שימוש בציפוי בסיס ובמיניסקופ מעוגן מראש עם עדשה אובייקטיבית למחקר חולף בסידן בעכברים

Yi-Tse Hsiao; Angela Yu-Chi Wang; Ting-Yen Lee; Ching-Yuan Chang

doi:10.3791/62611

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Method Article

שימוש בציפוי בסיס ובמיניסקופ מעוגן מראש עם עדשה אובייקטיבית למחקר חולף בסידן בעכברים

DOI:

10.3791/62611

⸱

June 5th, 2021

Yi-Tse Hsiao¹, Angela Yu-Chi Wang¹, Ting-Yen Lee¹, Ching-Yuan Chang¹

¹Department of Veterinary Medicine, School of Veterinary Medicine, National Taiwan University

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Summary

התכווצות המלט הדנטלי במהלך הריפוי מחליפה את לוחית הבסיס. פרוטוקול זה ממזער את הבעיה על ידי יצירת בסיס ראשוני של המלט הדנטלי שמשאיר מקום למלט את לוח הבסיס. שבועות לאחר מכן, ניתן לקבע את לוח הבסיס במקומו על פיגום זה באמצעות מלט חדש קטן, ובכך להפחית את התכווצותו.

Abstract

מדעני מוח משתמשים במיקרוסקופים זעירים (מיניסקופים) כדי לצפות בפעילות עצבית אצל בעלי חיים המתנהגים בחופשיות. צוות המיניסקופים של אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס (UCLA) מספק משאבים פתוחים לחוקרים לבנות מיניסקופים בעצמם. V3 UCLA Miniscope הוא אחד המיניסקופים הפופולריים ביותר בקוד פתוח הנמצאים כיום בשימוש. הוא מאפשר הדמיה של הארעיות הפלואורסצנטית הנפלטת מתאי עצב מהונדסים גנטית דרך עדשה אובייקטיבית המושתלת בקליפת המוח השטחית (מערכת בעלת עדשה אחת), או באזורים עמוקים במוח באמצעות שילוב של עדשת ממסר המושתלת במוח העמוק ועדשה אובייקטיבית המעוגנת מראש במיניסקופ כדי לצפות בתמונה המועברת (מערכת בעלת שתי עדשות). אפילו בתנאים אופטימליים (כאשר תאי עצב מבטאים מחוונים פלואורסצנטיים ועדשת הממסר הושתלה כראוי), שינוי נפח של מלט השיניים בין לוחית הבסיס לבין חיבורו לגולגולת בעת ריפוי צמנטי יכול לגרום לחוסר התאמה עם מרחק שונה בין עדשת המטרה לעדשת הממסר, וכתוצאה מכך איכות התמונה ירודה. לוח בסיס הוא לוח המסייע להרכיב את המיניסקופ על הגולגולת ומקבע את מרחק העבודה בין עדשת המטרה לעדשת הממסר. לפיכך, שינויים בנפח הצמנט הדנטלי סביב לוחית הבסיס משנים את המרחק בין העדשות. הפרוטוקול הנוכחי נועד למזער את בעיית חוסר ההתאמה הנגרמת כתוצאה משינויי נפח בצמנט הדנטלי. הפרוטוקול מפחית את חוסר ההתאמה על ידי בניית בסיס ראשוני של מלט דנטלי במהלך השתלת עדשת ממסר. זמן ההחלמה לאחר ההשתלה מספיק לביסוס של צמנט דנטלי כדי לרפא את לוחית הבסיס לחלוטין, כך שניתן יהיה לקבע את פלטת הבסיס על פיגום זה באמצעות כמה שפחות מלט חדש. במאמר הנוכחי נתאר אסטרטגיות לציפוי בסיס בעכברים כדי לאפשר הדמיה של פעילות עצבית עם עדשה אובייקטיבית המעוגנת במיניסקופ.

Introduction

כתבי פעילות פלואורסצנטית אידיאליים להדמיה של הפעילות העצבית מכיוון שהם רגישים ויש להם טווחים דינמיים גדולים ^1,2,3. לכן, מספר גדל והולך של ניסויים משתמשים במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לצפות ישירות בפעילות העצבית 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ^,¹⁶. המיקרוסקופ הפלואורסצנטי הממוזער הראשון של פוטון אחד (מיניסקופ) תוכנן בשנת 2011 על ידי מארק שניצר ואחרים^. מיניסקופ זה מאפשר לחוקרים לעקוב אחר הדינמיקה הפלואורסצנטית של תאי המוח הקטן בבעלי חיים המתנהגים בחופשיות⁵ (כלומר, ללא כל ריסון פיזי, ריסון ראש, הרגעה או הרדמה לבעלי החיים). נכון לעכשיו, ניתן ליישם את הטכניקה כדי לפקח על אזורי מוח שטחיים כגון קליפת המוח 6,8,15,16; אזורים תת-קורטיקליים כגון ההיפוקמפוס הגבי 8,11,13,14 וסטריאטום ^6,17; ואזורי מוח עמוקים כגון היפוקמפוס הגחון 14, אמיגדלה 10,18 וההיפותלמוס ^8,12.

