Un metodo non invasivo per generare il modello di lesione cartilaginea intra-articolare indotta dal carico ciclico del ginocchio di ratto

Riepilogo

Qui, presentiamo il modello di lesione cartilaginea intra-articolare indotta dal carico ciclico del ginocchio di ratto, generato da 60 compressioni cicliche su 20 N, con conseguente danno alla cartilagine condilare femorale nei ratti.

Abstract

La fisiopatologia dell'osteoartrite primaria (OA) rimane poco chiara. Tuttavia, una sottoclassificazione specifica di OA in gruppi di età relativamente più giovani è probabilmente correlata con una storia di danno alla cartilagine articolare e avulsione legamentosa. I modelli animali chirurgici di OA del ginocchio svolgono un ruolo importante nella comprensione dell'insorgenza e della progressione dell'OA post-traumatica e aiutano nello sviluppo di nuove terapie per questa malattia. Tuttavia, i modelli non chirurgici sono stati recentemente considerati per evitare infiammazioni traumatiche che potrebbero influenzare la valutazione dell'intervento.

In questo studio, è stato sviluppato un modello di ratto con lesione cartilaginea intra-articolare indotto da carico ciclico di compressione in vivo , che ha permesso ai ricercatori di (1) determinare l'entità, la velocità e la durata ottimali del carico che potrebbero causare danni alla cartilagine focale; (2) valutare i cambiamenti patologici spaziotemporali post-traumatici nella vitalità dei condrociti; e (3) valutare l'espressione istologica di molecole distruttive o protettive coinvolte nei meccanismi di adattamento e riparazione contro i carichi di compressione articolari. Questo rapporto descrive il protocollo sperimentale per questa nuova lesione cartilaginea in un modello di ratto.

Introduzione

Tradizionalmente, la transezione del legamento crociato anteriore (LCA) o la destabilizzazione del menisco mediale è stata considerata ottimale per lo studio dell'osteoartrite post-traumatica (PTOA) nei piccoli animali. Negli ultimi anni, modelli di compressione ciclica non invasivi sono stati utilizzati per studiare la PTOA. Questo modello è stato originariamente progettato per studiare la risposta ossea spugnosa al carico meccanico¹ ed è stato poi modificato come modello animale non chirurgico per gli studi PTOA 2,3,4,5,6. Il razionale è quello di far collidere la cartilagine articolare applicando una forza esterna periodica, che innesca una serie di risposte infiammatorie. Tuttavia, questo modello è stato applicato solo ai topi e l'entità appropriata del carico su animali più grandi non è stata discussa.

Un altro problema con il modello precedente è che il protocollo ad alto volume includeva troppi cicli, che causavano un eccessivo ispessimento dell'osso subcondrale, un effetto collaterale indesiderato, in diversi campioni⁷. Pertanto, è stato sviluppato un nuovo metodo di compressione ciclica con la grandezza appropriata per animali di grossa taglia e un effetto collaterale di carico inferiore⁸. L'obiettivo generale del presente articolo è quello di descrivere il protocollo del modello di compressione ciclica non invasivo nei ratti e osservare i risultati rappresentativi della degenerazione della cartilagine. L'attuale protocollo aiuterebbe i lettori interessati all'applicazione del modello di compressione ciclica non invasivo sui ratti.

Protocollo

Il protocollo è stato approvato dal Comitato per la ricerca sugli animali dell'Università di Kyoto (numero di approvazione: Med kyo 17616).

