طريقة غير جراحية لتوليد نموذج آفة الغضروف داخل المفصل الناجم عن التحميل الدوري لركبة الجرذ

Summary

هنا ، نقدم نموذج آفة الغضروف داخل المفصل الناجم عن التحميل الدوري لركبة الفئران ، الناتجة عن 60 ضغطا دوريا يزيد عن 20 نيوتن ، مما يؤدي إلى تلف غضروف اللقمة الفخذية في الفئران.

Abstract

لا تزال الفيزيولوجيا المرضية لالتهاب المفاصل الأولي (OA) غير واضحة. ومع ذلك ، من المحتمل أن يرتبط تصنيف فرعي محدد ل OA في الفئات العمرية الأصغر نسبيا بتاريخ من تلف الغضروف المفصلي وقلع الأربطة. تلعب النماذج الحيوانية الجراحية لالتهاب المفاصل في الركبة دورا مهما في فهم بداية وتطور الزراعة العضوية بعد الصدمة والمساعدة في تطوير علاجات جديدة لهذا المرض. ومع ذلك ، فقد تم النظر مؤخرا في النماذج غير الجراحية لتجنب الالتهاب الرضحي الذي يمكن أن يؤثر على تقييم التدخل.

في هذه الدراسة ، تم تطوير نموذج فأر آفة الغضروف داخل المفصل الناجم عن التحميل الانضغاطي الدوري في الجسم الحي ، مما سمح للباحثين ب (1) تحديد الحجم الأمثل والسرعة ومدة الحمل التي يمكن أن تسبب تلف الغضروف البؤري. (2) تقييم التغيرات المرضية الزمانية المكانية بعد الصدمة في حيوية الخلايا الغضروفية ؛ و (3) تقييم التعبير النسيجي للجزيئات المدمرة أو الوقائية التي تشارك في آليات التكيف والإصلاح ضد الأحمال الانضغاطية المشتركة. يصف هذا التقرير البروتوكول التجريبي لهذه الآفة الغضروفية الجديدة في نموذج الفئران.

Introduction

تقليديا ، يعتبر استئصال الرباط الصليبي الأمامي (ACL) أو زعزعة استقرار الغضروف المفصلي الإنسي هو الأمثل للتحقيق في هشاشة العظام بعد الصدمة (PTOA) في الحيوانات الصغيرة. في السنوات الأخيرة ، تم استخدام نماذج الضغط الدوري غير الغازية لدراسة PTOA. تم تصميم هذا النموذج في الأصل للتحقيق في استجابة العظام الملغاة للتحميل الميكانيكي¹ ثم تم تعديله كنموذج حيواني غير جراحي لدراسات PTOA²،³،⁴،^5،6. الأساس المنطقي هو تصادم الغضروف المفصلي عن طريق تطبيق قوة خارجية دورية ، مما يؤدي إلى سلسلة من الاستجابات الالتهابية. ومع ذلك ، تم تطبيق هذا النموذج فقط على الفئران ، ولم تتم مناقشة الحجم المناسب للتحميل على الحيوانات الكبيرة.

مشكلة أخرى في النموذج السابق هي أن بروتوكول الحجم الكبير تضمن العديد من الدورات ، مما تسبب في سماكة مفرطة للعظم تحت الغضروف ، وهو أحد الآثار الجانبية غير المرغوب فيها ، في عدة عينات⁷. لذلك ، تم تطوير طريقة جديدة للضغط الدوري مع الحجم المناسب للحيوانات الكبيرة وتأثير جانبي أقل للتحميل⁸. الهدف العام من المقالة الحالية هو وصف بروتوكول نموذج الضغط الدوري غير الغازي في الفئران ومراقبة النتائج التمثيلية لتنكس الغضروف. سيساعد البروتوكول الحالي القراء المهتمين بتطبيق نموذج الضغط الدوري غير الغازي على الفئران.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة البحوث الحيوانية بجامعة كيوتو (رقم الموافقة: Med kyo 17616).