בשנים האחרונות פותחו מספר מיניסקופים בקוד פתוח⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁷^,¹⁹. החוקרים יכולים להרכיב את המינסקופ מבחינה כלכלית אם הם פועלים לפי ההנחיות שלב אחר שלב שסופקו על ידי צוות המיניסקופ של אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס (UCLA)⁴^,⁷^,¹¹^,¹³. מכיוון שניטור אופטי של פעילות עצבית מוגבל על ידי מגבלות העברת האור⁷ אל האוכלוסייה העצבית המעניינת וממנה, תוכנן מיניסקופ הדורש עיגון מראש של עדשת אינדקס שבירה הדרגתי אובייקטיבי (GRIN) (או עדשה אובייקטיבית) בתחתית המיניסקופ כדי להגדיל את שדה הראייה המועבר מעדשת GRIN ממסר (או עדשת ממסר)⁶^,⁷^,⁸^,¹⁰^,¹⁶^,¹⁷. עדשת ממסר זו מושתלת באזור מוח המטרה כך שהפעילות הפלואורסצנטית של אזור מוח המטרה מועברת על פני השטח של עדשת הממסר⁶^,⁷^,⁸^,¹⁰^,¹⁶^,¹⁷. בערך 1/4 מתקופה סינוסואידלית מלאה של אור עוברת דרך עדשת GRIN אובייקטיבית (~ 0.25 גובה) (איור 1A1), והתוצאה היא תמונה פלואורסצנטית מוגדלת⁶^,⁷. עדשת האובייקט לא תמיד קבועה בתחתית המיניסקופ וגם אין צורך בהשתלת עדשת הממסר⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵. באופן ספציפי, ישנן שתי תצורות: אחת עם עדשה אובייקטיבית קבועה במיניסקופ ועדשת ממסר המושתלת במוח⁸^,¹⁰^,¹²^,¹⁴^,¹⁶ (איור 1B1) ועוד אחת עם עדשה אובייקטיבית נשלפת בלבד⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵ (איור 1B2). בתכנון המבוסס על המטרה הקבועה ושילוב עדשת הממסר המושתלת, אותות הפלואורסצנטיות מהמוח מובאים לפני השטח העליונים של עדשת הממסר (איור 1A1)⁷^,⁸^,¹⁰^,¹²^,¹⁴^,¹⁶. לאחר מכן, עדשת האובייקט יכולה להגדיל ולשדר את שדה הראייה מהמשטח העליון של עדשת הממסר (איור 1A2). מצד שני, עיצוב עדשת GRIN אובייקטיבית נשלפת גמיש יותר, מה שאומר שהשתלה מוקדמת של עדשת ממסר למוח אינה חובה (איור 1B2)⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵. בעת שימוש במיניסקופ המבוסס על עיצוב עדשה אובייקטיבית נשלפת, החוקרים עדיין צריכים להשתיל עדשה באזור מוח המטרה, אך הם יכולים להשתיל עדשה אובייקטיבית⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵ או עדשת ממסר במוח⁶^,⁷. הבחירה של עדשת מטרה או עדשת ממסר להשתלה קובעת את תצורת המיניסקופ שבה על החוקר להשתמש. לדוגמה, V3 UCLA Miniscope מבוסס על עיצוב עדשת GRIN אובייקטיבית נשלפת. חוקרים יכולים לבחור אם להשתיל ישירות עדשה אובייקטיבית באזור המעניין במוח ולהרכיב את המיניסקופ "הריק" על עדשת האובייקט⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵ (מערכת עדשה אחת; איור 1B2) או להשתיל עדשת ממסר במוח ולהרכיב מיניסקופ המעוגן מראש בעדשה אובייקטיבית⁶^,⁷ (מערכת שתי עדשות; איור 1B1). לאחר מכן המיניסקופ פועל כמצלמת פלואורסצנטיות כדי ללכוד תמונות בשידור חי של פלואורסצנטיות עצבית המיוצרת על ידי מחוון סידן מקודד גנטית¹^,²^,³. לאחר חיבור המיניסקופ למחשב, ניתן להעביר תמונות פלואורסצנטיות אלה למחשב ולשמור אותן כקטעי וידאו. חוקרים יכולים לחקור את הפעילות העצבית על ידי ניתוח השינויים היחסיים בפלואורסצנטיות עם כמה חבילות ניתוח²⁰^,²¹ או לכתוב את הקודים שלהם לניתוח עתידי.

V3 UCLA Miniscope מספק למשתמשים גמישות להחליט אם לצלם פעילות עצבית^{עם מערכת} עדשה אחת או שתיים 7. בחירת מערכת ההקלטה מבוססת על עומק וגודל אזור המטרה במוח. בקצרה, מערכת עדשה אחת יכולה לצלם רק שטח שטחי (פחות מ-2.5 מ"מ עומק) וגדול יחסית (גדול מכ-1.8 x 1.8 מ"מ²) מכיוון שהיצרנים מייצרים רק גודל מסוים של עדשה אובייקטיבית. לעומת זאת, מערכת של שתי עדשות יכולה להיות מיושמת על כל אזור במוח המטרה. עם זאת, צמנט השיניים להדבקת לוח הבסיס נוטה לגרום לחוסר התאמה עם מרחק משתנה בין עדשת המטרה לעדשת הממסר, וכתוצאה מכך איכות התמונה ירודה. אם משתמשים במערכת של שתי עדשות, יש למקד במדויק שני מרחקי עבודה כדי להשיג את איכות ההדמיה האופטימלית (איור 1A). שני מרחקי העבודה הקריטיים האלה הם בין תאי העצב והמשטח התחתון של עדשת הממסר, ובין המשטח העליון של עדשת הממסר לבין המשטח התחתון של עדשת המטרה (איור 1A1). כל אי-התאמה או מיקום שגוי של העדשה מחוץ למרחק העבודה גורמים לכשל בהדמיה (איור 1C2). לעומת זאת, מערכת עדשה אחת דורשת מרחק עבודה מדויק אחד בלבד. עם זאת, גודל העדשה האובייקטיבית מגביל את היישום שלה לניטור אזורי מוח עמוקים (עדשת האובייקט המתאימה למיניסקופ היא בערך 1.8 ~ 2.0 מ"מ 6,11,13,15). לכן, השתלת עדשה אובייקטיבית מוגבלת לתצפית על פני השטח ואזורי מוח גדולים יחסית, כגון קליפת המוח 6,15 ו dorsal cornu ammonis 1 (CA1) בעכברים^11,13 . בנוסף, יש לשאוף שטח גדול של קליפת המוח כדי לכוון ל-CA1^11,13 הגבי. בגלל המגבלה של תצורת עדשה אחת המונעת הדמיה של אזורי מוח עמוקים, מערכות מיניסקופ מסחריות מציעות רק עיצוב משולב של עדשה אובייקטיבית/עדשת ממסר (שתי עדשות). מצד שני, ניתן לשנות את המיניסקופ V3 UCLA למערכת עדשה אחת או שתי עדשות מכיוון שהעדשה האובייקטיבית שלו ניתנת להסרה 6,11,13,15. במילים אחרות, משתמשי V3 UCLA miniscope יכולים לנצל את העדשה הנשלפת על ידי השתלתה במוח (יצירת מערכת עדשה אחת), בעת ביצוע ניסויים הכוללים תצפיות מוח שטחיות (פחות מ -2.5 מ"מ עומק), או על ידי עיגון מראש שלה במיניסקופ והשתלת עדשת ממסר במוח (יצירת מערכת שתי עדשות), בעת ביצוע ניסויים הכוללים תצפיות מוח עמוקות. ניתן ליישם את מערכת שתי העדשות גם לצורך התבוננות שטחית במוח, אך על החוקר לדעת את מרחקי העבודה המדויקים בין עדשת האובייקט לעדשת הממסר. היתרון העיקרי של מערכת עם עדשה אחת הוא שיש סיכוי נמוך יותר לפספס את מרחקי העבודה מאשר במערכת עם שתי עדשות, בהתחשב בכך שיש שני מרחקי עבודה שצריך לכוון אליהם במדויק כדי להשיג איכות הדמיה אופטימלית במערכת של שתי עדשות (איור 1A). לכן, אנו ממליצים להשתמש במערכת עדשה אחת לתצפיות מוח שטחיות. עם זאת, אם הניסוי דורש הדמיה באזור המוח העמוק, על החוקר ללמוד להימנע מחוסר התאמה של שתי העדשות.

