery
CarprofenRimadylZoetis; Exton, PAanalgesia
CeftazidimeTaiwan Biotech; Taiwanprevent infection
Data Acquisition PCB for UCLA Miniscopepurchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daqfor baseplating
Dental cement setTempronGC Corp; Tokyo, Japanfor testing dental cement
Dental cement setTokuso CurefastTokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japanfor testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating
Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors#51673Stoelting Co; Illinois, USAfor surgery/dummy baseplating/baseplating
Duratear ointmentAlcon; Geneva, Switzerlandfor surgery/dummy baseplating/baseplating
IbuprofenYungShin; Taiwananalgesia
IsofluranePanion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwanfor surgery/dummy baseplating/baseplating
InscopixnVista SystemInscopix; Palo Alto, CAfor comparison with V3 UCLA Miniscope
KetaminePfizer; NY, NYfor euthanasia
Normal salinefor surgery
Micro bulldog clamps#12.102.04Dimedo; Tuttlingen, Germanyfor lens implantation
Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge#88400Hamilton; Bonaduz, Switzerlandfor viral injection
Molding silicone rubberZA22 ThixoZhermack; Badia Polesine, Italyfor dummy baseplating
Objective Gradient index (GRIN) lens#64519Edmund Optics; NJ, USAfor dummy baseplating/baseplating
Parafilm#PM996Bemis; Neenah, USAfor dummy baseplating
Portable Suction#DF-750Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwanfor surgery
Relay GRIN lens#1050-002177Inscopix; Palo Alto, CA, USAfor dummy baseplating/baseplating
Stainless steel anchor screws1.00 mm diameter, total length 3.00 mmfor surgery
Stereo microscope#SL720Sage Vison; New Taipei City, Taiwanfor surgery/dummy baseplating/baseplating
Stereotaxic apparatus#51673Stoelting; IL, USAfor surgery/dummy baseplating/baseplating
UV Cure Adhesive#3321Loctite; Düsseldorf, Germanyfor testing dental cement
V3 UCLA Miniscopepurchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-componentsfor surgery/dummy baseplating/baseplating
XylazineX1126Sigma-Aldrich; St. Louis, MOfor euthanasia
Xylocaine pump spray 10%AstraZeneca; Södertälje, Swedenfor surgery

Referenzen

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