Un método no invasivo para generar el modelo de lesión de cartílago intraarticular inducida por carga cíclica de la rodilla de rata

Resumen

Aquí, presentamos el modelo de lesión de cartílago intraarticular inducida por carga cíclica de la rodilla de rata, generada por 60 compresiones cíclicas sobre 20 N, lo que resulta en daño al cartílago condilar femoral en ratas.

Resumen

La fisiopatología de la osteoartritis primaria (OA) aún no está clara. Sin embargo, una subclasificación específica de OA en grupos de edad relativamente más jóvenes probablemente se correlacione con antecedentes de daño del cartílago articular y avulsión del ligamento. Los modelos animales quirúrgicos de OA de la rodilla juegan un papel importante en la comprensión de la aparición y progresión de la OA postraumática y ayudan en el desarrollo de nuevas terapias para esta enfermedad. Sin embargo, recientemente se han considerado modelos no quirúrgicos para evitar la inflamación traumática que podría afectar la evaluación de la intervención.

En este estudio, se desarrolló un modelo de rata con lesión de cartílago intraarticular inducido por carga compresiva cíclica in vivo , lo que permitió a los investigadores (1) determinar la magnitud, velocidad y duración óptimas de la carga que podrían causar daño focal del cartílago; (2) evaluar los cambios patológicos espaciotemporales postraumáticos en la vitalidad de los condrocitos; y (3) evaluar la expresión histológica de moléculas destructivas o protectoras que están involucradas en los mecanismos de adaptación y reparación contra cargas compresivas articulares. Este informe describe el protocolo experimental para esta nueva lesión de cartílago en un modelo de rata.

Introducción

Tradicionalmente, la transección del ligamento cruzado anterior (LCA) o la desestabilización del menisco medial se ha considerado óptima para investigar la osteoartritis postraumática (PTOA) en animales pequeños. En los últimos años, se han utilizado modelos de compresión cíclica no invasivos para estudiar PTOA. Este modelo fue diseñado originalmente para investigar la respuesta esponjosa del hueso a la carga mecánica¹ y luego se modificó como un modelo animal no quirúrgico para los estudios de PTOA 2,3,4,5,6. La razón es colisionar el cartílago articular mediante la aplicación de una fuerza externa periódica, que desencadena una serie de respuestas inflamatorias. Sin embargo, este modelo solo se ha aplicado a ratones, y no se ha discutido la magnitud apropiada de la carga en animales más grandes.

Otro problema con el modelo anterior es que el protocolo de alto volumen incluía demasiados ciclos, lo que causó un engrosamiento excesivo del hueso subcondral, un efecto secundario no deseado, en varias muestras⁷. Por lo tanto, se desarrolló un nuevo método de compresión cíclica con la magnitud apropiada para animales grandes y un efecto secundario de carga menor⁸. El objetivo general del presente artículo es describir el protocolo del modelo de compresión cíclica no invasiva en ratas y observar los resultados representativos de la degeneración del cartílago. El protocolo actual ayudaría a los lectores interesados en la aplicación del modelo de compresión cíclica no invasiva en ratas.

Protocolo

El protocolo fue aprobado por el Comité de Investigación Animal de la Universidad de Kioto (número de aprobación: Med kyo 17616).