הפרוטוקול הבסיסי לתצורת שתי עדשות של מיניסקופים לניסויים כולל השתלת עדשה וציפוי בסיס 8,10,16,17. ציפוי בסיס הוא הדבקה של לוחית בסיס על ראשה של חיה כך שהמיניסקופ יכול בסופו של דבר להיות מותקן על גבי החיה ולצלם בווידיאו את אותות הפלואורסצנטיות של תאי עצב (איור 1B). הליך זה כולל שימוש במלט דנטלי כדי להדביק את לוחית הבסיס על הגולגולת (איור 1C), אולם התכווצות של מלט דנטלי יכולה לגרום לשינויים בלתי מתקבלים על הדעת במרחק בין עדשת הממסר המושתלת לעדשת האובייקט ^8,17. אם המרחק המוסט בין שתי העדשות גדול מדי, לא ניתן להביא תאים למיקוד.

פרוטוקולים מפורטים לניסויי דימות סידן בעומק המוח באמצעות מיניסקופים כבר פורסמו⁸^,¹⁰^,¹⁶^,¹⁷. מחברי פרוטוקולים אלה השתמשו במערכת Inscopix⁸^,¹⁰^,¹⁶ או עיצובים מותאמים אישית אחרים¹⁷ ותיארו את ההליכים הניסיוניים לברירה ויראלית, ניתוח וחיבור לוחית בסיס. עם זאת, לא ניתן ליישם את הפרוטוקולים שלהם במדויק על מערכות קוד פתוח אחרות, כגון מערכת V3 UCLA Miniscope, NINscope⁶ופינצ'סקופ.,¹⁹. חוסר התאמה של שתי העדשות יכול להתרחש במהלך ההקלטה בתצורה של שתי עדשות עם UCLA Miniscope עקב סוג של מלט דנטלי המשמש להצמדת לוחית הבסיס לגולגולת⁸^,¹⁷ (איור 1C). הפרוטוקול הנוכחי נחוץ מכיוון שהמרחק בין עדשת הממסר המושתלת לעדשת האובייקט נוטה להשתנות עקב התכווצות לא רצויה של מלט דנטלי במהלך הליך ציפוי הבסיס. במהלך ציפוי הבסיס, יש למצוא את מרחק העבודה האופטימלי בין עדשת הממסר המושתלת לבין עדשת האובייקט על ידי התאמת המרחק בין המיניסקופ לחלק העליון של עדשת הממסר, ולאחר מכן יש להדביק את לוח הבסיס במיקום אידיאלי זה. לאחר קביעת המרחק הנכון בין עדשת האובייקט לעדשת הממסר המושתלת, ניתן לקבל מדידות אורך ברזולוציה תאית (איור 1B; in vivo הקלטה). מכיוון שהטווח האופטימלי של מרחקי עבודה של עדשת ממסר הוא קטן (50 - 350 מיקרומטר)⁴^,⁸התכווצות צמנט מוגזמת במהלך הריפוי עלולה להקשות על שמירת עדשת האובייקט ועדשת הממסר המושתלת בטווח המתאים., מטרת העל של דו"ח זה היא לספק פרוטוקול לצמצום בעיות ההתכווצות⁸^,¹⁷ המתרחשים במהלך הליך ציפוי הבסיס וכדי להגדיל את שיעור ההצלחה של הקלטות מיניסקופ של אותות פלואורסצנטיים בתצורה של שתי עדשות. הקלטה מוצלחת של מיניסקופ מוגדרת כהקלטה של שידור חי של שינויים יחסיים ניכרים בפלואורסצנטיות של נוירונים בודדים בחיה המתנהגת בחופשיות. למרות שלמותגים שונים של מלט דנטלי יש שיעורי התכווצות שונים, חוקרים יכולים לבחור מותג שנבדק בעבר⁶^,⁷^,⁸^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,²². עם זאת, לא כל מותג קל להשגה במדינות / אזורים מסוימים בשל תקנות היבוא של חומרים רפואיים. לכן, פיתחנו שיטות לבדוק את שיעורי ההתכווצות של צמנטים דנטליים זמינים, וחשוב לספק פרוטוקול חלופי הממזער את בעיית ההתכווצות. היתרון על פני פרוטוקול ציפוי הבסיס הנוכחי הוא עלייה בשיעור ההצלחה של הדמיית סידן עם כלים וצמנט שניתן להשיג בקלות במעבדות. המינסקופ של UCLA משמש כדוגמה, אך הפרוטוקול חל גם על מיניסקופים אחרים. בדוח זה, אנו מתארים הליך ממוטב של ציפוי בסיס וגם ממליצים על כמה אסטרטגיות להתאמת מערכת שתי עדשות המיניסקופ של UCLA (איור 2A). שתי דוגמאות להשתלה מוצלחת (n = 3 עכברים) ודוגמאות להשתלה כושלת (n = 2 עכברים) עבור תצורת שתי עדשות עם המיניסקופ של UCLA מוצגות יחד עם הדיונים מסיבות ההצלחות והכישלונות.

