마우스의 칼슘 과도 연구를 위해 대물 렌즈가 사전 고정된 베이스플레이팅과 미니스코프 사용

Yi-Tse Hsiao; Angela Yu-Chi Wang; Ting-Yen Lee; Ching-Yuan Chang

doi:10.3791/62611

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기사 소개

요약
초록
서문
프로토콜
결과
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자료
참고문헌
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요약

경화 중 치과용 시멘트의 수축은 베이스 플레이트를 대체합니다. 이 프로토콜은 베이스 플레이트를 시멘트로 만들 공간을 남기는 치과용 시멘트의 초기 기초를 만들어 문제를 최소화합니다. 몇 주 후, 베이스 플레이트는 새 시멘트를 거의 사용하지 않고 이 비계의 위치에 접합될 수 있으므로 수축을 줄일 수 있습니다.

초록

신경 과학자들은 미니어처 현미경 (미니 스코프)을 사용하여 자유롭게 행동하는 동물의 신경 활동을 관찰합니다. 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 미니스코프 팀은 연구원들이 미니스코프를 직접 만들 수 있는 개방형 리소스를 제공합니다. V3 UCLA 미니스코프는 현재 사용 중인 가장 인기 있는 오픈 소스 미니스코프 중 하나입니다. 표재성 피질에 이식 된 대물 렌즈 (1 렌즈 시스템)를 통해 유전자 변형 뉴런에서 방출되는 형광 과도 현상의 이미징을 허용하거나 심부 뇌에 이식 된 릴레이 렌즈와 중계 된 이미지를 관찰하기 위해 미니 스코프에 미리 고정 된 대물 렌즈의 조합을 통해 깊은 뇌 영역에서 이미징 할 수 있습니다 (2 렌즈 시스템). 최적의 조건(뉴런이 형광 지표를 발현하고 릴레이 렌즈가 적절하게 이식된 경우)에서도 시멘트 경화 시 베이스 플레이트와 두개골에 부착된 시멘트 사이의 치과용 시멘트의 부피 변화로 인해 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 사이의 거리가 변경되어 정렬 불량이 발생하여 이미지 품질이 저하될 수 있습니다. 베이스 플레이트는 미니스코프를 두개골에 장착하고 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 사이의 작동 거리를 고정하는 데 도움이 되는 플레이트입니다. 따라서 베이스 플레이트 주변의 치과용 시멘트 부피의 변화는 렌즈 사이의 거리를 변경합니다. 본 프로토콜은 치과용 시멘트의 부피 변화로 인한 오정렬 문제를 최소화하는 것을 목표로 한다. 이 프로토콜은 릴레이 렌즈 이식 중에 치과 용 시멘트의 초기 기초를 구축하여 정렬 불량을 줄입니다. 이식 후 회복 시간은 치과용 시멘트의 기초가 베이스 플레이트를 완전히 경화시키기에 충분하므로 가능한 한 적은 새 시멘트를 사용하여 베이스 플레이트를 이 비계에 접합할 수 있습니다. 이 기사에서는 미니스코프에 고정된 대물 렌즈로 신경 활동의 이미징을 가능하게 하기 위해 마우스의 베이스플레이팅 전략을 설명합니다.

서문

형광 활동 리포터는 민감하고 큰 동적 범위 ^1,2,3을 갖기 때문에 신경 활동의 이미징에 이상적입니다. 따라서 형광 현미경을 사용하여 신경 세포 활동 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15를 직접 관찰하는 실험이 증가하고 있습니다. ^,¹⁶. 최초의 소형화된 단광자 형광 현미경(미니스코프)은 2011년 Mark Schnitzer et ^al.5에 의해 설계되었습니다. 이 미니스코프를 통해 연구자들은 자유롭게 행동하는 동물⁵(즉, 동물에 대한 물리적 구속, 머리 고정, 진정 또는 마취 없이)에서 소뇌 세포의 형광 역학을 모니터링할 수 있습니다. 현재이 기술은 피질 6,8,15,16과 같은 표면 뇌 영역을 모니터링하는 데 적용될 수 있습니다. 등쪽 해마 8,11,13,14 및 선조체 ^6,17과 같은 피질 하 영역; 복부 해마 14, 편도체^10,18 및 시상 하부 ^8,12와 같은 심뇌 영역.