1. Realizar compresión cíclica in vivo en la rodilla de rata

1. Inducir anestesia animal experimental
   1. Inducir la anestesia en una rata Wistar de 12 semanas de edad (256,8 ± 8,7 g) por inhalación de solución de isoflurano al 5% en la caja de anestesia.
   2. Inyectar por vía intraperitoneal una mezcla de tres agentes anestésicos⁹, incluyendo medetomidina, midazolam y butorfanol, a 2 mg/kg del peso corporal de la rata, y afeitar el área alrededor de la articulación de la rodilla derecha. Confirme la anestesia suficiente por falta de reflejo del pedal hasta pellizcar el dedo del pie.
2. Monte la rata anestesiada en el dispositivo de fijación.
   1. Coloque la rata anestesiada acostada sobre su vientre en la placa base (Figura 1), con la rodilla derecha unida a un pequeño trozo de resina con un surco cóncavo. Coloque la extremidad posterior derecha en las posiciones de extensión de cadera, flexión de rodilla y extensión de tobillo, con la rodilla flexionada a aproximadamente 140 °. Acomode el talón de la rata en la ranura en forma de cuña en el accesorio móvil.
   2. Mueva el dispositivo de fijación al instrumento de ensayo de tensión/tracción (consulte la Tabla de materiales). Después de asegurarse de que no haya contactos con la célula de carga, abra el software de control del instrumento de prueba de tensión/tracción (Tabla de materiales) y haga clic en el botón Calibración . Después de la calibración, fije la parte superior del bastidor a la célula de carga con cuidado. Para mantener la articulación de la rodilla firmemente unida al marco, encienda la perilla giratoria del panel operativo principal móvil lentamente hasta que la precarga alcance los 5 N.
3. Cree un método de carga y configure la prueba de compresión.
   1. En el menú principal, haga clic en Crear un nuevo método | Etiqueta del sistema . Establezca el modo de prueba en Ciclo y Tipo de prueba en Compresión. Haga clic en la etiqueta del sensor y seleccione la pestaña Prueba para comprobar que el límite está dentro de 60 N. Además, seleccione la pestaña Trazo y compruebe que el límite está dentro de los 500 mm.
      NOTA: El paso anterior detendrá la operación inmediatamente si hay un gran desplazamiento en el punto de tensión.
   2. En la etiqueta Control de pruebas, seleccione Origen del crecimiento para iniciar el programa principal con 0,3%/escala completa. De las cuatro secciones de un ciclo de carga, ajuste la velocidad de carrera en control en las secciones^1ª y^3ª a 1 mm/s. Establezca la fuerza de prueba máxima en la^2ª sección en 20 N, y la fuerza de prueba mínima en la^4ª sección en 5 N. Establezca "la duración de la retención" en 0,5 s para la carga máxima y 10 s para la carga mínima (Figura 2).
      NOTA: Como este paso define cada ciclo, asegúrese de que las superficies de las articulaciones estén en contacto entre sí y se muevan a una velocidad razonable y que se mantenga el movimiento.
   3. En la pestaña Precarga en la parte inferior de la página, asegúrese de que Activado esté marcado, que la Velocidad de eliminación de deflexión esté establecida en 100 mm/min y que la fuerza máxima sea de 5 N. En la etiqueta Muestra , establezca el Material como Metal.
      NOTA: Esta configuración detallada puede ser específica para cada fabricante.
   4. En el menú principal, en la sección Seleccionar método y prueba, seleccione el método que se acaba de crear y haga clic en Iniciar para comenzar la prueba.
      NOTA: La tabla de la parte inferior muestra las medidas reales de la carga máxima y el desplazamiento.
   5. Establezca el número de ciclos en 60.
      NOTA: Toda la sesión de carga incluye 60 ciclos, que duran aproximadamente 12 min. En el grupo de control, las ratas se sometieron a una precarga de 5 N durante 12 minutos de precarga en las mismas condiciones.
4. Después de la carga, devuelva la rata a su jaula y monitoree hasta la recuperación completa. Mantener un horario de 12-12 h de luz-oscuridad en la jaula con suficiente espacio y comida ad libitum. Después de los períodos experimentales requeridos, sacrificar las ratas con una sobredosis de la mezcla de los tres agentes anestésicos inyectados por vía intraperitoneal o inhalación de dióxido de carbono para su análisis (1 h-8 semanas).

Resultados

Se obtuvo un resultado representativo de los cambios a corto plazo (1 h y 12 h) en la viabilidad de los condrocitos en muestras sometidas a carga cíclica de 20 N. Como se muestra en la Figura 3, el número de condrocitos muertos (fluorescencia roja) aumentó a las 12 h después del trauma. Por el contrario, el número de condrocitos vivos (fluorescencia verde) continuó disminuyendo, con algunas muestras que no contienen condrocitos vivos en el área afectada.

La...

Discusión

Por primera vez, el protocolo actual muestra cómo establecer un modelo de lesión de cartílago inducida por carga en el cóndilo femoral lateral en ratas, similar al modelo de daño intraarticular en roedores más pequeños como el ratón². Sin embargo, el protocolo de carga en ratones causó la formación severa de osteofitos y lesiones del ligamento cruzado, lo que no fue ideal para evaluar los efectos de la compresión cíclica. El protocolo actual creó una lesión focal del cartílago en ra...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic Apparatus for Small Animals	SHINANO MFG CO.,LTD.	SN-487-0T
Autograph AG-X	Shimadzu Corp	N.A.	Precision Universal / Tensile Tester
Fluoview FV10i microscope	Olympus Corp	N.A.	A fully automated confocal laser-scanning microscope
ISOFLURANE Inhalation Solution	Pfizer Japan Inc.	(01)14987114133400
LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit	Thermo Fisher Scientific Japan Inc	L3224	A quick and easy two-color assay to determine viability of cells
TRAPEZIUM X Software	Shimadzu Corp	N.A.	Data processing software for Autograph AG-X