Sıçan Dizinin Döngüsel Yüklemeye Bağlı Eklem İçi Kıkırdak Lezyon Modelini Oluşturmak için Non-İnvaziv Bir Yöntem

Özet

Burada, sıçan dizinin siklik yüklemeye bağlı eklem içi kıkırdak lezyonu modeli, 20 N üzerinde 60 siklik kompresyon ile oluşturulan ve sıçanlarda femoral kondiler kıkırdakta hasara neden olan modeli sunuyoruz.

Özet

Primer osteoartritin (OA) patofizyolojisi belirsizliğini korumaktadır. Bununla birlikte, nispeten daha genç yaş gruplarında OA'nın spesifik bir alt sınıflandırması, eklem kıkırdak hasarı ve ligament avulsiyonu öyküsü ile muhtemelen ilişkilidir. Diz OA'sının cerrahi hayvan modelleri, travma sonrası OA'nın başlangıcını ve ilerlemesini anlamada önemli bir rol oynamakta ve bu hastalık için yeni tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olmaktadır. Bununla birlikte, son zamanlarda müdahalenin değerlendirilmesini etkileyebilecek travmatik inflamasyonu önlemek için cerrahi olmayan modeller düşünülmüştür.

Bu çalışmada, araştırmacıların (1) fokal kıkırdak hasarına neden olabilecek yükün optimal büyüklüğünü, hızını ve süresini belirlemelerine olanak tanıyan in vivo siklik kompresyon yüklemesi ile indüklenen bir eklem içi kıkırdak lezyonu sıçan modeli geliştirilmiştir; (2) kondrosit canlılığındaki travma sonrası uzaysal zamansal patolojik değişiklikleri değerlendirmek; ve (3) eklem basınç yüklerine karşı adaptasyon ve onarım mekanizmalarında rol oynayan yıkıcı veya koruyucu moleküllerin histolojik ekspresyonunu değerlendirir. Bu rapor, bir sıçan modelinde bu yeni kıkırdak lezyonu için deneysel protokolü açıklamaktadır.

Giriş

Geleneksel olarak, medial menisküsün ön çapraz bağ (ACL) transeksiyonu veya destabilizasyonu, küçük hayvanlarda travma sonrası osteoartriti (PTOA) araştırmak için en uygun olarak kabul edilmiştir. Son yıllarda, PTOA'yı incelemek için non-invaziv siklik kompresyon modelleri kullanılmıştır. Bu model başlangıçta mekanik yükleme^1'e cancellous kemik yanıtını araştırmak için tasarlandı ve daha sonra PTOA çalışmaları 2,3,4,5,6 için cerrahi olmayan bir hayvan modeli olarak değiştirildi. Mantık, bir dizi enflamatuar yanıtı tetikleyen periyodik bir dış kuvvet uygulayarak eklem kıkırdağını çarpıştırmaktır. Bununla birlikte, bu model sadece farelere uygulanmıştır ve daha büyük hayvanlara uygun yükleme büyüklüğü tartışılmamıştır.

Önceki modelle ilgili bir başka sorun, yüksek hacimli protokolün, birkaç örnekte istenmeyen bir yan etki olan subkondral kemiğin aşırı kalınlaşmasına neden olan çok fazla döngü içermesidir⁷. Bu nedenle, büyük hayvanlar için uygun büyüklükte ve daha düşük yükleme yan etkisine sahip yeni bir siklik sıkıştırma yöntemi geliştirilmiştir⁸. Bu makalenin genel amacı, sıçanlarda non-invaziv siklik kompresyon modelinin protokolünü tanımlamak ve kıkırdak dejenerasyonunun temsili sonuçlarını gözlemlemektir. Mevcut protokol, non-invaziv siklik kompresyon modelinin sıçanlar üzerinde uygulanmasıyla ilgilenen okuyuculara yardımcı olacaktır.

Protokol

Protokol, Kyoto Üniversitesi Hayvan Araştırma Komitesi tarafından onaylanmıştır (onay numarası: Med kyo 17616).