1. Eseguire la compressione ciclica in vivo sul ginocchio del ratto

1. Indurre l'anestesia animale sperimentale
   1. Indurre l'anestesia in un ratto Wistar di 12 settimane (256,8 ± 8,7 g) mediante inalazione di soluzione di isoflurano al 5% nella scatola dell'anestesia.
   2. Iniettare per via intraperitoneale una miscela di tre agenti anestetici⁹, tra cui medetomidina, midazolam e butorfanolo, a 2 mg/kg del peso corporeo del ratto e radere l'area intorno all'articolazione destra del ginocchio. Confermare l'anestesia sufficiente per mancanza di riflesso del pedale a un pizzico di punta.
2. Montare il ratto anestetizzato sul dispositivo di fissaggio.
   1. Posizionare il ratto anestetizzato sdraiato sulla pancia sulla piastra di base (Figura 1), con il ginocchio destro attaccato a un piccolo pezzo di resina con una scanalatura concava. Posizionare l'arto posteriore destro nelle posizioni di estensione dell'anca, flessione del ginocchio e estensione della caviglia, con il ginocchio flesso a circa 140°. Accomodare il tallone del topo sulla scanalatura a forma di cuneo sul dispositivo mobile.
   2. Spostare il dispositivo di fissaggio sullo strumento di prova di sollecitazione/trazione (vedere la tabella dei materiali). Dopo essersi assicurati che non vi siano contatti con la cella di carico, aprire il software di controllo dello strumento di prova di sollecitazione/trazione (Table of Materials) e fare clic sul pulsante Calibration . Dopo la calibrazione, fissare con attenzione la parte superiore del telaio alla cella di carico. Per mantenere l'articolazione del ginocchio strettamente attaccata al telaio, accendere lentamente la manopola rotante sul pannello operativo principale mobile fino a quando il precarico raggiunge 5 N.
3. Creare un metodo di caricamento e impostare il test di compressione.
   1. Nel menu principale, fare clic su Crea un nuovo metodo | Etichetta di sistema . Impostare Modalità test su Ciclo e Tipo test su Compressione. Fare clic sull'etichetta Sensore e selezionare la scheda Test per verificare che il limite sia entro 60 N. Inoltre, selezionate la scheda Traccia e verificate che il limite sia compreso tra 500 mm.
      NOTA: il passaggio precedente interromperà immediatamente l'operazione se si verifica un grande spostamento sul punto di sollecitazione.
   2. Sotto l'etichetta di controllo Test, selezionare Origine della crescita per avviare il programma principale con 0,3%/fondo scala. Delle quattro sezioni in un ciclo di carico, impostare la velocità di corsa in controllo nella 1a^e 3a^{sezione su} 1 mm/s. Impostare la forza di prova massima nella 2a sezione su 20 N e la forza di prova minima nella 4a^{sezione su} 5 N. Impostare "la durata della sospensione" su 0,5 s per il carico di picco e 10 s per il carico minimo (Figura 2).
      NOTA: poiché questo passaggio definisce ogni ciclo, assicurarsi che le superfici articolari siano in contatto tra loro e si muovano a una velocità ragionevole e che il movimento venga mantenuto.
   3. Nella scheda Precaricamento nella parte inferiore della pagina, assicurarsi che On sia selezionato, che la velocità di rimozione della deflessione sia impostata su 100 mm/min e che la forza massima sia 5 N. Nell'etichetta Campione , impostare il materiale come metallo.
      NOTA: queste impostazioni dettagliate possono essere specifiche per ogni produttore.
   4. Nel menu Principale, nella sezione Seleziona metodo e test, selezionare il metodo appena creato e fare clic su Avvia per iniziare il test.
      NOTA: La tabella in basso mostra le misurazioni effettive del carico di picco e dello spostamento.
   5. Impostare il numero di cicli su 60.
      NOTA: L'intera sessione di caricamento comprende 60 cicli, che dura circa 12 minuti. Nel gruppo di controllo, i ratti sono stati sottoposti a 5 N di pre-carico per 12 minuti di pre-carico nelle stesse condizioni.
4. Dopo il caricamento, riportare il ratto nella sua gabbia e monitorare fino al completo recupero. Mantenere un programma chiaro-buio di 12-12 ore nella gabbia con spazio sufficiente e cibo ad libitum. Dopo i periodi sperimentali richiesti, sacrificare i ratti con un sovradosaggio della miscela dei tre agenti anestetici iniettati per via intraperitoneale o inalazione di anidride carbonica per l'analisi (1 h-8 settimane).

Risultati

È stato ottenuto un risultato rappresentativo delle variazioni a breve termine (1 ora e 12 ore) della vitalità dei condrociti in campioni sottoposti a carico ciclico di 20 N. Come mostrato nella Figura 3, il numero di condrociti morti (fluorescenza rossa) è aumentato a 12 ore dopo il trauma. Al contrario, il numero di condrociti viventi (fluorescenza verde) ha continuato a diminuire, con alcuni campioni che non contengono condrociti vivi nell'area interessata.

...

Discussione

Per la prima volta, l'attuale protocollo mostra come stabilire un modello di lesione cartilaginea indotta dal carico sul condilo femorale laterale nei ratti, simile al modello di danno intra-articolare nei roditori più piccoli come il topo². Tuttavia, il protocollo di carico nei topi ha causato gravi formazioni osteofite e lesioni del legamento crociato, che non era l'ideale per valutare gli effetti della compressione ciclica. L'attuale protocollo ha creato una lesione focale della cartilagine ne...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic Apparatus for Small Animals	SHINANO MFG CO.,LTD.	SN-487-0T
Autograph AG-X	Shimadzu Corp	N.A.	Precision Universal / Tensile Tester
Fluoview FV10i microscope	Olympus Corp	N.A.	A fully automated confocal laser-scanning microscope
ISOFLURANE Inhalation Solution	Pfizer Japan Inc.	(01)14987114133400
LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit	Thermo Fisher Scientific Japan Inc	L3224	A quick and easy two-color assay to determine viability of cells
TRAPEZIUM X Software	Shimadzu Corp	N.A.	Data processing software for Autograph AG-X