Protocol

כל ההליכים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה הלאומית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת טייוואן (אישור מספר: NTU-109-EL-00029 ו- NTU-108-EL-00158).

1. הערכת שינוי נפח של צמנט דנטלי

הערה: שינויים בנפח הצמנט הדנטלי מתרחשים במהלך תהליך הריפוי. בדוק את שינויי הנפח של צמנט דנטלי לפני ההשתלה וציפוי הבסיס. חוקרים יכולים לבדוק כל מותג של מלט דנטלי ולהשתמש במותג עם שינוי הנפח הנמוך ביותר כדי לקבע את לוח הבסיס. דוגמה לכך מוצגת באיור 3.

שוקלים 0.5 גרם מכל אבקת מלט דנטלית ומערבבים אותה עם התמיסה המתאימה לה (1 מ"ל).
הערה: יחס אבקה/נוזל המומלץ בהוראות צמנט דנטלי הוא 0.5 גרם אבקה עד 0.25 מ"ל של התמיסה לקבלת צורה מוצקה. פרוטוקול בדיקה זה מדלל את היחס ל -0.5 גרם / מ"ל כך שניתן לשאוף את התערובת בצורה נוזלית על מנת למדוד את שינוי הנפח בקצות פיפטה.
השתמש בקצות פיפטה 0.1-10 μL כדי להסיר 2.5 μL מתערובת המלט הדנטלית, ולאחר מכן אטם את קצה פיפטה עם דבק מרפא קל.
הניחו את הקצוות על מתלה, סמנו את המפלסים העליונים ביותר של תערובת הצמנט הדנטלי ומדדו את רמת תערובת הצמנט הדנטלי לאחר 40 דקות (סרטון משלים S1).
בנוסף למעקב אחר שינויי המפלס במהלך ריפוי הצמנט הדנטלי בקצוות, מדדו את צפיפות הצמנט הדנטלי היבש שנותרה. כדי לחשב את הצפיפות, למדוד את משקל הצמנט הדנטלי ולמדוד את הנפח עם עקרון ארכימדס.
1. בקיצור, מניחים את שארית המלט הדנטלי היבש בכוס מלאה במים, ושוקלים את המים שעולים על גדותיהם.
השתמש במלט הדנטלי עם התכווצות מינימלית עבור כל הפרוטוקולים המפורטים להלן.

