래트 무릎의 순환 로딩 유도 관절내 연골 병변 모델을 생성하기 위한 비침습적 방법

요약

여기에서는 20N 이상의 60 순환 압박에 의해 생성 된 쥐 무릎의 순환 로딩 유도 관절 내 연골 병변 모델을 제시하여 쥐의 대퇴 과두 연골에 손상을 입 힙니다.

초록

원발성 골관절염 (OA)의 병태 생리학은 아직 명확하지 않습니다. 그러나 상대적으로 젊은 연령 그룹에서 OA의 특정 하위 분류는 관절 연골 손상 및 인대 경련의 병력과 관련이 있을 수 있습니다. 무릎 OA의 수술 동물 모델은 외상 후 OA의 발병 및 진행을 이해하는 데 중요한 역할을 하며 이 질병에 대한 새로운 치료법 개발을 돕습니다. 그러나 최근 중재 평가에 영향을 미칠 수있는 외상성 염증을 피하기 위해 비수술 모델이 고려되었습니다.

이 연구에서는 생체 내 주기적 압축 하중에 의해 유도된 관절 내 연골 병변 쥐 모델이 개발되어 연구자들은 (1) 국소 연골 손상을 일으킬 수 있는 최적의 하중 크기, 속도 및 지속 시간을 결정할 수 있었습니다. (2) 연골세포 활력의 외상 후 시공간적 병리학적 변화를 평가하고; (3) 관절 압축 하중에 대한 적응 및 복구 메커니즘에 관여하는 파괴 또는 보호 분자의 조직학적 발현을 평가합니다. 이 보고서는 쥐 모델에서이 새로운 연골 병변에 대한 실험 프로토콜을 설명합니다.

서문

전통적으로 내측 반월판의 전방 십자 인대 (ACL) 절개 또는 불안정화는 작은 동물의 외상 후 골관절염 (PTOA)을 조사하는 데 최적으로 간주되었습니다. 최근 몇 년 동안 비 침습적 순환 압축 모델이 PTOA를 연구하는 데 사용되었습니다. 이 모델은 원래^{기계적 하중1}에 대한 해면골 반응을 조사하기 위해 설계되었으며 PTOA 연구 2,3,4,5,6을 위한 비수술적 동물 모델로 수정되었습니다. 이론적 근거는 주기적인 외력을 가하여 관절 연골을 충돌시켜 일련의 염증 반응을 유발하는 것입니다. 그러나이 모델은 마우스에만 적용되었으며 더 큰 동물에 대한 적절한 하중 크기는 논의되지 않았습니다.

이전 모델의 또 다른 문제점은 대용량 프로토콜이 너무 많은 사이클을 포함하여,^{여러 샘플에서} 원치 않는 부작용인 연골하 뼈의 과도한 비후를 유발한다는 것이다7. 따라서, 큰 동물에 대해 적절한 크기와 더 낮은 로딩 부작용을 갖는 주기적 압축의 새로운 방법이 개발되었다⁸. 현재 기사의 전반적인 목표는 쥐에서 비침습적 순환 압축 모델의 프로토콜을 설명하고 연골 변성의 대표적인 결과를 관찰하는 것입니다. 현재 프로토콜은 쥐에 대한 비 침습적 순환 압축 모델의 적용에 관심이있는 독자를 도울 것입니다.

프로토콜

이 프로토콜은 교토 대학 동물 연구위원회 (승인 번호 : Med kyo 17616)의 승인을 받았습니다.

