JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kürleme sırasında diş çimentosunun büzülmesi, taban plakasının yerini alır. Bu protokol, taban plakasını çimentolamak için yer bırakan diş çimentosunun ilk temelini oluşturarak sorunu en aza indirir. Haftalar sonra, taban plakası bu iskele üzerinde çok az yeni çimento kullanılarak yerinde çimentolanabilir, böylece büzülme azalır.

Özet

Sinirbilimciler, serbestçe davranan hayvanlarda nöronal aktiviteyi gözlemlemek için minyatür mikroskoplar (miniskoplar) kullanırlar. Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles (UCLA) Miniscope ekibi, araştırmacıların miniskopları kendileri oluşturmaları için açık kaynaklar sağlar. V3 UCLA Miniscope, şu anda kullanımda olan en popüler açık kaynaklı miniskoplardan biridir. Genetiği değiştirilmiş nöronlardan yayılan floresan geçicilerinin, yüzeysel korteks üzerine implante edilmiş objektif bir lens (tek lensli bir sistem) aracılığıyla veya derin beyin bölgelerinde, derin beyne implante edilmiş bir röle lensi ve aktarılan görüntüyü gözlemlemek için miniskopta önceden sabitlenmiş objektif bir lensin (iki lensli bir sistem) bir kombinasyonu yoluyla görüntülenmesine izin verir. En uygun koşullar altında bile (nöronlar floresan göstergelerini ifade ettiğinde ve röle lensi düzgün bir şekilde implante edildiğinde), taban plakası arasındaki diş çimentosunun hacimsel bir değişimi ve çimento kürlemesi üzerine kafatasına tutturulması, objektif ve röle lensleri arasındaki değişen bir mesafe ile yanlış hizalamalara neden olabilir ve bu da düşük görüntü kalitesine neden olabilir. Taban plakası, miniskobun kafatasına monte edilmesine yardımcı olan ve objektif ile röle lensleri arasındaki çalışma mesafesini sabitleyen bir plakadır. Böylece, taban plakası etrafındaki diş çimentosunun hacmindeki değişiklikler, lensler arasındaki mesafeyi değiştirir. Mevcut protokol, diş çimentosundaki hacim değişikliklerinden kaynaklanan yanlış hizalama problemini en aza indirmeyi amaçlamaktadır. Protokol, röle lens implantasyonu sırasında diş çimentosunun ilk temelini oluşturarak yanlış hizalamayı azaltır. İmplantasyondan sonraki iyileşme süresi, diş çimentosunun temelinin taban plakasını tamamen kürlemesi için yeterlidir, bu nedenle taban plakası mümkün olduğunca az yeni çimento kullanılarak bu iskele üzerine çimentolanabilir. Bu makalede, miniskopa tutturulmuş objektif bir lens ile nöronal aktivitenin görüntülenmesini sağlamak için farelerde baz kaplama stratejilerini açıklayacağız.

Giriş

Floresan aktivite raporlayıcıları, nöronal aktivitenin görüntülenmesi için idealdir, çünkü hassastırlar ve geniş dinamik aralıklara sahiptirler 1,2,3. Bu nedenle, giderek artan sayıda deney, nöronal aktiviteyi doğrudan gözlemlemek için floresan mikroskobu kullanmaktadır 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. İlk minyatür tek fotonlu floresan mikroskobu (miniskop) 2011 yılında Mark Schnitzer ve ark.5 tarafından tasarlanmıştır. Bu miniskop, araştırmacıların serbestçe davranan hayvanlarda serebellar hücrelerin floresan dinamiklerini izlemelerini sağlar5 (yani, hayvanlara herhangi bir fiziksel kısıtlama, kafa kısıtlaması, sedasyon veya anestezi olmadan). Şu anda, teknik korteks 6,8,15,16 gibi yüzeysel beyin bölgelerini izlemek için uygulanabilir; dorsal hipokampus 8,11,13,14 ve striatum 6,17 gibi subkortikal alanlar; ve ventral hipokampus 14, amigdala 10,18 vehipotalamus 8,12 gibi derin beyin bölgeleri.