최근 몇 년 동안 여러 오픈 소스 미니 스코프가 개발되었습니다.⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁷^,¹⁹. 미니스코프는 연구원들이 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 미니스코프 팀에서 제공하는 단계별 지침을 따르는 경우 경제적으로 조립할 수 있습니다.⁴^,⁷^,¹¹^,¹³. 신경 활동의 광학 모니터링은 광 투과의 한계에 의해 제한되기 때문에⁷ 관심 있는 뉴런 집단과 함께 중계 GRIN 렌즈(또는 릴레이 렌즈)에서 중계되는 시야를 확대하기 위해 미니스코프 하단에 대물 기울기 굴절률(GRIN) 렌즈(또는 대물 렌즈)를 미리 고정해야 하는 미니스코프가 설계되었습니다.⁶^,⁷^,⁸^,¹⁰^,¹⁶^,¹⁷. 이 릴레이 렌즈는 표적 뇌 영역의 형광 활동이 릴레이 렌즈의 표면으로 릴레이되도록 표적 뇌 영역에 이식됩니다.⁶^,⁷^,⁸^,¹⁰^,¹⁶^,¹⁷. 빛의 전체 정현파 주기의 약 1/4이 대물 GRIN 렌즈(~ 0.25피치)를 통해 이동합니다(그림 1A1), 확대된 형광 이미지를 생성합니다.⁶^,⁷. 대물 렌즈가 항상 미니스코프 하단에 고정되는 것은 아니며 릴레이 렌즈의 이식이 필요하지 않습니다.⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵. 구체적으로, 두 가지 구성이 있습니다 : 하나는 미니 스코프에 고정 대물 렌즈가 있고 하나는 뇌에 이식 된 릴레이 렌즈입니다.⁸^,¹⁰^,¹²^,¹⁴^,¹⁶ (그림 1B1) 그리고 다른 하나는 탈착식 대물 렌즈가 있습니다.⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵ (그림 1B2). 고정 대물렌즈와 이식된 릴레이 렌즈 조합을 기반으로 한 설계에서 뇌의 형광 신호는 릴레이 렌즈의 상단 표면(그림 1A1)⁷^,⁸^,¹⁰^,¹²^,¹⁴^,¹⁶. 이어서, 대물 렌즈는 릴레이 렌즈의 상부 표면으로부터 시야를 확대하고 전송할 수 있습니다 (그림 1A2). 반면에 탈착식 대물 GRIN 렌즈 디자인은 더 유연하여 릴레이 렌즈를 뇌에 미리 이식하는 것이 필수가 아닙니다(그림 1B2)⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵. 탈착식 대물 렌즈 디자인을 기반으로 한 미니스코프를 사용할 때 연구원은 여전히 대상 뇌 영역에 렌즈를 이식해야 하지만 대물 렌즈를 이식할 수 있습니다.⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵ 또는 뇌의 릴레이 렌즈⁶^,⁷. 이식을위한 대물 렌즈 또는 릴레이 렌즈의 선택은 연구원이 사용해야하는 미니 스코프 구성을 결정합니다. 예를 들어, V3 UCLA 미니스코프는 탈착식 대물 GRIN 렌즈 디자인을 기반으로 합니다. 연구원은 관심 있는 뇌 영역에 대물 렌즈를 직접 이식하고 "빈" 미니스코프를 대물 렌즈에 장착하도록 선택할 수 있습니다.⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵ (일렌즈 시스템; 그림 1B2) 또는 뇌에 릴레이 렌즈를 이식하고 대물 렌즈가 미리 고정 된 미니 스코프를 장착합니다.⁶^,⁷ (2 렌즈 시스템; 그림 1B1). 그런 다음 미니스코프는 형광 카메라로 작동하여 유전적으로 암호화된 칼슘 지표에 의해 생성된 신경 형광의 라이브 스트림 이미지를 캡처합니다.¹^,²^,³. 미니스코프를 컴퓨터에 연결한 후 이러한 형광 이미지를 컴퓨터로 전송하여 비디오 클립으로 저장할 수 있습니다. 연구원은 일부 분석 패키지로 형광의 상대적 변화를 분석하여 신경 활동을 연구할 수 있습니다.²⁰^,²¹ 또는 향후 분석을 위해 코드를 작성하십시오.

V3 UCLA 미니스코프는 사용자가 1^{렌즈 또는 2}렌즈 시스템으로 뉴런 활동을 이미지화할지 여부를 결정할 수 있는 유연성을 제공합니다7. 기록 시스템의 선택은 대상 뇌 영역의 깊이와 크기를 기반으로합니다. 간단히 말해서, 단일 렌즈 시스템은 제조업체가 특정 크기의 대물 렌즈만 생산하기 때문에 표면적(약 2.5mm 깊이) 비교적 큰(약 1.8 x 1.8mm²보다 큼) 영역만 이미징할 수 있습니다. 대조적으로, 2 렌즈 시스템은 모든 표적 뇌 영역에 적용될 수 있습니다. 그러나 베이스 플레이트를 접착하기 위한 치과용 시멘트는 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 사이의 거리가 변경되어 정렬 불량을 일으켜 이미지 품질이 저하되는 경향이 있습니다. 2렌즈 시스템을 사용하는 경우 최적의 이미징 품질을 달성하기 위해 두 개의 작동 거리를 정밀하게 타겟팅해야 합니다(그림 1A). 이 두 가지 중요한 작동 거리는 릴레이 렌즈의 뉴런과 하단 표면 사이, 릴레이 렌즈의 상단 표면과 대물 렌즈의 하단 표면 사이입니다(그림 1A1). 작동 거리 밖에서 렌즈가 잘못 정렬되거나 잘못 배치되면 이미징 오류가 발생합니다(그림 1C2). 반면, 단일 렌즈 시스템은 단 하나의 정확한 작동 거리만 필요합니다. 그러나 대물 렌즈 크기는 심뇌 영역 모니터링에 대한 적용을 제한합니다 (미니 스코프에 맞는 대물 렌즈는 약 1.8 ~ 2.0mm 6,11,13,15). 따라서, 대물 렌즈의 이식은 마우스 11,13에서 피질 ^6,15 및 등쪽 각막 암모니스 1 (^CA1)과 같은 표면 및 비교적 큰 뇌 영역의 관찰을 위해 제한된다. 또한, 피질의 넓은 영역은 등쪽 CA1^11,13을 표적으로 삼기 위해 흡인되어야합니다. 심부 뇌 영역의 이미징을 방지하는 단일 렌즈 구성의 한계로 인해 상용 미니스코프 시스템은 결합된 대물 렌즈/릴레이 렌즈(2개 렌즈) 설계만 제공합니다. 반면에 V3 UCLA 미니 스코프는 대물 렌즈가 탈착식 6,11,13,15이기 때문에 1 렌즈 또는 2 렌즈 시스템으로 수정할 수 있습니다. 즉, V3 UCLA 미니 스코프 사용자는 탈착식 렌즈를 뇌에 이식 (단일 렌즈 시스템 생성), 표면 뇌 관찰 (깊이 2.5mm 미만)과 관련된 실험을 수행 할 때 또는 미니 스코프에 미리 고정하고 뇌에 릴레이 렌즈를 이식하여 (2 렌즈 시스템 생성) 활용할 수 있습니다. 심뇌 관찰과 관련된 실험을 수행 할 때. 2 렌즈 시스템은 뇌를 표면적으로 관찰하는 데에도 적용 할 수 있지만 연구원은 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 사이의 정확한 작동 거리를 알아야합니다. 단일 렌즈 시스템의 주요 장점은 두 렌즈 시스템에서 최적의 이미징 품질을 달성하기 위해 정확하게 타겟팅해야 하는 두 개의 작동 거리가 있기 때문에 두 렌즈 시스템보다 작동 거리를 놓칠 가능성이 적다는 것입니다(그림 1A). 따라서 피상적 인 뇌 관찰을 위해 단일 렌즈 시스템을 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 실험에 심뇌 영역의 이미징이 필요한 경우 연구원은 두 렌즈의 정렬 불량을 피하는 방법을 배워야합니다.