1. 쥐 무릎에 생체 내 순환 압박 수행

1. 실험동물 마취 유도
   1. 12주령의 Wistar 랫트(256.8 ± 8.7 g)를 마취 박스에 5% 이소플루란 용액을 흡입하여 마취를 유도하였다.
   2. 메데토미딘, 미다졸람, 부토르파놀을 포함한 3가지 마취제⁹의 혼합물을 쥐 체중 2mg/kg에 복강 주사하고 오른쪽 무릎 관절 주변을 면도합니다. 발가락 꼬집음에 대한 페달 반사가 부족하여 충분한 마취를 확인하십시오.
2. 마취 된 쥐를 고정 장치에 장착하십시오.
   1. 마취된 쥐를 베이스 플레이트(그림 1)의 배에 놓고 오른쪽 무릎을 오목한 홈이 있는 작은 수지 조각에 부착합니다. 오른쪽 뒷다리를 고관절 확장, 무릎 굴곡 및 발목 확장 위치에 놓고 무릎을 약 140° 구부립니다. 움직일 수있는 고정 장치의 쐐기 모양의 홈에 쥐의 발 뒤꿈치를 수용하십시오.
   2. 고정 장치를 응력/인장 시험 기기로 옮깁니다( 재료 표 참조). 로드셀과의 접촉이 없는지 확인한 후 응력/인장 시험 기기 제어 소프트웨어(재료 표)를 열고 교정 버튼을 클릭합니다. 교정 후 프레임 상단을로드 셀에 조심스럽게 부착하십시오. 무릎 관절을 프레임에 밀접하게 부착하려면 예압이 5N에 도달할 때까지 이동식 주 작동 패널의 회전 손잡이를 천천히 켭니다.
3. 로딩 방법을 빌드하고 압축 테스트를 설정합니다.
   1. 주 메뉴에서 새 메서드 만들기를 클릭합니다| 시스템 레이블. 테스트 모드를 주기로 설정하고 테스트 유형을 압축으로 설정합니다. 센서 레이블을 클릭하고 테스트 탭을 선택하여 한계가 60N 이내인지 확인합니다. 또한 스트로크 탭을 선택하고 한계가 500mm 이내인지 확인합니다.
      알림: 위의 단계는 응력 지점에 큰 변위가 있는 경우 즉시 작동을 중지합니다.
   2. 테스트 컨트롤 레이블 아래에서 성장 기원을 선택하여 0.3%/전체 배율로 기본 프로그램을 시작합니다. 로딩 사이클의 4개 섹션 중 1번째 및 3^번째 섹션에서 제어되는 스트로크 속도를 1mm/s로 설정합니다. 2번째 섹션의 최대 테스트 힘을 20N으로 설정하고 4^번째 섹션의 최소 테스트 힘을 5N으로 설정합니다. "유지 지속 시간"을 피크 부하의 경우 0.5초, 최소 부하의 경우 10초로 설정합니다(그림 2).
      알림: 이 단계는 모든 사이클을 정의하므로 조인트 표면이 서로 접촉하고 적절한 속도로 움직이며 동작이 유지되는지 확인하십시오.
   3. 페이지 하단의 사전 로드 탭에서 On 이 선택되어 있고 처짐 제거 속도가 100mm/min으로 설정되어 있으며 최대 힘이 5N인지 확인합니다. 시편 레이블에서 재질 을 금속으로 설정합니다.
      참고: 이러한 세부 설정은 각 제조업체에 따라 다를 수 있습니다.
   4. 주 메뉴의 메서드 및 테스트 선택 섹션에서 방금 빌드한 메서드를 선택하고 시작을 클릭하여 테스트를 시작합니다.
      알림: 하단의 표는 피크 하중 및 변위의 실제 측정값을 보여줍니다.
   5. 주기 수를 60으로 설정합니다.
      참고: 전체 로딩 세션에는 약 12분 동안 지속되는 60개의 사이클이 포함됩니다. 대조군에서, 랫트는 동일한 조건 하에서 12분 예비로딩 동안 5N 예비로딩을 받았다.
4. 적재 후 쥐를 새장으로 돌려 보내고 완전히 회복 될 때까지 모니터링하십시오. 케이지에서 12-12 시간의 밝은 어두운 일정을 유지하여 충분한 공간과 음식을 자유롭게 유지하십시오 . 필요한 실험 기간 후에, 분석을 위해 복강 내 주사 또는 이산화탄소 흡입 (1 h-8 주)에 주사 된 3 개의 마취제 혼합물의 과다 복용으로 랫트를 희생시킨다.

결과

20 N 순환 로딩을 실시한 샘플에서 연골세포 생존율의 단기 변화(1시간 및 12시간)의 대표적인 결과가 얻어졌다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 죽은 연골 세포의 수 (적색 형광)는 외상 후 12 시간에 증가했습니다. 반대로, 살아있는 연골 세포의 수 (녹색 형광)는 계속 감소했으며, 일부 샘플에는 감염된 부위에 살아있는 연골 세포가 포함되어 있지 않았습니다.

?...

토론

처음으로, 현재 프로토콜은 마우스²와 같은 더 작은 설치류에서의 관절 내 손상 모델과 유사하게 쥐의 외측 대퇴 과두에 로딩 유도 연골 병변의 모델을 확립하는 방법을 보여줍니다. 그러나 마우스의 로딩 프로토콜은 심각한 골괴사 형성 및 십자 인대 병변을 유발하여 주기적 압축의 효과를 평가하는 데 이상적이지 않았습니다. 현재의 프로토콜은 훨씬 낮은 로딩 포스를 가진 쥐...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic Apparatus for Small Animals	SHINANO MFG CO.,LTD.	SN-487-0T
Autograph AG-X	Shimadzu Corp	N.A.	Precision Universal / Tensile Tester
Fluoview FV10i microscope	Olympus Corp	N.A.	A fully automated confocal laser-scanning microscope
ISOFLURANE Inhalation Solution	Pfizer Japan Inc.	(01)14987114133400
LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit	Thermo Fisher Scientific Japan Inc	L3224	A quick and easy two-color assay to determine viability of cells
TRAPEZIUM X Software	Shimadzu Corp	N.A.	Data processing software for Autograph AG-X