Son yıllarda, birkaç açık kaynaklı miniskop geliştirilmiştir.4,5,6,7,11,13,17,19. Miniskop, Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles (UCLA) Miniskop ekibi tarafından sağlanan adım adım yönergeleri izlerlerse araştırmacılar tarafından ekonomik olarak monte edilebilir.4,7,11,13. Çünkü nöral aktivitenin optik izlenmesi ışık iletiminin sınırlamaları ile sınırlıdır.7 İlgilenilen nöronal popülasyona ve bu popülasyondan, bir röle GRIN merceğinden (veya röle lensinden) aktarılan görüş alanını büyütmek için miniskobun altına önceden sabitlenmiş objektif gradyan kırılma indisi (GRIN) lensinin (veya objektif lensin) kullanılmasını gerektiren bir miniskop tasarlanmıştır.6,7,8,10,16,17. Bu röle lensi, hedef beyin bölgesine implante edilir, böylece hedef beyin bölgesinin floresan aktivitesi röle lensinin yüzeyine aktarılır.6,7,8,10,16,17. Tam bir sinüzoidal ışık periyodunun yaklaşık 1 / 4'ü objektif GRIN merceğinden geçer (~ 0.25 adım) (Şekil 1A1), büyütülmüş floresan görüntü ile sonuçlanır6,7. Objektif lens her zaman miniskopun altına sabitlenmez ve röle lensinin implantasyonu gerekli değildir.6,7,11,13,15. Spesifik olarak, iki konfigürasyon vardır: biri miniskopta sabit bir objektif lens ve beyne implante edilmiş bir röle lensi ile8,10,12,14,16 (Şekil 1B1) ve sadece çıkarılabilir objektif lensli bir diğeri6,7,11,13,15 (Şekil 1B2). Sabit objektif ve implante edilmiş röle lensi kombinasyonuna dayanan tasarımda, beyinden gelen floresan sinyalleri röle lensinin üst yüzeyine getirilir (Şekil 1A1)7,8,10,12,14,16. Daha sonra, objektif lens, röle lensinin üst yüzeyinden görme alanını büyütebilir ve iletebilir (Şekil 1A2). Öte yandan, çıkarılabilir objektif GRIN lens tasarımı daha esnektir, bu da bir röle lensinin beyne önceden implante edilmesinin zorunlu olmadığı anlamına gelir (Şekil 1B2)6,7,11,13,15. Çıkarılabilir bir objektif lens tasarımına dayanan bir miniskop kullanırken, araştırmacıların hala hedef beyin bölgesine bir lens yerleştirmeleri gerekir, ancak objektif bir lens implante edebilirler.6,7,11,13,15 veya beyindeki bir röle lensi6,7. İmplantasyon için objektif veya röle lensi seçimi, araştırmacının kullanması gereken miniskop konfigürasyonunu belirler. Örneğin, V3 UCLA Miniscope, çıkarılabilir bir objektif GRIN lens tasarımına dayanmaktadır. Araştırmacılar, beynin ilgilendiği bölgeye objektif bir lensi doğrudan implante etmeyi ve "boş" miniskobu objektif lense monte etmeyi seçebilirler.6,7,11,13,15 (tek lensli bir sistem; Şekil 1B2) veya beyne bir röle lensi yerleştirmek ve objektif bir lensle önceden sabitlenmiş bir miniskop monte etmek için6,7 (iki lensli bir sistem; Şekil 1B1). Miniskop daha sonra genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesi tarafından üretilen nöronal floresanın canlı akış görüntülerini yakalamak için bir floresan kamera olarak çalışır.1,2,3. Miniskop bir bilgisayara bağlandıktan sonra, bu floresan görüntüler bilgisayara aktarılabilir ve video klip olarak kaydedilebilir. Araştırmacılar, bazı analiz paketleriyle floresandaki göreceli değişiklikleri analiz ederek nöronal aktiviteyi inceleyebilirler.20,21 veya gelecekteki analizler için kodlarını yazın.

V3 UCLA Miniscope, kullanıcılara nöronal aktiviteyi bir veya iki lensli bir sistemle görüntüleyip görüntülemeyeceğine karar verme esnekliği sağlar7. Kayıt sisteminin seçimi, hedef beyin bölgesinin derinliğine ve boyutuna dayanır. Kısacası, tek lensli bir sistem yalnızca yüzeysel (yaklaşık 2,5 mm'den daha küçük) ve nispeten büyük (yaklaşık 1,8 x 1,8mm2'den daha büyük) bir alanı görüntüleyebilir, çünkü üreticiler yalnızca belirli bir boyutta objektif lens üretir. Buna karşılık, iki lensli bir sistem herhangi bir hedef beyin bölgesine uygulanabilir. Bununla birlikte, taban plakasını yapıştırmak için kullanılan diş çimentosu, objektif ve röle lensleri arasındaki değişen mesafe ile yanlış hizalamalara neden olma eğilimindedir ve bu da düşük görüntü kalitesine neden olur. İki lensli sistem kullanılıyorsa, optimum görüntüleme kalitesini elde etmek için iki çalışma mesafesinin tam olarak hedeflenmesi gerekir (Şekil 1A). Bu iki kritik çalışma mesafesi, röle lensinin nöronları ve alt yüzeyi arasında ve röle lensinin üst yüzeyi ile objektif lensin alt yüzeyi arasındadır (Şekil 1A1). Lensin çalışma mesafesinin dışına yanlış hizalanması veya yanlış yerleştirilmesi görüntüleme hatasına neden olur (Şekil 1C2). Buna karşılık, tek lensli sistem yalnızca bir hassas çalışma mesafesi gerektirir. Bununla birlikte, objektif lens boyutu, derin beyin bölgelerinin izlenmesi için uygulamasını sınırlar (miniskopa uyan objektif lens yaklaşık 1.8 ~ 2.0 mm 6,11,13,15'tir). Bu nedenle, objektif bir lensin implantasyonu, yüzeyin ve farelerde korteks6,15 ve dorsal cornu ammonis 1 (CA1) gibi nispeten büyük beyin bölgelerinin gözlemlenmesi için sınırlıdır11,13 . Ek olarak, dorsal CA1 11,13'ü hedeflemek için korteksin geniş bir alanı aspire edilmelidir. Derin beyin bölgelerinin görüntülenmesini engelleyen tek lensli konfigürasyonun sınırlaması nedeniyle, ticari miniskop sistemleri yalnızca birleşik bir objektif lens / röle lensi (iki lens) tasarımı sunar. Öte yandan, V3 UCLA miniskobu tek lensli veya iki lensli bir sisteme dönüştürülebilir, çünkü objektif lensi çıkarılabilir 6,11,13,15'tir. Başka bir deyişle, V3 UCLA miniskop kullanıcıları, çıkarılabilir lensi beyne implante ederek (tek lensli bir sistem oluşturarak), yüzeysel beyin gözlemlerini içeren deneyler yaparken (derinliği 2,5 mm'den az) veya miniskopu önceden sabitleyerek ve beyne bir röle lensi yerleştirerek (iki lensli bir sistem oluşturarak) yararlanabilirler. derin beyin gözlemlerini içeren deneyler yaparken. İki lensli sistem, beyni yüzeysel olarak gözlemlemek için de uygulanabilir, ancak araştırmacı objektif lens ve röle lensi arasındaki doğru çalışma mesafelerini bilmelidir. Tek lensli sistemin temel avantajı, iki lensli sistemde optimum görüntüleme kalitesi elde etmek için tam olarak hedeflenmesi gereken iki çalışma mesafesi olduğu göz önüne alındığında, çalışma mesafelerini kaçırma şansının iki lensli bir sisteme göre daha düşük olmasıdır (Şekil 1A). Bu nedenle, yüzeysel beyin gözlemleri için tek lensli bir sistem kullanmanızı öneririz. Bununla birlikte, deney derin beyin bölgesinde görüntüleme gerektiriyorsa, araştırmacı iki lensin yanlış hizalanmasını önlemeyi öğrenmelidir.