실험용 미니스코프의 2렌즈 구성을 위한 기본 프로토콜에는 렌즈 이식 및 베이스플레이팅 8,10,16,17이 포함됩니다. 베이스플레이팅은 미니스코프를 동물의 머리 위에 장착하고 뉴런의 형광 신호를 비디오테이프로 녹화할 수 있도록 하는 베이스 플레이트를 동물의 머리에 붙이는 것입니다(그림 1B). 이 절차에는 치과용 시멘트를 사용하여 베이스 플레이트를 두개골에 붙이는 것이 포함되지만(그림 1C), 치과용 시멘트의 수축은 이식된 릴레이 렌즈와 대물 렌즈(^8,17) 사이의 거리에 허용할 수 없는 변화를 일으킬 수 있습니다. 두 렌즈 사이의 이동 거리가 너무 크면 셀에 초점을 맞출 수 없습니다.

미니스코프를 사용한 심부 뇌 칼슘 영상 실험에 대한 자세한 프로토콜이 이미 발표되었습니다.⁸^,¹⁰^,¹⁶^,¹⁷. 이러한 프로토콜의 작성자는 Inscopix 시스템을 사용했습니다.⁸^,¹⁰^,¹⁶ 또는 다른 주문을 받아서 만들어진 디자인¹⁷ 바이러스 선택, 수술 및 베이스 플레이트 부착에 대한 실험 절차를 설명했습니다. 그러나 프로토콜은 V3 UCLA Miniscope 시스템, NINscope와 같은 다른 오픈 소스 시스템에 정확하게 적용될 수 없습니다.⁶, 및 핀치스코프¹⁹. 베이스 플레이트를 두개골에 접합하는 데 사용되는 치과 용 시멘트의 유형으로 인해 UCLA Miniscope를 사용하여 두 렌즈 구성으로 기록하는 동안 두 렌즈의 정렬 불량이 발생할 수 있습니다.⁸^,¹⁷ (그림 1C). 이식된 릴레이 렌즈와 대물 렌즈 사이의 거리가 베이스도금 절차 동안 치과용 시멘트의 바람직하지 않은 수축으로 인해 이동하기 쉽기 때문에 본 프로토콜이 필요합니다. 베이스 도금 중에 미니스코프와 릴레이 렌즈 상단 사이의 거리를 조정하여 이식된 릴레이 렌즈와 대물 렌즈 사이의 최적 작동 거리를 찾아야 하며, 그런 다음 베이스 플레이트를 이 이상적인 위치에 접착해야 합니다. 대물 렌즈와 이식된 릴레이 렌즈 사이의 정확한 거리가 설정되면 셀룰러 해상도(그림 1B; in vivo 녹음). 릴레이 렌즈의 최적 작동 거리 범위가 작기 때문에(50 - 350 μm)⁴^,⁸경화 중 과도한 시멘트 수축으로 인해 대물 렌즈와 이식된 릴레이 렌즈를 적절한 범위 내로 유지하기 어려울 수 있습니다. 이 보고서의 전반적인 목표는 수축 문제를 줄이기위한 프로토콜을 제공하는 것입니다.⁸^,¹⁷ 이는 베이스도금 절차 중에 발생하고 2렌즈 구성에서 형광 신호의 미니스코프 기록 성공률을 높이기 위한 것입니다. 성공적인 미니스코프 기록은 자유롭게 행동하는 동물에서 개별 뉴런의 형광에서 눈에 띄는 상대적 변화를 실시간으로 기록하는 것으로 정의됩니다. 치과용 시멘트 브랜드마다 수축률이 다르지만 연구원은 이전에 테스트한 브랜드를 선택할 수 있습니다.⁶^,⁷^,⁸^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,²². 그러나 의료 재료에 대한 수입 규정으로 인해 일부 국가/지역에서 모든 브랜드를 쉽게 구할 수 있는 것은 아닙니다. 따라서 우리는 사용 가능한 치과용 시멘트의 수축률을 테스트하는 방법을 개발했으며, 중요하게는 수축 문제를 최소화하는 대체 프로토콜을 제공합니다. 현재의 베이스도금 프로토콜에 비해 장점은 실험실에서 쉽게 얻을 수 있는 도구 및 시멘트를 사용한 칼슘 이미징의 성공률이 증가한다는 것입니다. UCLA 미니스코프가 예제로 사용되지만 프로토콜은 다른 미니스코프에도 적용할 수 있습니다. 이 보고서에서는 최적화된 베이스플레이팅 절차에 대해 설명하고 UCLA 미니스코프 2렌즈 시스템(그림 2A). UCLA 미니 스코프를 사용한 2 렌즈 구성에 대한 성공적인 이식 예 (n = 3 마우스)와 이식 실패 사례 (n = 2 마우스)가 성공과 실패의 이유에 대한 논의와 함께 제시됩니다.