2. הרדמה, השתלה כירורגית, הזרקה ויראלית וציפוי בסיס דמה

הרדמה
הערה: הדו"ח הנוכחי נועד לייעל את הליך הניתוח וציפוי הבסיס עבור המינסקופ של UCLA; לכן, ההנחה הייתה כי הטיטר הנגיפי האופטימלי להדבקת אזורי המטרה במוח היה ידוע. את השיטות למציאת הטיטר הנגיפי האופטימלי ניתן למצוא בשלבים 1 עד 5 של Resendez et al.⁸. לאחר שהדילול הנגיפי עבר אופטימיזציה, ניתן להתחיל בהשתלה כירורגית.
1. הכניסו את העכבר למיכל אינדוקציה וספקו חמצן (100% בקצב זרימת אוויר של 0.2 ליטר/דקה). Preoxygenate העכבר במשך 5 עד 10 דקות.
2. יש לתת 5% איזופלורן מעורבב עם 100% חמצן (קצב זרימת אוויר: 0.2 ליטר/דקה) עד שהעכבר מתחיל לאבד את שיווי משקלו ובסופו של דבר מורדם.
3. הסר את העכבר מתא ההשראות והזריק אטרופין (0.04 מ"ג / ק"ג; הזרקה תת עורית), כדי למנוע הצטברות של רוק ובופרנורפין (0.03 מ"ג / ק"ג; הזרקה תת עורית) כמשכך כאבים.
4. לגלח את ראשו של העכבר.
5. יש לעטות מסכה, חלוק סטרילי וכפפות. הכינו חלל סטרילי וכלי ניתוח סטריליים לניתוח. ייצב את ראש העכבר (לשמור על הרדמה עם 3 עד 2.5% isoflurane במהלך שלב זה) על המכשיר stereotaxic. לאחר הליכי משככי כאבים והרדמה, ודא כי מוטות האוזניים מייצבים היטב את הראש. ספק תמיכה תרמית.
6. ודא כי הראש מוגדר במצב ישר, לעקר את הראש מגולח עם betadine, ולאחר מכן לרסס את הראש עם xylocaine (10%), משכך כאבים מקומי.
7. החל משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש.
  הערה: השתמש במשחת עיניים להגנה על העיניים במהלך כל אירועי ההרדמה כדי למנוע פגיעה עינית.
8. בדוק את רפלקס הכאב העמוק של בעל החיים על ידי צביטת כפו האחורית. ברגע שהחיה לא מראה רפלקס נסיגה מכפות, המשיכו בהליכים כירורגיים.
9. בצע חתך קטן לאורך מישור הקשת האמצעית של הגולגולת (החל מכ-2 מ"מ קדמי לברגמה וכלה כ-6 מ"מ אחורי לברגמה). לאחר מכן, נקו את רקמת החיבור בגולגולת, ועגנו שלושה ברגי נירוסטה לעצמות הקדמיות והאינטרקודקודיות השמאליות.
  1. בשלב זה, להפחית את isoflurane ל 1-2%. עקוב אחר קצב הנשימה במהלך כל ההליך הכירורגי. אם קצב הנשימה איטי מדי (כ-1/s, תלוי בבעל החיים), יש להפחית את ריכוז האיזופלורן.
10. ביצוע קרניוטומיה להשתלת עדשת הממסר תחת מיקרוסקופ כירורגי או סטריאומיקרוסקופ באמצעות מקדח בור בקוטר קצה 0.7 מ"מ. השתמש במיקרו-מקדחה כדי לתפוס את מקדח הבור ולצייר קווי מתאר של אזור המעגל המיועד (אין צורך לחדור את העובי המלא של הקלבריום).
  הערה: עדשת הממסר המשמשת בפרוטוקול הנוכחי הייתה בקוטר של 1.0 מ"מ, אורך ~ 9.0 מ"מ גובה של 1, וטווח מרחק עבודה של ~ 100 מיקרומטר - 300 מיקרומטר; לכן, craniotomy היה בקוטר של 1.2 מ"מ.
  1. להעמיק בעדינות את קווי המתאר עד לחשיפת הדורה.
  2. מכינים 3 מ"ל מלח סטרילי במזרק 3 מ"ל ומקררים אותו בדלי קרח. לעתים קרובות לשטוף את האזור החשוף עם 0.1 מ"ל של מלח מן המזרק כדי לקרר את האזור ולמנוע נזקי חום ודימום.
11. קוטפים קלות ומקלפים את הדורה בעזרת מחט 27 גרם.
12. שימו סימן על מחט קהה 27G במרחק של 1 מ"מ מהקצה והשתמשו בה כדי לשאוף בזהירות את קליפת המוח כדי ליצור חלון להשתלת עדשה 8,11,13,17 (איור 2B1). במידת הצורך, הכינו מחט קהה על ידי שחיקה של קצה מחט הזרקה 27 גרם עם נייר זכוכית. לאחר מכן, חברו את המחט למזרק, חברו את המזרק לצינור וחברו את הצינור למקור יניקה ליצירת ואקום.
  הערה: עדשת הממסר קהה ותדחוס את רקמת המוח כאשר היא ממוקמת באזור המוח העמוק. לפיכך, שאיפה של קליפת המוח מפחיתה נזק לרקמות עקב השתלת עדשת ממסר. עובי קליפת המוח הוא כ-1 מ"מ בעכברים, אך קשה לדמיין אותה תחת סטריאומיקרוסקופ. הסימן יוצר נקודת ציון המאפשרת לקבוע את עומק המחט בצורה מדויקת יותר מאשר במיקרוסקופ בלבד. בנוסף, ניתן לקבוע אם אזור קליפת המוח הגיע או עבר בהתאם להתנגדות; החלק העליון של קליפת המוח מרגיש רך יחסית, בעוד שהאזור התת-קליפתי מרגיש צפוף. לכן, ברגע שהמרקם מתחיל להרגיש צפוף יותר, הפסיקו את השאיפה (איור 2B3).