Deneyler için miniskopların iki lensli konfigürasyonu için temel protokol, lens implantasyonu ve taban kaplaması 8,10,16,17'yi içerir. Taban kaplaması, bir taban plakasının bir hayvanın kafasına yapıştırılmasıdır, böylece miniskop sonunda hayvanın üstüne monte edilebilir ve nöronların floresan sinyallerini videoya çekebilir (Şekil 1B). Bu prosedür, taban plakasını kafatasına yapıştırmak için diş çimentosu kullanmayı içerir (Şekil 1C), ancak diş çimentosunun büzülmesi, implante edilen röle lensi ile objektif lens 8,17 arasındaki mesafede kabul edilemez değişikliklere neden olabilir. İki lens arasındaki kaydırılmış mesafe çok büyükse, hücreler netlemeye getirilemez.

Miniskopları kullanarak derin beyin kalsiyum görüntüleme deneyleri için ayrıntılı protokoller zaten yayınlanmıştır.8,10,16,17. Bu protokollerin yazarları Inscopix sistemini kullanmışlardır.8,10,16 veya diğer özelleştirilmiş tasarımlar17 ve viral seleksiyon, cerrahi ve taban plakası bağlantısı için deneysel prosedürleri tanımlamıştır. Bununla birlikte, protokolleri V3 UCLA Miniscope sistemi, NINscope gibi diğer açık kaynaklı sistemlere tam olarak uygulanamaz.6ve Finchscope19. İki lensin yanlış hizalanması, taban plakasını kafatasına çimentolamak için kullanılan diş çimentosu türü nedeniyle UCLA Miniscope ile iki lensli bir konfigürasyonda kayıt sırasında ortaya çıkabilir.8,17 (Şekil 1C). İmplante edilmiş röle lensi ile objektif lens arasındaki mesafe, baz kaplama prosedürü sırasında diş çimentosunun istenmeyen büzülmesi nedeniyle kaymaya eğilimli olduğu için mevcut protokole ihtiyaç vardır. Taban kaplaması sırasında, implante edilmiş röle lensi ile objektif lens arasındaki optimum çalışma mesafesi, miniskop ile röle lensinin üst kısmı arasındaki mesafe ayarlanarak bulunmalı ve taban plakası daha sonra bu ideal konuma yapıştırılmalıdır. Objektif lens ile implante edilen röle lensi arasındaki doğru mesafe ayarlandıktan sonra, hücresel çözünürlükte uzunlamasına ölçümler elde edilebilir (Şekil 1B; in vivo kayıt). Bir röle lensinin optimum çalışma mesafesi aralığı küçük olduğundan (50 - 350 μm)4,8, kürleme sırasında aşırı çimento büzülmesi, objektif lensin ve implante edilmiş röle lensinin uygun aralıkta tutulmasını zorlaştırabilir. Bu raporun genel amacı, büzülme sorunlarını azaltmak için bir protokol sağlamaktır.8,17 baz kaplama işlemi sırasında meydana gelen ve iki lensli bir konfigürasyonda floresan sinyallerinin miniskop kayıtlarının başarı oranını artırmak. Başarılı miniskop kaydı, serbestçe davranan bir hayvanda bireysel nöronların floresansındaki gözle görülür göreceli değişikliklerin canlı akışının kaydedilmesi olarak tanımlanır. Farklı dental çimento markalarının farklı büzülme oranları olmasına rağmen, araştırmacılar daha önce test edilmiş bir marka seçebilirler.6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. Bununla birlikte, tıbbi malzemeler için ithalat düzenlemeleri nedeniyle bazı ülkelerde / bölgelerde her markanın elde edilmesi kolay değildir. Bu nedenle, mevcut diş çimentolarının büzülme oranlarını test etmek ve daha da önemlisi büzülme sorununu en aza indiren alternatif bir protokol sağlamak için yöntemler geliştirdik. Mevcut baz kaplama protokolüne göre avantajı, laboratuvarlarda kolayca elde edilebilen alet ve çimento ile kalsiyum görüntülemenin başarı oranındaki artıştır. UCLA miniskobu örnek olarak kullanılır, ancak protokol diğer miniskoplar için de geçerlidir. Bu raporda, optimize edilmiş bir taban kaplama prosedürünü açıklıyoruz ve ayrıca UCLA miniskop iki lensli sistemin (Şekil 2A). UCLA miniskobu ile iki lensli konfigürasyon için hem başarılı implantasyon örnekleri (n = 3 fare) hem de başarısız implantasyon örnekleri (n = 2 fare) başarı ve başarısızlıkların nedenlerine ilişkin tartışmalarla birlikte sunulmuştur.