프로토콜

이 연구에서 수행 된 모든 절차는 국립 대만 대학 동물 관리 및 사용위원회 (승인 번호 : NTU-109-EL-00029 및 NTU-108-EL-00158)의 승인을 받았습니다.

1. 치과용 시멘트의 체적 변화 평가

참고: 치과용 시멘트의 부피 변화는 경화 과정에서 발생합니다. 이식 및 베이스 도금 전에 치과용 시멘트의 부피 변화를 테스트합니다. 연구원은 모든 브랜드의 치과용 시멘트를 테스트하고 부피 변화가 가장 적은 브랜드를 사용하여 베이스 플레이트를 시멘트로 만들 수 있습니다. 그림 3에 예가 나와 있습니다.

각 치과 용 시멘트 분말 0.5g의 무게를 달아 적절한 용액 (1mL)과 혼합하십시오.
알림: 치과 용 시멘트 지침에서 권장되는 분말 / 액체 비율은 고체 형태를 얻기 위해 0.5g의 분말 대 0.25mL의 용액입니다. 이 테스트 프로토콜은 피펫 팁의 부피 변화를 측정하기 위해 혼합물을 액체 형태로 흡인할 수 있도록 비율을 0.5g/mL로 희석합니다.
0.1-10μL 피펫 팁을 사용하여 2.5μL의 치과용 시멘트 혼합물을 제거한 다음 피펫 팁을 광경화 접착제로 밀봉합니다.
팁을 랙에 놓고 치과 용 시멘트 혼합물의 최상위 수준을 표시하고 40 분 후에 치과 용 시멘트 혼합물의 수준을 측정합니다 (보충 비디오 S1).
팁에서 치과용 시멘트 경화 중 레벨 변화를 모니터링하는 것 외에도 남은 건조 치열 시멘트 밀도를 측정합니다. 밀도를 계산하려면 치과용 시멘트의 무게를 측정하고 아르키메데스의 원리로 부피를 측정합니다.
1. 간단히 말해서, 남은 마른 치과 용 시멘트를 물이 채워진 컵에 넣고 넘쳐나는 물의 무게를 잰다.
아래에 설명 된 모든 프로토콜에 대해 수축이 가장 적은 치과 용 시멘트를 사용하십시오.