13. מכינים 3 מ"ל מלח סטרילי במזרק 3 מ"ל ומקררים אותו בדלי קרח. לשטוף את האזור עם מלוחים כדי לעצור את הדימום ולהקטין את האפשרות של בצקת המוח.
הזרקת וירוס הקשור לאדנו (AAV)
הערה: AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE שימש בניסוי הנוכחי. jGCaMP7s הוא אינדיקטור סידן מקודד גנטית הפולט פלואורסצנטיות ירוקה³. מכיוון שהמחקר הנוכחי השתמש בעכבר מסוג פרא כנבדק, היה צורך בווקטור נגיפי כדי להדביק את תאי העצב בגן מחוון הסידן הפלואורסצנטי הירוק ולאפשר את הביטוי. חוקרים המשתמשים בעכברים טרנסגניים המבטאים את מחוון הסידן הירוק-פלואורסצנטי כנבדקים שלהם יכולים לדלג על פרוטוקול 2.2.
1. הרכיבו את המחט הפנימית של צנתר תוך ורידי 20G (i.v.) על הזרוע הסטריאוטקסית ונקבו באיטיות (~100 - 200 מיקרומטר לדקה) את המוח בקואורדינטות המתאימות (אותן קואורדינטות המשמשות במהלך השתלת עדשת ממסר) (איור 2B3).
2. מורידים את מחט המיקרו-הזרקה במהירות של 100-200 מיקרומטר לדקה לתוך CA1 הגחוני ומחדירים (~ 25 nL/min) 200 nL של וקטור הנגיף לאזור המטרה (-3.16 מ"מ AP, 3.25 מ"מ ML ו--3.50 מ"מ DV מהברגמה).
3. המתן 10 דקות כדי לאפשר לווירוס להתפזר ולמזער את הזרימה חזרה.
4. משוך (~ 100-200 מיקרומטר / דקה) את מחט המיקרו-הזרקה.
השתלת עדשת ממסר
1. יש לחטא את עדשת הממסר עם 75% אלכוהול^10,16 ולאחר מכן לשטוף במי מלח ללא פירוגן. משרים את העדשה במי מלח קרים ללא פירוגן עד להשתלה.
  הערה: עדשה קרה ממזערת בצקת במוח כאשר היא ממוקמת במוח.
2. החזיקו את עדשת הממסר באמצעות מהדק מיקרו-בולדוג (איור 2B3) ששיניו כוסו בצינורות מתכווצים בחום.
  הערה: מהדק הבולדוג יכול להחזיק היטב את העדשה מבלי לפגוע בה. עיין Resendez et ^al.8 עבור השיטה להפוך את מהדק בולדוג מכוסה אבובים.
3. מקם באיטיות (~ 100 - 200 מיקרומטר לדקה) את עדשת הממסר על גבי אזור המטרה (-3.16 מ"מ AP, 3.50 מ"מ ML ו- -3.50 מ"מ DV מהברגמה) וייצב אותה עם מלט דנטלי.
ציפוי בסיס דמה
הערה: מטרת "ציפוי בסיס דמה" במהלך ניתוח ההשתלה היא ליצור בסיס צמנט דנטלי על מנת להפחית את כמות המלט הדנטלי שיש למרוח במהלך הליך ציפוי הבסיס האמיתי מספר שבועות לאחר מכן. באופן זה ממוזער הסיכון לשינוי בנפח הצמנט הדנטלי.
1. הדקו את עדשת האובייקטיבי בתחתית המיניסקופ והרכיבו את לוח הבסיס על המיניסקופ (בשלב זה, הרכבת עדשת המטרה, לוח הבסיס והמיניסקופ המעוגנים טרם הונחה מעל גולגולת העכבר).
2. עטפו 10 ס"מ של סרט פרפין סביב החלק החיצוני של לוח הבסיס (איור 4A).
3. החזיקו את המיניסקופ עם בדיקת הזרוע הסטריאוטקסית באמצעות חימר דבק רב פעמי.
4. יישרו את עדשת האובייקט על גבי עדשת הממסר עם רווח קטן ככל האפשר בין העדשות (איור 4B).
5. השתמשו במלט דנטלי כדי לאבטח את מיקום לוחית הבסיס (כך שהמלט נוגע רק בסרט הפרפין).
6. כאשר המלט הדנטלי התייבש, הסירו את הסרט.
7. הסר את לוח הבסיס ואת המיניסקוף. בסיס הצמנט הדנטלי חלול (איור 4B).
8. כדי להגן על עדשת הממסר מפני פעילויות יומיומיות ומפני שריטות על-ידי העכבר, אטמו את עדשת הממסר עם מעט גומי סיליקון יציקה עד לכיסוי עדשת הממסר, וכסו את גומי הסיליקון בשכבה דקה של מלט דנטלי (איור 4B).
9. נתקו את העכבר מהמכשירים הסטריאוטקסיים והכניסו את העכבר לתא התאוששות.
10. הזריקו קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג; הזרקה תת-עורית) או מלוקסיקאם (1 מ"ג/ק"ג; הזרקה תת-עורית) לשיכוך כאבים וצפטזידים (25 מ"ג/ק"ג; הזרקה תת-עורית) למניעת זיהום.
  הערה: השימוש באנטיביוטיקה אינו חלופה לטכניקה אספטית. אנטיביוטיקה פרי-ניתוחית (כלומר, ceftazidime) עשויה להיות מסומנת בנסיבות מסוימות, כגון ניתוחים ארוכי טווח או מיקום של שתלים כרוניים.
11. התבוננו בחיה עד שהיא חוזרת להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה.
12. עכברי בית בנפרד ומזריקים meloxicam (1 מ"ג / ק"ג; הזרקה תת עורית; q24h) במשך שבוע כדי להקל על כאבים לאחר הניתוח. בדוק את בעל החיים כל יום לאחר הניתוח כדי לוודא שהוא אוכל, שותה ועושה את צרכיו כרגיל.
13. בצע ציפוי בסיס לאחר 3 שבועות או יותר.