Protokol

Bu çalışmada yapılan tüm prosedürler Ulusal Tayvan Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (Onay No.: NTU-109-EL-00029 ve NTU-108-EL-00158).

1. Diş çimentosunun hacim değişiminin değerlendirilmesi

NOT: Diş çimentosu hacmindeki değişiklikler, kürleme işlemi sırasında meydana gelir. İmplantasyon ve baz kaplamadan önce diş çimentosunun hacim değişikliklerini test edin. Araştırmacılar, herhangi bir diş çimentosu markasını test edebilir ve taban plakasını çimentolamak için en düşük hacim değişikliğine sahip markayı kullanabilirler. Bir örnek Şekil 3'te gösterilmiştir.

  1. Her bir diş çimento tozunun 0,5 g ağırlığını koyun ve uygun çözeltisiyle (1 mL) karıştırın.
    NOT: Dental çimento talimatlarında önerilen toz/sıvı oranı, katı bir form elde etmek için çözeltinin 0,5 g toz ila 0,25 mL'sidir. Bu test protokolü, pipet uçlarındaki hacim değişimini ölçmek için karışımın sıvı halde aspire edilebilmesi için oranı 0,5 g/mL'ye kadar seyreltir.
  2. Diş çimento karışımının 2,5 μL'sini çıkarmak için 0,1-10 μL pipet uçları kullanın ve ardından pipet ucunu hafif kürleyici bir yapıştırıcı ile kapatın.
  3. İpuçlarını bir rafa yerleştirin, diş çimento karışımının en üst seviyelerini işaretleyin ve 40 dakika sonra diş çimento karışımının seviyesini ölçün (Ek video S1).
  4. Uçlardaki diş çimentosu kürlemesi sırasındaki seviye değişikliklerini izlemenin yanı sıra, kalan kuru diş çimentosu yoğunluğunu da ölçün. Yoğunluğu hesaplamak için diş çimentosunun ağırlığını ölçün ve hacmi Arşimet prensibi ile ölçün.
    1. Kısacası, kalan kuru diş çimentosunu suyla dolu bir kaba koyun ve taşan suyu tartın.
  5. Aşağıda detaylandırılan tüm protokoller için diş çimentosunu en az büzülme ile kullanın.