2. 마취, 외과적 이식, 바이러스 주입, 더미 베이스플레이팅

마취
참고: 본 보고서는 UCLA 미니스코프의 수술 및 베이스도금 절차를 최적화하는 것을 목표로 합니다. 따라서, 표적 뇌 영역을 감염시키기위한 최적의 바이러스 역가가 알려져 있다고 가정되었다. 최적의 바이러스 역가를 찾는 방법은 Resendez 등의 1-5 단계에서 찾을 수 있습니다.⁸. 바이러스 희석이 최적화되면 외과적 이식을 시작할 수 있습니다.
1. 마우스를 유도 용기에 넣고 산소를 공급합니다(0.2L/min의 기류 속도에서 100%). 마우스에 5-10 분 동안 산소를 미리 공급하십시오.
2. 마우스가 균형을 잃기 시작하고 결국 마취될 때까지 100% 산소(기류 속도: 0.2L/min)와 혼합된 5% 이소플루란을 투여합니다.
3. 유도실에서 마우스를 꺼내 아트로핀(0.04mg/kg, 피하 주사)을 주사하여 진통제로 타액과 부프레노르핀(0.03mg/kg, 피하 주사)이 축적되는 것을 방지합니다.
4. 마우스의 머리를 면도하십시오.
5. 마스크, 멸균 가운 및 장갑을 착용하십시오. 수술을 위해 멸균 공간과 멸균 수술기구를 준비하십시오. 입체 장치에서 마우스의 머리를 안정화시킵니다 (이 단계 동안 3-2.5 % 이소 플루 란으로 마취를 유지하십시오). 진통제 및 마취 절차 후 이어 바가 머리를 단단히 안정 시키는지 확인하십시오. 열 지원을 제공하십시오.
6. 머리가 똑바로 놓여 있는지 확인하고 면도 한 머리를 베타 딘으로 멸균 한 다음 머리에 국소 진통제 인 자일로 카인 (10 %)을 뿌립니다.
7. 건조를 방지하기 위해 눈에 수의학 연고를 바르십시오.
  알림: 안구 손상을 예방하기 위해 모든 마취 동안 눈 보호를 위해 안과 연고를 사용하십시오.
8. 뒷발을 꼬집어 동물의 깊은 통증 반사를 테스트하십시오. 동물이 발 철수 반사를 보이지 않으면 수술 절차를 진행하십시오.
9. 두개골의 중간 시상면을 따라 작은 절개를하십시오 (브레그마 앞쪽 약 2mm에서 시작하여 브레그마 뒤쪽 약 6mm로 끝남). 그런 다음 두개골의 결합 조직을 청소하고 세 개의 스테인리스 스틸 나사를 왼쪽 정면 및 정수리 뼈에 고정합니다.
  1. 이 시점에서 이소 플루 란을 1-2 %로 줄입니다. 전체 수술 과정에서 호흡 속도를 모니터링하십시오. 호흡 속도가 너무 느리면 (동물에 따라 약 1 / s) 이소 플루 란의 농도를 줄이십시오.
10. 팁 직경이 0.7mm인 버 드릴을 사용하여 수술용 현미경 또는 실체 현미경으로 릴레이 렌즈 이식을 위한 개두술을 실행합니다. 마이크로 드릴을 사용하여 버 드릴 비트를 잡고 의도 한 원 영역의 윤곽을 그립니다 (종골의 전체 두께는 관통 할 필요가 없습니다).
  참고 : 현재 프로토콜에 사용 된 릴레이 렌즈는 직경 1.0mm, 길이 ~ 9.0mm, 피치 1, 작동 거리 범위는 ~ 100μm-300μm입니다. 따라서 개두술의 직경은 1.2mm였습니다.
  1. 경막이 노출 될 때까지 윤곽선을 부드럽게 깊게합니다.
  2. 3mL 주사기에 3mL의 멸균 식염수를 준비하고 얼음 양동이에서 식힌다. 주사기에서 0.1mL의 식염수로 노출 된 부위를 자주 헹구어 해당 부위를 식히고 열 손상과 출혈을 예방하십시오.
11. 27G 바늘로 경막을 가볍게 골라 떼어냅니다.
12. 끝에서 27mm 떨어진 1G 무딘 바늘에 표시를하고 렌즈 이식을위한 창을 만들기 위해 뇌의 피질을 조심스럽게 흡인하는 데 사용합니다 8,11,13,17 (그림 2B1). 필요한 경우 사포로 27G 주사 바늘 끝을 갈아서 뭉툭한 바늘을 만듭니다. 그런 다음 바늘을 주사기에 연결하고 주사기를 튜브에 연결하고 튜브를 흡입 소스에 연결하여 진공을 만듭니다.
  알림: 릴레이 렌즈는 뭉툭하며 깊은 뇌 영역에 배치될 때 뇌 조직을 압박합니다. 따라서, 피질의 흡인은 릴레이 렌즈 이식으로 인한 조직 손상을 감소시킨다. 피질은 생쥐에서 두께가 약 1mm이지만 실체 현미경으로 시각화하기가 어렵습니다. 이 마크는 실체 현미경만으로 바늘의 깊이를 더 정확하게 결정할 수있는 랜드 마크를 만듭니다. 또한 저항에 따라 피질 영역에 도달했는지 또는 통과했는지 여부를 결정할 수 있습니다. 피질의 윗부분은 상대적으로 부드럽고 피질 하 영역은 밀도가 느껴집니다. 따라서 텍스처가 더 조밀하게 느껴지기 시작하면 흡인을 중지하십시오(그림 2B3).
13. 3mL 주사기에 3mL의 멸균 식염수를 준비하고 얼음 양동이에서 식힌다. 출혈을 멈추고 뇌부종의 가능성을 줄이기 위해 식염수로 해당 부위를 헹굽니다.