1. أداء في الجسم الحي ضغط دوري على ركبة الفئران

1. الحث على تخدير التجارب
   1. حث التخدير في فأر Wistar البالغ من العمر 12 أسبوعا (256.8 ± 8.7 جم) عن طريق استنشاق محلول إيزوفلوران بنسبة 5٪ في صندوق التخدير.
   2. حقن داخل الصفاق خليط من ثلاثة عوامل مخدرة⁹ ، بما في ذلك ميديتوميدين ، ميدازولام ، وبوتورفانول ، في 2 ملغ / كغ من وزن جسم الفئران ، وحلق المنطقة المحيطة بمفصل الركبة الأيمن. تأكد من التخدير الكافي عن طريق عدم وجود منعكس دواسة لقرصة إصبع القدم.
2. قم بتركيب الجرذ المخدر على جهاز التثبيت.
   1. ضع الجرذ المخدر ملقى على بطنه على الصفيحة الأساسية (الشكل 1) ، مع ربط الركبة اليمنى بقطعة صغيرة من الراتنج مع أخدود مقعر. ضع الطرف الخلفي الأيمن في وضعي تمديد الورك وثني الركبة وتمديد الكاحل ، مع ثني الركبة بزاوية 140 درجة تقريبا. استيعاب كعب الفئران على الأخدود على شكل إسفين على لاعبا اساسيا المنقولة.
   2. انقل جهاز التثبيت إلى أداة اختبار الإجهاد / الشد (انظر جدول المواد). بعد التأكد من عدم وجود جهات اتصال مع خلية التحميل ، افتح برنامج التحكم في أداة اختبار الإجهاد / الشد (جدول المواد) وانقر على زر المعايرة . بعد المعايرة ، قم بتوصيل الجزء العلوي من الإطار بخلية التحميل بعناية. للحفاظ على مفصل الركبة متصلا بشكل وثيق بالإطار ، قم بتشغيل المقبض الدوار على لوحة التشغيل الرئيسية المتحركة ببطء حتى يصل التحميل المسبق إلى 5 نيوتن.
3. بناء طريقة التحميل وإعداد اختبار الضغط.
   1. في القائمة الرئيسية ، انقر فوق إنشاء طريقة جديدة | تسمية النظام . اضبط وضع الاختبار على دورة ، ونوع الاختبار على الضغط. انقر فوق ملصق المستشعر وحدد علامة التبويب اختبار للتحقق من أن الحد في حدود 60 نيوتن. بالإضافة إلى ذلك ، حدد علامة التبويب Stroke وتحقق من أن الحد في حدود 500 مم.
      ملاحظة: ستوقف الخطوة أعلاه العملية على الفور إذا كان هناك إزاحة كبيرة على نقطة الإجهاد.
   2. ضمن تسمية التحكم في الاختبار ، حدد أصل النمو لبدء البرنامج الرئيسي بنسبة 0.3٪ / مقياس كامل. من بين الأقسام الأربعة في دورة التحميل ، اضبط سرعة الشط في التحكم في القسمين^{الأول و 3 إلى} 1 مم / ثانية. اضبط قوة الاختبار القصوى في القسم الثاني على 20 نيوتن ، والحد الأدنى لقوة الاختبار ^{في القسم الرابع} إلى 5 نيوتن. اضبط "مدة الانتظار" على 0.5 ثانية لحمل الذروة و 10 ثوان للحد الأدنى للحمل (الشكل 2).
      ملاحظة: نظرا لأن هذه الخطوة تحدد كل دورة ، تأكد من أن أسطح المفصل على اتصال ببعضها البعض وتتحرك بسرعة معقولة وأن الحركة يتم الحفاظ عليها.
   3. في علامة التبويب التحميل المسبق في أسفل الصفحة ، تأكد من تحديد تشغيل ، وضبط سرعة إزالة الانحراف على 100 مم / دقيقة ، والقوة القصوى هي 5 نيوتن. في ملصق العينة ، اضبط المادة كمعدن.
      ملاحظة: قد تكون هذه الإعدادات التفصيلية خاصة بكل مصنع.
   4. في القائمة الرئيسية ، ضمن قسم تحديد الطريقة والاختبار ، حدد الطريقة التي تم إنشاؤها للتو ، وانقر فوق ابدأ لبدء الاختبار.
      ملاحظة: يوضح الجدول الموجود في الأسفل القياسات الفعلية لحمل الذروة والإزاحة.
   5. اضبط عدد الدورات على 60.
      ملاحظة: تتضمن جلسة التحميل بأكملها 60 دورة ، والتي تستغرق حوالي 12 دقيقة. في المجموعة الضابطة ، خضعت الفئران للتحميل المسبق 5 N لمدة 12 دقيقة من التحميل المسبق في ظل نفس الظروف.
4. بعد التحميل ، أعد الجرذ إلى قفصه وراقبه حتى الشفاء التام. الحفاظ على جدول 12-12 ساعة من الضوء والظلام في القفص مع مساحة كافية والطعام الإعلاني. بعد الفترات التجريبية المطلوبة ، التضحية الفئران بجرعة زائدة من خليط من عوامل التخدير الثلاثة التي يتم حقنها داخل الصفاق أو استنشاق ثاني أكسيد الكربون للتحليل (1 ساعة - 8 أسابيع).

النتائج

تم الحصول على نتيجة تمثيلية للتغيرات قصيرة المدى (1 ساعة و 12 ساعة) في صلاحية الخلايا الغضروفية في العينات المعرضة لتحميل دوري 20 نيوتن. كما هو موضح في الشكل 3 ، زاد عدد الخلايا الغضروفية الميتة (مضان أحمر) في 12 ساعة بعد الصدمة. وعلى العكس من ذلك، استمر عدد الخلايا الغضروفية الح?...

Discussion

لأول مرة ، يوضح البروتوكول الحالي كيفية إنشاء نموذج لآفة الغضروف الناجم عن التحميل على اللقمة الفخذية الجانبية في الفئران ، على غرار نموذج الضرر داخل المفصل في القوارض الأصغر مثل الفأر². ومع ذلك ، تسبب بروتوكول التحميل في الفئران في تكوين عظمي شديد وآفات الرباط الصليبي ، والت...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic Apparatus for Small Animals	SHINANO MFG CO.,LTD.	SN-487-0T
Autograph AG-X	Shimadzu Corp	N.A.	Precision Universal / Tensile Tester
Fluoview FV10i microscope	Olympus Corp	N.A.	A fully automated confocal laser-scanning microscope
ISOFLURANE Inhalation Solution	Pfizer Japan Inc.	(01)14987114133400
LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit	Thermo Fisher Scientific Japan Inc	L3224	A quick and easy two-color assay to determine viability of cells
TRAPEZIUM X Software	Shimadzu Corp	N.A.	Data processing software for Autograph AG-X