2. Anestezi, cerrahi implantasyon, viral enjeksiyon ve kukla baz kaplama

  1. Anestezi
    NOT: Bu rapor, UCLA miniskobu için cerrahi ve baz kaplama prosedürünü optimize etmeyi amaçlamaktadır; bu nedenle, hedef beyin bölgelerini enfekte etmek için en uygun viral titrenin bilindiği varsayılmaktadır. Optimal viral titreyi bulma yöntemleri, Resendez ve ark.'nın 1 ila 5. adımlarında bulunabilir.8. Viral seyreltme optimize edildikten sonra, cerrahi implantasyon başlatılabilir.
    1. Fareyi bir indüksiyon kabına yerleştirin ve oksijen sağlayın (0,2 L/dak hava akış hızında %100). Fareyi 5 ila 10 dakika boyunca önceden oksijenlendirin.
    2. Fare dengesini kaybetmeye başlayana ve sonunda anestezi altına alınana kadar% 100 oksijenle (hava akış hızı: 0.2 L / dak) karıştırılmış% 5 izofluran uygulayın.
    3. Fareyi indüksiyon odasından çıkarın ve tükürük ve buprenorfin (0.03 mg / kg; deri altı enjeksiyonu) birikimini önlemek için analjezik olarak atropin (0.04 mg / kg; deri altı enjeksiyon) enjekte edin.
    4. Farenin kafasını tıraş edin.
    5. Maske, steril önlük ve eldiven giyin. Ameliyat için steril bir alan ve steril cerrahi aletler hazırlayın. Stereotaksik aparat üzerinde farenin kafasını stabilize edin (bu adım sırasında% 3 ila% 2.5 izofluran ile anesteziyi koruyun). Analjezik ve anestezik prosedürlerden sonra, kulak çubuklarının kafayı güvenli bir şekilde stabilize ettiğinden emin olun. Termal destek sağlayın.
    6. Başın düz bir pozisyonda ayarlandığından emin olun, traş edilmiş kafayı betadin ile sterilize edin ve ardından kafaya lokal bir analjezik olan ksilokain (% 10) püskürtün.
    7. Kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhem uygulayın.
      NOT: Oküler yaralanmayı önlemek için tüm anestezik olaylar sırasında gözün korunması için oftalmik merhem kullanın.
    8. Arka pençesini sıkıştırarak hayvanın derin ağrı refleksini test edin. Hayvan pençe çekilme refleksi göstermediğinde, cerrahi prosedürlere devam edin.
    9. Kafatasının orta sagital düzlemi boyunca küçük bir kesi yapın (bregmaya yaklaşık 2 mm önden başlar ve bregmaya yaklaşık 6 mm posterior biter). Ardından, kafatasındaki bağ dokusunu temizleyin ve sol ön ve interparietal kemiklere üç paslanmaz çelik vida takın.
      1. Bu noktada, izofluranı% 1-2'ye düşürün. Tüm cerrahi prosedür sırasında solunum hızını izleyin. Solunum hızı çok yavaşsa (hayvana bağlı olarak yaklaşık 1 / s), izofluran konsantrasyonunu azaltın.
    10. 0,7 mm uç çapına sahip bir çapak matkabı kullanarak röle lensi lens implantasyonu için cerrahi mikroskop veya stereomikroskop altında bir kraniyotomi uygulayın. Çapak matkap ucunu tutmak ve amaçlanan daire alanının bir taslağını çizmek için bir mikro matkap kullanın (kalvaryumun tam kalınlığına nüfuz edilmesi gerekmez).
      NOT: Mevcut protokolde kullanılan röle lensinin çapı 1,0 mm, uzunluğu ~ 9,0 mm aralığı 1 ve çalışma mesafesi aralığı ~100 μm - 300 μm'dir; bu nedenle, kraniyotomi çapı 1.2 mm'dir.
      1. Dura açığa çıkana kadar taslağı yavaşça derinleştirin.
      2. 3 mL'lik bir şırıngada 3 mL steril salin hazırlayın ve bir buz kovasında soğutun. Alanı soğutmak ve ısı hasarını ve kanamayı önlemek için maruz kalan bölgeyi sık sık şırıngadan 0.1 mL salin ile durulayın.
    11. Dura'yı 27G iğneyle hafifçe toplayın ve soyun.
    12. Uçtan 1 mm uzakta 27 G'lık künt bir iğne üzerine bir işaret koyun ve lens implantasyonuiçin bir pencere oluşturmak amacıyla beynin korteksini dikkatlice aspire etmek için kullanın 8,11,13,17 (Şekil 2B1). Gerekirse, 27 G'lik bir enjeksiyon iğnesinin ucunu zımpara kağıdı ile öğüterek künt bir iğne yapın. Ardından, iğneyi bir şırıngaya bağlayın, şırıngayı bir tüpe bağlayın ve bir vakum oluşturmak için tüpü bir emme kaynağına bağlayın.
      NOT: Röle lensi künttür ve derin beyin bölgesine yerleştirildiğinde beyin dokusunu sıkıştırır. Böylece, korteksin aspirasyonu, röle lens implantasyonuna bağlı doku hasarını azaltır. Korteks farelerde yaklaşık 1 mm kalınlığındadır, ancak stereomikroskop altında görselleştirilmesi zordur. İşaret, iğnenin derinliğinin tek başına bir stereomikroskoptan daha hassas bir şekilde belirlenmesini sağlamak için bir dönüm noktası oluşturur. Ek olarak, direnç bağlı olarak korteks bölgesine ulaşılıp ulaşılmadığı veya geçilip geçilmediği belirlenebilir; korteksin üst kısmı nispeten yumuşak hissederken, subkortikal bölge yoğun hissediyor. Bu nedenle, doku daha yoğun hissetmeye başladığında, aspirasyonu durdurun (Şekil 2B3).