아데노 관련 바이러스(AAV) 주사
참고 : AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE가 본 실험에 사용되었습니다. jGCaMP7s는 녹색 형광을 방출하는 유 전적으로 암호화 된 칼슘 지표입니다³. 본 연구에서는 야생형 마우스를 대상으로 사용했기 때문에 녹색 형광 칼슘 지표 유전자로 뉴런을 형질감염시키고 발현을 활성화하기 위해 바이러스 벡터가 필요했습니다. 녹색 형광 칼슘 지표를 발현하는 형질 전환 마우스를 대상으로 사용하는 연구원은 프로토콜 2.2를 건너 뛸 수 있습니다.
1. 20G 정맥 주사(i.v.) 카테터의 내부 바늘을 정위 팔에 장착하고 적절한 좌표(릴레이 렌즈 이식 중에 사용되는 것과 동일한 좌표)에서 뇌를 천자(~100 - 200μm/min)합니다(그림 2B3).
2. 미세 주입 바늘을 복부 CA1에 100-200 μm / min의 속도로 내리고 200 nL의 바이러스 벡터를 표적 영역 (-3.16 mm AP, 3.25 mm ML 및 -3.50 mm DV로 주입 (~ 25 nL / 분)합니다.
3. 바이러스가 확산되고 역류를 최소화하기 위해 10분 동안 기다리십시오.
4. 미세 주입 바늘을 빼냅니다(~100-200μm/분).
릴레이 렌즈 이식
1. 릴레이 렌즈를 75% 알코올^10,16으로 소독한 다음 발열원이 없는 식염수로 헹굽니다. 이식 될 때까지 차가운 발열원이없는 식염수에 렌즈를 담그십시오.
  참고: 차가운 렌즈는 뇌에 삽입할 때 뇌부종을 최소화합니다.
2. 톱니가 열수축 튜브로 덮인 마이크로 불독 클램프(그림 2B3)를 사용하여 릴레이 렌즈를 잡습니다.
  알림: 불독 클램프는 렌즈를 손상시키지 않고 단단히 고정할 수 있습니다. 튜브로 덮인 불독 클램프를 만드는 방법에 대해서는 Resendez et ^al.8 을 참조하십시오.
3. 릴레이 렌즈를 대상 영역(브레그마에서 -3.16mm AP, 3.50mm ML 및 -3.50mm DV) 위에 천천히 배치하고(~100 - 200μm/분) 치과용 시멘트로 안정화합니다.
더미 베이스 도금
참고: 이식 수술 중 "더미 베이스 플레이팅"의 목적은 몇 주 후 실제 베이스 도금 절차 중에 적용해야 하는 치과용 시멘트의 양을 줄이기 위해 치과용 시멘트 베이스를 만드는 것입니다. 이러한 방식으로, 치과용 시멘트의 부피 변화의 위험이 최소화된다.
1. 대물 렌즈를 미니스코프 바닥에 고정하고 베이스 플레이트를 미니스코프에 조립합니다(이 단계에서는 고정된 대물 렌즈, 베이스 플레이트 및 미니스코프의 어셈블리가 아직 마우스의 두개골 위에 놓이지 않았습니다).
2. 베이스 플레이트 외부에 10cm의 파라핀 필름을 감습니다(그림 4A).
3. 재사용 가능한 접착 점토를 사용하여 정위 암 프로브로 미니스코프를 잡습니다.
4. 대물 렌즈를 릴레이 렌즈 위에 맞춰 렌즈 사이에 가능한 한 적은 공간을 둡니다(그림 4B).
5. 치과용 시멘트를 사용하여 베이스 플레이트의 위치를 고정합니다(시멘트가 파라핀 필름에만 닿도록).
6. 치과 용 시멘트가 마르면 필름을 제거하십시오.
7. 조립판과 미니스코프를 제거합니다. 치과용 시멘트 베이스는 속이 비어 있습니다(그림 4B).
8. 릴레이 렌즈를 일상적인 활동과 마우스에 의해 긁히지 않도록 보호하려면 릴레이 렌즈가 덮일 때까지 일부 몰딩 실리콘 고무로 릴레이 렌즈를 밀봉하고 실리콘 고무를 얇은 치과용 시멘트 층으로 덮습니다(그림 4B).
9. 입체 기구에서 마우스를 분리하고 마우스를 회복실에 넣습니다.
10. 감염을 예방하기 위해 진통제 및 세프 타지 딤 (25mg / kg, 피하 주사)에 카프로 펜 (5mg / kg, 피하 주사) 또는 멜 록시 캄 (1mg / kg, 피하 주사)을 주사하십시오.
  참고: 항생제 사용은 무균 기술의 대안이 아닙니다. 수술 전후 항생제 (즉, ceftazidime)는 장기 수술 또는 만성 임플란트 배치와 같은 특정 상황에서 표시 될 수 있습니다.
11. 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 관찰하십시오.
12. 하우스 마우스에 개별적으로 멜록시캄(1mg/kg, 피하 주사, q24h)을 일주일 동안 주사하여 수술 후 통증을 완화합니다. 수술 후 매일 동물을 확인하여 정상적으로 먹고, 마시고, 배변하고 있는지 확인하십시오.
13. 3 주 이상 후에 기본 도금을 수행하십시오.