3. ציפוי בסיס

הערה: בדרך כלל, לא ניתן לבצע את הליך ציפוי הבסיס (איור 5) תוך 2-3 שבועות מההליך הראשוני עקב זמן ההתאוששות והדגירה הנגיפית. הליכי האינדוקציה עבור ציפוי בסיס דומים לאלה המתוארים בשלבים 2.1.1 עד 2.1.8. עם זאת, ציפוי בסיס אינו הליך פולשני, ובעל החיים דורש רק טשטוש קל. לכן, 0.8-1.2% isoflurane מספיק, כל עוד החיה לא יכול לנוע על מסגרת סטריאוטקסית. בנוסף, הרדמה איזופלורנית קלה יחסית יכולה גם לעזור להקל על ביטוי הארעיות הפלואורסצנטית של נוירונים במהלך ניטור⁸ (וידאו משלים S2).

חותכים בזהירות את השכבה הדקה של גג הבטון הדנטלי עם רונגור עצם ומסירים את גומי הסיליקון. נקו את פני השטח של עדשת הממסר עם 75% אלכוהול.
הדקו בורג קבוע לצד לוח הבסיס כדי לקבע אותו לתחתית המיניסקופ (איור 5A1).
הערה: יש להדק היטב את לוח הבסיס מתחת לתחתית המיניסקוף, מכיוון שההבדל בין לוח בסיס מהודק ללוח בסיס מהודק קלות עלול לגרום למרחק לא עקבי.
כוונן את שקופית המיקוד כך שתהיה במרחק של כ- 2.7 - 3 מ"מ מהמארז הראשי (איור 5A2).
הערה: למרות שניתן לכוונן את האורך עוד יותר במהלך הליך ציפוי הבסיס, קבע אותו לכ- 2.7 מ"מ, מכיוון שהתאמת אורך המיניסקופ והאורך האופטימלי בין עדשת הממסר המושתלת לעדשה האובייקטיבית המעוגנת מראש מבלבלת מאוד.
חבר את המיניסקופ ללוח איסוף הנתונים וחבר אותו ליציאת USB 3.0 (או גירסה מתקדמת יותר) במחשב.
הפעל את תוכנת רכישת הנתונים שפותחה על ידי צוות UCLA.
התאם את החשיפה ל- 255, את הרווח ל- 64x ואת נורית העירור ל- 5%. הגדרות אלה מומלצות לציפוי בסיס ראשוני; ההגדרות הספציפיות ישתנו בהתאם לאזורי המוח ולרמות הביטוי של מחוון הסידן המקודד גנטית.
לחץ על לחצן התחבר כדי לחבר את המיניסקופ לתוכנת איסוף הנתונים ולצפות בשידור החי.
ישרו את עדשת המיניסקופ האובייקטיבית לעדשת הממסר ביד והתחילו לחפש את אותות הפלואורסצנטיות (איור 5B₁).
הערה: בתחילה, חיפוש ידני של אות הפלואורסצנטיות מאפשר התאמות. מכיוון שנעשה שימוש במערכת AAV כדי לבטא את מחוון הסידן המקודד גנטית, הן סוג המקדם והן הסרוטיפ AAV השפיעו על יעילות הטרנספקציה^23,24. חוקרים צריכים לבדוק את הביטוי של מחוון הסידן על ידי מציאת נוירונים בודדים המראים שינויים פלואורסצנטיים לפני שימשיכו בניסויים עתידיים.
קדח את המלט הדנטלי בכל מקום שבו הוא חוסם את המיניסקופ (אופציונלי).
צפה בשידור החי של תוכנת רכישת הנתונים והשתמש בשולי עדשת הממסר כציון דרך (סרטון משלים S2). השוליים של עדשת הממסר נראים כעיגול אפור דמוי ירח על הצג (איור 5B1; חיצים לבנים).
לאחר מציאת עדשת הממסר, כוונן בזהירות את הזוויות והמרחקים השונים של המיניסקופ עד למציאת אותות הפלואורסצנטיים.
הערה: התמונות של תאי העצב לבנות יותר מהרקע. צורה עצבית מדויקת מצביעה על כך שהנוירונים שוכבים בצורה מושלמת על מישור המוקד של עדשת הממסר. תאי עצב עגולים מצביעים על כך שהם היו קרובים למישור המוקד. הצורה העצבית שונה ברחבי המוח, כאן CA1 הגחוני מוצג כדוגמה.
אם אף תא עצב לא מציג שינויים בפלואורסצנטיות כפונקציה של הזמן, אטמו מחדש את הבסיס עם גומי סיליקון. פלואורסצנטיות אינה נצפתה מכיוון שתקופת הדגירה תלויה גם ברכוש הנגיף^23,24. בצע את שלבים 3.1-3.12 לאחר שבוע נוסף. (זה אופציונלי).
החזיקו את המיניסקופ במיקום האופטימלי והזיזו את הזרוע הסטריאוטקסית עם חימר דבק לשימוש חוזר לכיוון המיניסקופ (איור 5B2). הצמידו את המיניסקופ לזרוע הסטריאוטקסית בעזרת חימר דבק רב פעמי.
כוונן מעט את זרועות x, y ו- z כדי לחפש את התצוגה הטובה ביותר (סרטון משלים S2). לאחר מכן, התאימו את הזווית בין פני השטח של עדשת האובייקט לבין עדשת הממסר על ידי סיבוב מוט האוזן, מוט השן או חימר דבק לשימוש חוזר על ציר z. ביטוי נגיפי והשתלת עדשה מוצלחים כאשר לפחות תא אחד מציג ארעיות פלואורסצנטית (איור 6A; וידאו משלים S2) במהלך ציפוי הבסיס (אשר תלוי גם באזור המוח, כגון CA1).
הערה: אם הצג מציג רק תאים לבנים אך לא ארעיים, קיימת סיבה נוספת (ראה איור 6B,C, סרטונים משלימים S4,S5, המקטע תוצאות ומקטע פתרון בעיות).
צמנט את לוחית הבסיס (איור 5B2) עם מלט דנטלי.
עקוב אחר אזור העניין במהלך המלט כדי להבטיח שהמיקום האופטימלי אינו משתנה.
השתמשו בכמות הקטנה ביותר האפשרית של מלט תוך הדבקה חזקה של לוחית הבסיס על בסיס המלט הדנטלי (איור 5B2). מרחו שכבה שנייה ושלישית של מלט סביב לוח הבסיס אך היזהרו שלא להשפיע על עדשת GRIN.
הערה: מריחת מלט על לוח הבסיס קלה יותר בשלב זה מכיוון שבסיס לוח הבסיס נוצר במהלך הליך ציפוי הדמה.
נתקו בזהירות את המיניסקופ מלוח הבסיס כאשר המלט נרפא. לאחר מכן, הברג את מכסה המגן.
העבירו את בעל החיים לכלוב התאוששות. התבוננו בחיה עד שהיא חוזרת להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה.
עכברי בית בנפרד. ודאו שהוא אוכל, שותה ועושה את צרכיו כרגיל בכל יום. המתן 5 ימים עד שהעכבר יתאושש לחלוטין ולאחר מכן בדוק את הדמיית הסידן.
הערה: יש רק כמות קטנה של מלט דנטלי המחזיק את לוחית הבסיס. לכן, אם לוחית הבסיס זזה במידה ניכרת מאז הליך ציפוי הבסיס, הסר את המלט הדנטלי באמצעות מקדחה בצע שוב את הליך ציפוי הבסיס.
מרדימים (על ידי הזרקה תוך צפקית של קטמין (87 מ"ג / ק"ג) / קסילזין (13 מ"ג / ק"ג) תערובת) ומנקבים²⁵ את החיה כאשר כל הניסויים נעשים.