1. Sıçan dizinde in vivo siklik kompresyon gerçekleştirin

1. Deneysel hayvan anestezisini indükleyin
   1. Anestezi kutusunda% 5 izofluran çözeltisinin solunmasıyla 12 haftalık bir Wistar sıçanında (256.8 ± 8.7 g) anesteziyi indükleyin.
   2. İntraperitoneal olarak, sıçan vücut ağırlığının 2 mg / kg'ında medetomidin, midazolam ve butorphanol dahil olmak üzere üç anestezik ajan⁹ karışımı enjekte edilir ve sağ diz eklemi etrafındaki alanı tıraş edin. Bir ayak parmağını sıkıştırmak için pedal refleksi eksikliği ile yeterli anesteziyi onaylayın.
2. Anestezi uygulanan sıçanı fiksasyon cihazına monte edin.
   1. Karnında yatan anestezi altındaki sıçanı taban plakasına yerleştirin (Şekil 1), sağ diz içbükey bir oluklu küçük bir reçine parçasına tutturulmuş. Sağ arka bacağı kalça uzatma, diz fleksiyonu ve ayak bileği uzatma pozisyonlarına yerleştirin, diz yaklaşık 140 ° 'de bükülür. Sıçanın topuğunu, hareketli fikstür üzerindeki kama şeklindeki oluğa yerleştirin.
   2. Fiksasyon cihazını gerilme/çekme test cihazına taşıyın (bkz. Yük hücresiyle temas olmadığından emin olduktan sonra, gerilme/çekme test cihazı kontrol yazılımını açın (Malzeme Tablosu) ve Kalibrasyon düğmesine tıklayın. Kalibrasyondan sonra, çerçevenin üst kısmını yük hücresine dikkatlice takın. Diz eklemini çerçeveye yakından bağlı tutmak için, hareketli ana çalışma panelindeki döner düğmeyi, ön yük 5 N'ye ulaşana kadar yavaşça açın.
3. Bir yükleme yöntemi oluşturun ve sıkıştırma testini ayarlayın.
   1. Ana menüde, Yeni bir yöntem oluştur'a tıklayın | Sistem etiketi. Test Modu'nu Döngü olarak ve Test Türü'nü Sıkıştırma olarak ayarlayın. Sensör etiketine tıklayın ve sınırın 60 N içinde olup olmadığını kontrol etmek için Test sekmesini seçin. Ek olarak, Kontur sekmesini seçin ve sınırın 500 mm içinde olup olmadığını kontrol edin.
      NOT: Yukarıdaki adım, gerilim noktasında büyük bir yer değiştirme olması durumunda işlemi hemen durduracaktır.
   2. Test denetimi etiketinin altında, ana programı %0,3/tam ölçekle başlatmak için Büyümenin kaynağı'nı seçin. Bir yükleme döngüsündeki dört bölümden, 1. ve 3^. bölümlerde kontrol altındaki Strok hızını 1 mm / s'ye ayarlayın. 2. bölümdeki Maksimum test kuvvetini 20 N'ye ve 4. bölümdeki Minimum test kuvvetini 5^N'ye ayarlayın^. "Bekletme Süresi"ni pik yük için 0,5 sn ve minimum yük için 10 s olarak ayarlayın (Şekil 2).
      NOT: Bu adım her döngüyü tanımladığından, bağlantı yüzeylerinin birbirleriyle temas halinde olduğundan ve makul bir hızda hareket ettiğinden ve hareketin korunduğundan emin olun.
   3. Sayfanın altındaki Ön yükleme sekmesinde, Açık seçeneğinin işaretli olduğundan, Sapma kaldırma hızının 100 mm/dak olarak ayarlandığından ve maksimum kuvvetin 5 N olduğundan emin olun. Örnek etiketinde, Malzemeyi Metal olarak ayarlayın.
      NOT: Bu ayrıntılı ayarlar her üretici için özel olabilir.
   4. Ana menüde, Yöntem ve test seç bölümünün altında, yeni oluşturulan yöntemi seçin ve testi başlatmak için Başlat'a tıklayın.
      NOT: Alttaki tablo, pik yük ve yer değiştirmenin gerçek ölçümlerini gösterir.
   5. Döngü sayısını 60 olarak ayarlayın.
      NOT: Tüm yükleme seansı, yaklaşık 12 dakika süren 60 döngü içerir. Kontrol grubunda, sıçanlar aynı koşullar altında 12 dakikalık ön yükleme için 5 N ön yüklemeye tabi tutuldu.
4. Yükledikten sonra, sıçanı kafesine geri döndürün ve tamamen iyileşene kadar izleyin. Kafeste yeterli alan ve yiyecek ad libitum ile 12-12 saatlik bir açık-karanlık program uygulayın. Gerekli deney sürelerinden sonra, sıçanları intraperitoneal olarak enjekte edilen üç anestezik ajanın karışımının aşırı dozda veya analiz için karbondioksit inhalasyonu ile feda edin (1 h-8 hafta).

Sonuçlar

20 N siklik yüklemeye maruz kalan numunelerde kondrosit canlılığındaki kısa süreli değişikliklerin (1 saat ve 12 saat) temsili bir sonucu elde edildi. Şekil 3'te gösterildiği gibi, ölü kondrositlerin (kırmızı floresan) sayısı travma sonrası 12 saatte artmıştır. Tersine, canlı kondrositlerin (yeşil floresan) sayısı azalmaya devam etti ve etkilenen bölgede canlı kondrosit içermeyen bazı örnekler vardı.

Histoloji, 20 N dinamik yüklem...

Tartışmalar

İlk kez, mevcut protokol, fare² gibi daha küçük kemirgenlerde eklem içi hasar modeline benzer şekilde, sıçanlarda lateral femoral kondil üzerinde yükleme kaynaklı kıkırdak lezyonu modelinin nasıl oluşturulacağını göstermektedir. Bununla birlikte, farelerde yükleme protokolü, siklik kompresyonun etkilerini değerlendirmek için ideal olmayan ciddi osteofit oluşumuna ve çapraz bağ lezyonlarına neden olmuştur. Mevcut protokol, çok daha düşük yükleme kuvvetine sahip sı?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic Apparatus for Small Animals	SHINANO MFG CO.,LTD.	SN-487-0T
Autograph AG-X	Shimadzu Corp	N.A.	Precision Universal / Tensile Tester
Fluoview FV10i microscope	Olympus Corp	N.A.	A fully automated confocal laser-scanning microscope
ISOFLURANE Inhalation Solution	Pfizer Japan Inc.	(01)14987114133400
LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit	Thermo Fisher Scientific Japan Inc	L3224	A quick and easy two-color assay to determine viability of cells
TRAPEZIUM X Software	Shimadzu Corp	N.A.	Data processing software for Autograph AG-X