3. 베이스 도금

참고: 일반적으로 기본 도금 절차(그림 5)는 회복 및 바이러스 배양 시간으로 인해 초기 절차 후 2-3주 이내에 수행할 수 없습니다. 베이스플레이팅을 위한 유도 절차는 2.1.1 내지 2.1.8단계에서 설명한 것과 유사하다. 그러나, 기초 도금은 침습적 인 절차가 아니며, 동물은 가벼운 진정 작용 만 필요합니다. 따라서 동물이 정위 프레임에서 움직일 수없는 한 0.8-1.2 % 이소 플루 란으로 충분합니다. 또한, 비교적 가벼운 이소플루란 마취는 또한 모니터링^동안 뉴런의 형광 과도 상태의 발현을 촉진하는 것을 도울 수 있다 8 (보충 비디오 S2).

뼈 rongeur로 치과 용 시멘트 지붕의 얇은 층을 조심스럽게 자르고 실리콘 고무를 제거하십시오. 릴레이 렌즈 표면을 75% 알코올로 청소합니다.
조립판 옆에 고정 나사를 고정하여 미니스코프 바닥에 고정합니다(그림 5A1).
알림: 베이스 플레이트는 조여진 베이스 플레이트와 가볍게 고정된 베이스 플레이트의 차이로 인해 거리가 일정하지 않을 수 있으므로 미니스코프 하단 아래에 단단히 조여야 합니다.
초점 슬라이드를 주 하우징에서 약 2.7 - 3mm 떨어진 곳으로 조정합니다(그림 5A2).
참고: 베이스 도금 절차 중에 길이를 추가로 조정할 수 있지만 미니스코프 길이와 이식된 릴레이 렌즈와 사전 고정된 대물 렌즈 사이의 최적 길이를 동시에 조정하는 것은 매우 혼란스럽기 때문에 약 2.7mm로 고정하십시오.
미니스코프를 데이터 수집 보드에 연결하고 컴퓨터의 USB 3.0(또는 버전 이상) 포트에 연결합니다.
UCLA 팀에서 개발한 데이터 수집 소프트웨어를 실행합니다.
노출을 255로, 게인을 64x로, 여기 LED를 5%로 조정합니다. 이러한 설정은 초기 베이스 도금에 권장됩니다. 구체적인 설정은 뇌 영역과 유 전적으로 암호화 된 칼슘 지표의 발현 수준에 따라 달라집니다.
연결 버튼을 클릭하여 미니스코프를 데이터 수집 소프트웨어에 연결하고 라이브 스트림을 시청합니다.
미니스코프 대물 렌즈를 릴레이 렌즈에 손으로 정렬하고 형광 신호 검색을 시작합니다(그림 5B₁).
참고: 처음에는 형광 신호를 수동으로 검색하면 조정이 용이합니다. AAV 시스템이 유전적으로 암호화된 칼슘 지시약을 발현하기 위해 사용되었기 때문에, 프로모터 유형 및 AAV 혈청형 모두 형질감염^23,24의 효율에 영향을 미쳤다. 연구자들은 향후 실험을 진행하기 전에 형광의 변화를 보여주는 개별 뉴런을 찾아 칼슘 지표의 발현을 확인해야 합니다.
미니 스코프를 막는 곳에 치과 용 시멘트를 뚫습니다 (선택 사항).
데이터 수집 소프트웨어의 라이브 스트림을 시청하고 릴레이 렌즈의 여백을 랜드마크로 사용하십시오(보충 비디오 S2). 릴레이 렌즈의 여백은 모니터에서 달과 같은 회색 원으로 나타납니다(그림 5B1, 흰색 화살표).
릴레이 렌즈가 발견되면 형광 신호가 발견 될 때까지 미니 스코프의 다양한 각도와 거리를 조심스럽게 조정하십시오.
참고: 뉴런의 이미지는 배경보다 흰색입니다. 정확한 뉴런 모양은 뉴런이 릴레이 렌즈의 초점면에 완벽하게 놓여 있음을 나타냅니다. 둥근 뉴런은 초점면 근처에 있었음을 시사합니다. 신경 모양은 뇌 전체에 걸쳐 다르며 여기서는 복부 CA1이 예로 표시됩니다.
개별 뉴런이 시간의 함수로 형광 변화를 나타내지 않으면 실리콘 고무로 베이스를 다시 밀봉합니다. 형광은 잠복기가 바이러스^23,24의 특성에 의존하기 때문에 관찰되지 않습니다. 추가 일주일 후에 3.1-3.12단계를 수행합니다. (선택 사항입니다).
미니스코프를 최적의 위치에 놓고 재사용 가능한 접착 점토가 있는 스테레오택시 암을 미니스코프 쪽으로 이동합니다(그림 5B2). 미니스코프를 재사용 가능한 접착 점토로 입체 팔에 부착하십시오.
x, y 및 z 암을 약간 조정하여 최상의 보기를 검색합니다(보조 비디오 S2). 그런 다음 z축에서 이어바, 톱니 바 또는 재사용 가능한 접착 점토를 돌려 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 표면 사이의 각도를 조정합니다. 바이러스 발현 및 수정체 이식은 적어도 하나의 세포가 형광 과도 현상을 나타낼 때 성공적이다 (도 6A; 보충 비디오 S2) 베이스 도금 중 (CA1과 같은 뇌 영역에 따라 다름).
주: 모니터에 흰색 셀만 표시되고 과도 상태는 표시되지 않으면 다른 원인이 있는 것입니다(그림 6B, C, 보충 비디오 S4, S5, 결과 섹션 및 문제 해결 섹션 참조).
베이스 플레이트(그림 5B2)를 치과용 시멘트로 시멘트로 만듭니다.
접합 중에 관심 영역을 모니터링하여 최적의 위치가 변경되지 않는지 확인하십시오.
베이스 플레이트를 치과용 시멘트 베이스에 단단히 접착하면서 가능한 한 적은 양의 시멘트를 사용합니다(그림 5B2). 베이스 플레이트 주위에 두 번째 및 세 번째 시멘트 층을 바르되 GRIN 렌즈에 영향을 미치지 않도록 주의하십시오.
알림: 베이스 플레이트에 시멘트를 적용하는 것은 더미 도금 절차 중에 베이스 플레이트의 베이스가 형성되었기 때문에 이 단계에서 더 쉽습니다.
시멘트가 경화 될 때베이스 플레이트에서 미니 스코프를 조심스럽게 분리하십시오. 그런 다음 보호 캡을 조입니다.
동물을 회복 케이지로 옮깁니다. 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 관찰하십시오.
하우스 마우스 개별적으로. 매일 정상적으로 먹고, 마시고, 배변하고 있는지 확인하십시오. 마우스가 완전히 회복 될 때까지 5 일 동안 기다린 다음 칼슘 이미징을 확인하십시오.
알림: 베이스 플레이트를 고정하는 치과용 시멘트는 소량뿐입니다. 따라서 베이스 도금 절차 이후 베이스 플레이트가 상당히 이동한 경우 드릴로 치과용 시멘트를 제거하고 베이스 도금 절차를 다시 수행하십시오.
모든 실험이 완료되면 케타민 (87 mg / kg) / 자일 라진 (13 mg / kg) 혼합물의 복강 내 주사에 의하여)하고 동물을 마취시키고²⁵ 동물을 관류합니다.