    13. 3 mL'lik bir şırıngada 3 mL steril salin hazırlayın ve bir buz kovasında soğutun. Kanamayı durdurmak ve beyin ödemi olasılığını azaltmak için bölgeyi salin ile durulayın.
  2. Adeno ilişkili virüs (AAV) enjeksiyonu
    NOT: Bu deneyde AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE kullanılmıştır. jGCaMP7s, yeşil floresan3 yayan genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesidir. Bu çalışmada denek olarak vahşi tip bir fare kullanıldığından, nöronları yeşil-floresan kalsiyum gösterge geni ile transfekte etmek ve ifadeyi sağlamak için viral bir vektöre ihtiyaç vardı. Denekleri olarak yeşil-floresan kalsiyum göstergesini ifade eden transgenik fareler kullanan araştırmacılar, protokol 2.2'yi atlayabilirler.
    1. 20 G intravenöz (i.v.) kateterin iç iğnesini stereotaksik kola monte edin ve beyni uygun koordinatlarda (röle lensi lens implantasyonu sırasında kullanılan koordinatlarla aynı) yavaşça delin (~ 100 - 200 μm / dak) (Şekil 2B3).
    2. Mikroenjeksiyon iğnesini ventral CA1'e 100-200 μm / dak hızında indirin ve viral vektörün 200 nL'sini hedef bölgeye (~ 25 nL / dak) (bregmadan -3.16 mm AP, 3.25 mm ML ve -3.50 mm DV) infüze edin.
    3. Virüsün yayılmasına izin vermek ve geri akışı en aza indirmek için 10 dakika bekleyin.
    4. Mikroenjeksiyon iğnesini geri çekin (~ 100-200 μm / dak).
  3. Röle lens implantasyonu
    1. Röle lensini %75 alkol10,16 ile dezenfekte edin ve ardından pirojensiz salin ile durulayın. İmplantasyona kadar lensi soğuk pirojensiz salin içinde bekletin.
      NOT: Soğuk bir lens, beyne yerleştirildiğinde beyin ödemini en aza indirir.
    2. Röle lensini, dişleri ısı büzülme borusuyla kaplanmış bir mikro bulldog kelepçesi (Şekil 2B3) kullanarak tutun.
      NOT: Bulldog kelepçesi, lense zarar vermeden sıkıca tutabilir. Boru kaplı bulldog kelepçesini yapma yöntemi için Resendez ve ark.8'e bakınız.
    3. Röle lensini yavaşça (~100 - 200 μm/dak) hedef bölgenin üzerine yerleştirin (bregmadan -3,16 mm AP, 3,50 mm ML ve -3,50 mm DV) ve diş çimentosu ile stabilize edin.
  4. Kukla taban kaplaması
    NOT: İmplantasyon ameliyatı sırasında "kukla baz kaplama" nın amacı, birkaç hafta sonra gerçek baz kaplama prosedürü sırasında uygulanması gereken diş çimentosu miktarını azaltmak için bir diş çimento tabanı oluşturmaktır. Bu şekilde, diş çimentosunun hacminde bir değişiklik riski en aza indirilir.
    1. Objektif lensi miniskopun altına sabitleyin ve taban plakasını miniskobun üzerine monte edin (bu adımda, ankrajlı objektif lensin, taban plakasının ve miniskopun montajı henüz farenin kafatasının üzerine yerleştirilmemiştir).
    2. Taban plakasının dışına 10 cm parafin film sarın (Şekil 4A).
    3. Miniskopu stereotaksik kol probu ile yeniden kullanılabilir yapışkan kil kullanarak tutun.
    4. Objektif lensi röle lensinin üstüne, lensler arasında mümkün olduğunca az boşluk bırakacak şekilde hizalayın (Şekil 4B).
    5. Taban plakasının konumlandırılmasını sağlamak için diş çimentosu kullanın (çimento sadece parafin filmine dokunacak şekilde).
    6. Diş çimentosu kuruduğunda, filmi çıkarın.
    7. Taban plakasını ve miniskobu çıkarın. Diş çimento tabanı içi boştur (Şekil 4B).
    8. Röle lensini günlük aktivitelerden ve fare tarafından çizilmekten korumak için, röle lensini röle lensi kaplanana kadar bir miktar kalıplama silikon kauçuğu ile kapatın ve silikon kauçuğu ince bir diş çimentosu tabakası ile örtün (Şekil 4B).
    9. Fareyi stereotaksik aletlerden ayırın ve fareyi bir kurtarma odasına yerleştirin.
    10. Enfeksiyonu önlemek için analjezi için karprofen (5 mg / kg; deri altı enjeksiyon) veya meloksikam (1 mg / kg; deri altı enjeksiyon) ve seftazidim (25 mg / kg; deri altı enjeksiyon) enjekte edin.
      NOT: Antibiyotik kullanımı aseptik bir tekniğe alternatif değildir. Perioperatif antibiyotikler (yani, seftazidim), uzun süreli ameliyatlar veya kronik implantların yerleştirilmesi gibi belirli durumlarda endike olabilir.
    11. Sternal yassılığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı izleyin.
    12. Ev farelerini ayrı ayrı ve ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için bir hafta boyunca meloksikam (1 mg / kg; deri altı enjeksiyon; q24h) enjekte edin. Normal şekilde yediğinden, içtiğinden ve dışkıladığından emin olmak için ameliyattan sonra her gün hayvanı kontrol edin.
    13. 3 veya daha fazla hafta sonra baz kaplama yapın.