תוצאות

הערכת שינוי נפח הצמנט הדנטלי
מכיוון שנפח הצמנט הדנטלי משתנה במהלך תהליך הריפוי, זה עשוי להשפיע באופן משמעותי על איכות ההדמיה, בהתחשב בכך שמרחק העבודה של עדשת GRIN הוא בערך 50 עד 350 מיקרומטר ^4,8. לכן, שני צמנטים דנטליים זמינים מסחרית נבדקו במקרה זה, טמפר...

Discussion

הדו"ח הנוכחי מתאר פרוטוקול ניסויי מפורט עבור חוקרים המשתמשים במערכת UCLA Miniscope בעלת שתי עדשות. הכלים שתוכננו בפרוטוקול שלנו הם זולים יחסית לכל מעבדה המעוניינת לנסות הדמיית סידן in vivo . פרוטוקולים מסוימים, כגון הזרקה ויראלית, השתלת עדשות, ציפוי בסיס דמה וציפוי בסיס, יכולים לשמש גם עבור גרס...

Disclosures

זה לא מחקר שנתמך על ידי התעשייה. המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים כספיים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7-mm drill bit	#19008-07	Fine Science Tools; USA	for surgery
0.1–10 μl pipette tips	104-Q; QSP	Fisher Scientific; Singapore	for testing dental cement
20 G IV cathater	#SR-OX2032CA	Terumo Corporation; Tokyo, Japan	for surgery
27 G needle	AGANI, AN*2713R	Terumo Corporation; Tokyo, Japan	for surgery
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE	#104487-AAV9; 1.5*10^13	Addgene viral prep; MA, USA	for viral injection
Atropine sulfate		Astart; Hsinchu, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Baseplate	V3	http://miniscope.org	for dummy baseplating/baseplating
BLU TACK	#30840350	Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA	Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating
Bone Rongeur Friedman	13 cm	Diener; Tuttlingen, Germany	for baseplating
Buprenorphine		INDIVIOR; UK	for surgery
Carprofen	Rimadyl	Zoetis; Exton, PA	analgesia
Ceftazidime		Taiwan Biotech; Taiwan	prevent infection
Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope	purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq		for baseplating
Dental cement set	Tempron	GC Corp; Tokyo, Japan	for testing dental cement
Dental cement set	Tokuso Curefast	Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan	for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating
Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors	#51673	Stoelting Co; Illinois, USA	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Duratear ointment		Alcon; Geneva, Switzerland	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Ibuprofen		YungShin; Taiwan	analgesia
Isoflurane		Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Inscopix	nVista System	Inscopix; Palo Alto, CA	for comparison with V3 UCLA Miniscope
Ketamine		Pfizer; NY, NY	for euthanasia
Normal saline			for surgery
Micro bulldog clamps	#12.102.04	Dimedo; Tuttlingen, Germany	for lens implantation
Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge	#88400	Hamilton; Bonaduz, Switzerland	for viral injection
Molding silicone rubber	ZA22 Thixo	Zhermack; Badia Polesine, Italy	for dummy baseplating
Objective Gradient index (GRIN) lens	#64519	Edmund Optics; NJ, USA	for dummy baseplating/baseplating
Parafilm	#PM996	Bemis; Neenah, USA	for dummy baseplating
Portable Suction	#DF-750	Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan	for surgery
Relay GRIN lens	#1050-002177	Inscopix; Palo Alto, CA, USA	for dummy baseplating/baseplating
Stainless steel anchor screws	1.00 mm diameter, total length 3.00 mm		for surgery
Stereo microscope	#SL720	Sage Vison; New Taipei City, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Stereotaxic apparatus	#51673	Stoelting; IL, USA	for surgery/dummy baseplating/baseplating
UV Cure Adhesive	#3321	Loctite; Düsseldorf, Germany	for testing dental cement
V3 UCLA Miniscope	purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components		for surgery/dummy baseplating/baseplating
Xylazine	X1126	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	for euthanasia
Xylocaine pump spray 10%		AstraZeneca; Södertälje, Sweden	for surgery

References

Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
Campos, P., Walker, J. J., Mollard, P. Diving into the brain: deep-brain imaging techniques in conscious animals. Journal of Endocrinology. 246 (2), 33-50 (2020).
Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
Aharoni, D., Hoogland, T. M. Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: past, present and future. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 141 (2019).
Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. Journal of Visualized Experiments. (162), e61659 (2020).
Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
Chen, K. S., et al. A hypothalamic switch for REM and Non-REM sleep. Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).
Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
Jimenez, J. C., et al. Anxiety cells in a hippocampal-hypothalamic circuit. Neuron. 97 (3), 670-683 (2018).
Hart, E. E., Blair, G. J., O'Dell, T. J., Blair, H. T., Izquierdo, A. Chemogenetic modulation and single-photon calcium imaging in anterior cingulate cortex reveal a mechanism for effort-based decisions. Journal of Neuroscience. , 2548 (2020).
Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (124), e55579 (2017).
Zhang, L., et al. Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
Liberti, W. A., Perkins, L. N., Leman, D. P., Gardner, T. J. An open source, wireless capable miniature microscope system. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045001 (2017).
Lu, J., et al. MIN1PIPE: A miniscope 1-photon-based calcium imaging signal extraction pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
Lee, A. K., Manns, I. D., Sakmann, B., Brecht, M. Whole-cell recordings in freely moving rats. Neuron. 51 (4), 399-407 (2006).
Burger, C., et al. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Molecular Therapy. 10 (2), 302-317 (2004).
Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Research. 1190, 15-22 (2008).
Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (1), 55-69 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

172 in vivo UCLA Miniscope baseplating

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated:

שימוש בציפוי בסיס ובמיניסקופ מעוגן מראש עם עדשה אובייקטיבית למחקר חולף בסידן בעכברים

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

תוצאות

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Explore More Articles