결과

치과용 시멘트 부피 변화 평가
경화 과정에서 치과용 시멘트의 부피가 변하기 때문에 GRIN 렌즈의 작동 거리가 약 50-350μm인^{경우 이미징} 품질에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다^4,8. 따라서이 경우 Tempron과 Tokuso라는 두 개의 시판 치과 용 시멘트가 이식 및베이스 도금 절차 전에 테스트되었습니다 (그림 5). 비디오를 먼...

토론

본 보고서는 2 렌즈 UCLA 미니 스코프 시스템을 사용하는 연구자를위한 상세한 실험 프로토콜을 설명합니다. 당사 프로토콜에서 설계된 도구는 생체 내 칼슘 이미징을 시도하려는 모든 실험실에 비교적 저렴합니다. 바이러스 주입, 렌즈 이식, 더미 베이스 도금 및 베이스 플레이팅과 같은 일부 프로토콜은 칼슘 이미징의 성공률을 향상시키기 위해 미니스코프 시스템의 다른 버전에도 사용할...

공개

이것은 업계에서 지원하는 연구가 아닙니다. 저자는 재정적 이해 상충이 없다고보고합니다.

감사의 말

이 작업은 대만 과학 기술부 (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2)의 지원을 받았습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7-mm drill bit	#19008-07	Fine Science Tools; USA	for surgery
0.1–10 μl pipette tips	104-Q; QSP	Fisher Scientific; Singapore	for testing dental cement
20 G IV cathater	#SR-OX2032CA	Terumo Corporation; Tokyo, Japan	for surgery
27 G needle	AGANI, AN*2713R	Terumo Corporation; Tokyo, Japan	for surgery
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE	#104487-AAV9; 1.5*10^13	Addgene viral prep; MA, USA	for viral injection
Atropine sulfate		Astart; Hsinchu, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Baseplate	V3	http://miniscope.org	for dummy baseplating/baseplating
BLU TACK	#30840350	Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA	Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating
Bone Rongeur Friedman	13 cm	Diener; Tuttlingen, Germany	for baseplating
Buprenorphine		INDIVIOR; UK	for surgery
Carprofen	Rimadyl	Zoetis; Exton, PA	analgesia
Ceftazidime		Taiwan Biotech; Taiwan	prevent infection
Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope	purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq		for baseplating
Dental cement set	Tempron	GC Corp; Tokyo, Japan	for testing dental cement
Dental cement set	Tokuso Curefast	Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan	for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating
Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors	#51673	Stoelting Co; Illinois, USA	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Duratear ointment		Alcon; Geneva, Switzerland	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Ibuprofen		YungShin; Taiwan	analgesia
Isoflurane		Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Inscopix	nVista System	Inscopix; Palo Alto, CA	for comparison with V3 UCLA Miniscope
Ketamine		Pfizer; NY, NY	for euthanasia
Normal saline			for surgery
Micro bulldog clamps	#12.102.04	Dimedo; Tuttlingen, Germany	for lens implantation
Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge	#88400	Hamilton; Bonaduz, Switzerland	for viral injection
Molding silicone rubber	ZA22 Thixo	Zhermack; Badia Polesine, Italy	for dummy baseplating
Objective Gradient index (GRIN) lens	#64519	Edmund Optics; NJ, USA	for dummy baseplating/baseplating
Parafilm	#PM996	Bemis; Neenah, USA	for dummy baseplating
Portable Suction	#DF-750	Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan	for surgery
Relay GRIN lens	#1050-002177	Inscopix; Palo Alto, CA, USA	for dummy baseplating/baseplating
Stainless steel anchor screws	1.00 mm diameter, total length 3.00 mm		for surgery
Stereo microscope	#SL720	Sage Vison; New Taipei City, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Stereotaxic apparatus	#51673	Stoelting; IL, USA	for surgery/dummy baseplating/baseplating
UV Cure Adhesive	#3321	Loctite; Düsseldorf, Germany	for testing dental cement
V3 UCLA Miniscope	purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components		for surgery/dummy baseplating/baseplating
Xylazine	X1126	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	for euthanasia
Xylocaine pump spray 10%		AstraZeneca; Södertälje, Sweden	for surgery

참고문헌

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