3. Taban kaplaması

NOT: Genellikle, baz kaplama prosedürü (Şekil 5), iyileşme ve viral inkübasyon süresi nedeniyle ilk prosedürden sonraki 2-3 hafta içinde gerçekleştirilemez. Baz kaplama için indüksiyon prosedürleri, adım 2.1.1 ila 2.1.8'de açıklananlara benzer. Bununla birlikte, baz kaplama invaziv bir prosedür değildir ve hayvan sadece hafif sedasyon gerektirir. Bu nedenle, hayvan stereotaksik çerçeve üzerinde hareket edemediği sürece% 0.8-1.2 izofluran yeterlidir. Ek olarak, nispeten hafif izofluran anestezisi, izleme sırasında nöronların floresan geçicilerinin ekspresyonunu kolaylaştırmaya yardımcı olabilir8 (Ek video S2).

  1. Diş çimento çatısının ince tabakasını bir kemik rongeur ile dikkatlice kesin ve silikon kauçuğu çıkarın. Röle lensinin yüzeyini %75 alkolle temizleyin.
  2. Miniskopun altına sabitlemek için taban plakasının yanına ayarlanmış bir vida takın (Şekil 5A1).
    NOT: Taban plakası, miniskobun alt kısmının altında güvenli bir şekilde sıkılmalıdır, çünkü sıkılmış ve hafifçe tutturulmuş bir taban plakası arasındaki fark tutarsız bir mesafeye neden olabilir.
  3. Netleme kaydırağını ana muhafazadan yaklaşık 2,7 - 3 mm olacak şekilde ayarlayın (Şekil 5A2).
    NOT: Taban kaplama prosedürü sırasında uzunluk daha da ayarlanabilse de, yaklaşık 2,7 mm'ye sabitleyin, çünkü aynı anda miniskop uzunluğunu ve implante edilmiş röle lensi ile önceden sabitlenmiş objektif lens arasındaki optimum uzunluğu ayarlamak çok kafa karıştırıcıdır.
  4. Miniskopu veri toplama kartına bağlayın ve bilgisayardaki USB 3.0 (veya daha yüksek sürüm) bağlantı noktasına takın.
  5. UCLA ekibi tarafından geliştirilen veri toplama yazılımını çalıştırın.
  6. Pozlamayı 255'e, kazancı 64x'e ve uyarma LED'ini %5'e ayarlayın. Bu ayarlar ilk taban kaplaması için önerilir; spesifik ayarlar beyin bölgelerine ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesinin ekspresyon seviyelerine bağlı olarak değişecektir.
  7. Miniskopu veri toplama yazılımına bağlamak ve canlı yayını izlemek için Bağlan düğmesine tıklayın.
  8. Miniskop objektif lensini röle lensine elle hizalayın ve floresan sinyallerini aramaya başlayın (Şekil 5B1).
    NOT: Başlangıçta, floresan sinyalini manuel olarak aramak ayarlamaları kolaylaştırır. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesini ifade etmek için bir AAV sistemi kullanıldığından, hem promotör tip hem de AAV serotipi transfeksiyonun etkinliğini etkilemiştir23,24. Araştırmacıların, gelecekteki deneylere devam etmeden önce floresandaki değişiklikleri gösteren bireysel nöronları bularak kalsiyum göstergesinin ekspresyonunu kontrol etmeleri gerekir.
  9. Diş çimentosunu miniskobu bloke ettiği herhangi bir yere delin (isteğe bağlı).
  10. Veri toplama yazılımının canlı akışını izleyin ve röle lensinin kenar boşluğunu bir dönüm noktası olarak kullanın (Ek video S2). Röle lensinin kenar boşluğu, monitörde ay benzeri gri bir daire olarak görünür (Şekil 5B1; beyaz oklar).
  11. Röle lensi bulunduğunda, floresan sinyalleri bulunana kadar miniskopun çeşitli açılarını ve mesafelerini dikkatlice ayarlayın.
    NOT: Nöronların görüntüleri arka plandan daha beyazdır. Kesin bir nöronal şekil, nöronların röle lensinin odak düzleminde mükemmel bir şekilde yattığını gösterir. Yuvarlak nöronlar, odak düzlemine yakın olduklarını göstermektedir. Nöronal şekil beyinde farklıdır, burada ventral CA1 örnek olarak gösterilmiştir.
  12. Bireysel bir nöron, zamanın bir fonksiyonu olarak floresandaki değişiklikleri göstermiyorsa, tabanı silikon kauçukla yeniden kapatın. Kuluçka süresi de virüsün özelliğine bağlı olduğu için floresan gözlenmez23,24. 3.1-3.12 arasındaki adımları bir hafta daha sonra gerçekleştirin. (Bu isteğe bağlıdır).
  13. Miniskobu en uygun konumda tutun ve stereotaksik kolu yeniden kullanılabilir yapışkan kil ile miniskoba doğru hareket ettirin (Şekil 5B2). Miniskopu stereotaksik kola yeniden kullanılabilir yapışkan kil ile yapıştırın.
  14. En iyi görünümü aramak için x, y ve z kollarını hafifçe ayarlayın (Ek video S2). Ardından, z eksenindeki kulak çubuğunu, diş çubuğunu veya yeniden kullanılabilir yapışkan kili döndürerek objektif lensin yüzeyi ile röle lensi arasındaki açıyı ayarlayın. Viral ekspresyon ve lens implantasyonu, en az bir hücre floresan geçicileri gösterdiğinde başarılı olur (Şekil 6A; Ek video S2) baz kaplama sırasında (aynı zamanda CA1 gibi beynin alanına da bağlıdır).
    NOT: Monitör yalnızca beyaz hücreler gösteriyor ancak geçici hücreler göstermiyorsa, başka bir neden daha vardır (bkz: Şekil 6B,C, Ek videolar S4,S5, Sonuçlar bölümü ve sorun giderme bölümü).
  15. Taban plakasını (Şekil 5B2) diş çimentosu ile çimentolayın.
  16. Optimum pozisyonun değişmediğinden emin olmak için çimentolama sırasında ilgilenilen bölgeyi izleyin.
  17. Taban plakasını diş çimento tabanına sıkıca yapıştırırken mümkün olan en az miktarda çimento kullanın (Şekil 5B2). Taban plakasının etrafına ikinci ve üçüncü bir çimento tabakası uygulayın, ancak GRIN lensi etkilememeye dikkat edin.
    NOT: Taban plakasına çimento uygulamak bu adımda daha kolaydır, çünkü taban plakasının tabanı kukla kaplama prosedürü sırasında oluşturulmuştur.
  18. Çimento kürlendiğinde miniskobu taban plakasından dikkatlice ayırın. Ardından, koruyucu bir kapağa vidalayın.
  19. Hayvanı bir kurtarma kafesine taşıyın. Sternal yassılığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı izleyin.
  20. Ev fareleri ayrı ayrı. Her gün normal şekilde yediğinden, içtiğinden ve dışkıladığından emin olun. Farenin tamamen iyileşmesi için 5 gün bekleyin ve ardından kalsiyum görüntülemeyi kontrol edin.
    NOT: Taban plakasını tutan az miktarda diş çimentosu vardır. Bu nedenle, taban kaplama prosedüründen bu yana taban plakası önemli ölçüde kaymışsa, diş çimentosunu bir matkapla çıkarın ve taban kaplama prosedürünü tekrar gerçekleştirin.
  21. Anestezi uygulayın (bir ketamin (87 mg / kg) / ksilazin (13 mg / kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile) ve tüm deneyler yapıldığında25 hayvana perfüze edin.

Sonuçlar

Dental çimento hacim değişiminin değerlendirilmesi
Kürleme işlemi sırasında diş çimentosunun hacmi değiştiğinden, GRIN lensin çalışma mesafesinin yaklaşık 50 ila 350 μm4,8 olduğu göz önüne alındığında, görüntüleme kalitesini önemli ölçüde etkileyebilir. Bu nedenle, bu olguda, implantasyon ve baz kaplama prosedüründen önce ticari olarak temin edilebilen iki diş çimentosu, Tempron ve Tokuso test edilmiştir...

Tartışmalar

Bu rapor, iki lensli UCLA Miniskop sistemini kullanan araştırmacılar için ayrıntılı bir deneysel protokolü açıklamaktadır. Protokolümüzde tasarlanan araçlar, in vivo kalsiyum görüntülemeyi denemek isteyen herhangi bir laboratuvar için nispeten uygundur. Viral enjeksiyon, lens implantasyonu, kukla baz kaplama ve baz kaplama gibi bazı protokoller, kalsiyum görüntülemenin başarı oranını artırmak için miniskop sisteminin diğer versiyonları için de kullanılabilir. Viral enjeksiyon ile ...

Açıklamalar

Bu endüstri destekli bir çalışma değildir. Yazarlar finansal çıkar çatışması olmadığını bildirmektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma Tayvan Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.7-mm drill bit #19008-07Fine Science Tools; USAfor surgery
0.1–10 μl pipette tips104-Q; QSPFisher Scientific; Singaporefor testing dental cement
20 G IV cathater#SR-OX2032CATerumo Corporation; Tokyo, Japanfor surgery
27 G needleAGANI, AN*2713RTerumo Corporation; Tokyo, Japanfor surgery
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE#104487-AAV9; 1.5*10^13Addgene viral prep; MA, USAfor viral injection
Atropine sulfateAstart; Hsinchu, Taiwanfor surgery/dummy baseplating/baseplating
BaseplateV3http://miniscope.orgfor dummy baseplating/baseplating
BLU TACK#30840350Bostik; Chelsea, Massachusetts, USAReusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating
Bone Rongeur Friedman13 cmDiener; Tuttlingen, Germanyfor baseplating
BuprenorphineINDIVIOR; UKfor surgery
CarprofenRimadylZoetis; Exton, PAanalgesia
CeftazidimeTaiwan Biotech; Taiwanprevent infection
Data Acquisition PCB for UCLA Miniscopepurchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daqfor baseplating
Dental cement setTempronGC Corp; Tokyo, Japanfor testing dental cement
Dental cement setTokuso CurefastTokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japanfor testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating
Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors#51673Stoelting Co; Illinois, USAfor surgery/dummy baseplating/baseplating
Duratear ointmentAlcon; Geneva, Switzerlandfor surgery/dummy baseplating/baseplating
IbuprofenYungShin; Taiwananalgesia
IsofluranePanion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwanfor surgery/dummy baseplating/baseplating
InscopixnVista SystemInscopix; Palo Alto, CAfor comparison with V3 UCLA Miniscope
KetaminePfizer; NY, NYfor euthanasia
Normal salinefor surgery
Micro bulldog clamps#12.102.04Dimedo; Tuttlingen, Germanyfor lens implantation
Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge#88400Hamilton; Bonaduz, Switzerlandfor viral injection
Molding silicone rubberZA22 ThixoZhermack; Badia Polesine, Italyfor dummy baseplating
Objective Gradient index (GRIN) lens#64519Edmund Optics; NJ, USAfor dummy baseplating/baseplating
Parafilm#PM996Bemis; Neenah, USAfor dummy baseplating
Portable Suction#DF-750Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwanfor surgery
Relay GRIN lens#1050-002177Inscopix; Palo Alto, CA, USAfor dummy baseplating/baseplating
Stainless steel anchor screws1.00 mm diameter, total length 3.00 mmfor surgery
Stereo microscope#SL720Sage Vison; New Taipei City, Taiwanfor surgery/dummy baseplating/baseplating
Stereotaxic apparatus#51673Stoelting; IL, USAfor surgery/dummy baseplating/baseplating
UV Cure Adhesive#3321Loctite; Düsseldorf, Germanyfor testing dental cement
V3 UCLA Miniscopepurchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-componentsfor surgery/dummy baseplating/baseplating
XylazineX1126Sigma-Aldrich; St. Louis, MOfor euthanasia
Xylocaine pump spray 10%AstraZeneca; Södertälje, Swedenfor surgery

Referanslar

  1. Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
  2. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  3. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  4. Campos, P., Walker, J. J., Mollard, P. Diving into the brain: deep-brain imaging techniques in conscious animals. Journal of Endocrinology. 246 (2), 33-50 (2020).
  5. Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
  6. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
  7. Aharoni, D., Hoogland, T. M. Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: past, present and future. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 141 (2019).
  8. Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
  9. Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
  10. Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. Journal of Visualized Experiments. (162), e61659 (2020).
  11. Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
  12. Chen, K. S., et al. A hypothalamic switch for REM and Non-REM sleep. Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).
  13. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  14. Jimenez, J. C., et al. Anxiety cells in a hippocampal-hypothalamic circuit. Neuron. 97 (3), 670-683 (2018).
  15. Hart, E. E., Blair, G. J., O'Dell, T. J., Blair, H. T., Izquierdo, A. Chemogenetic modulation and single-photon calcium imaging in anterior cingulate cortex reveal a mechanism for effort-based decisions. Journal of Neuroscience. , 2548 (2020).
  16. Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (124), e55579 (2017).
  17. Zhang, L., et al. Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
  18. Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
  19. Liberti, W. A., Perkins, L. N., Leman, D. P., Gardner, T. J. An open source, wireless capable miniature microscope system. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045001 (2017).
  20. Lu, J., et al. MIN1PIPE: A miniscope 1-photon-based calcium imaging signal extraction pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
  21. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
  22. Lee, A. K., Manns, I. D., Sakmann, B., Brecht, M. Whole-cell recordings in freely moving rats. Neuron. 51 (4), 399-407 (2006).
  23. Burger, C., et al. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Molecular Therapy. 10 (2), 302-317 (2004).
  24. Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Research. 1190, 15-22 (2008).
  25. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  26. Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
  27. Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (1), 55-69 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 172in vivo kalsiyum g r nt lemeUCLA Miniskoptaban kaplamas

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır