שיטה לא פולשנית ליצירת מודל סחוס תוך מפרקי הנגרם על ידי העמסה מחזורית של ברך החולדה

Summary

כאן אנו מציגים את מודל נגע הסחוס התוך-מפרקי הנגרם על ידי העמסה מחזורית של ברך החולדה, שנוצר על ידי 60 לחיצות מחזוריות מעל 20 N, וכתוצאה מכך נזק לסחוס הקונדילרי של הירך בחולדות.

Abstract

הפתופיזיולוגיה של דלקת מפרקים ניוונית ראשונית (OA) עדיין אינה ברורה. עם זאת, תת-סיווג ספציפי של OA בקבוצות גיל צעירות יחסית נמצא ככל הנראה בקורלציה עם היסטוריה של פגיעה בסחוס המפרקי ופגיעה ברצועות. מודלים כירורגיים של OA של הברך ממלאים תפקיד חשוב בהבנת ההתחלה וההתקדמות של OA פוסט טראומטי ומסייעים בפיתוח טיפולים חדשניים למחלה זו. עם זאת, מודלים לא כירורגיים נחשבו לאחרונה כדי למנוע דלקת טראומטית שעלולה להשפיע על הערכת ההתערבות.

במחקר זה פותח מודל של חולדות סחוס תוך-מפרקיות המושרה על-ידי העמסה מחזורית של דחיסה מחזורית in vivo , מה שאיפשר לחוקרים (1) לקבוע את הגודל, המהירות ומשך העומס האופטימליים שעלולים לגרום לנזק לסחוס המוקדי; (2) להעריך שינויים פתולוגיים מרחביים פוסט-טראומטיים בחיוניות כונדרוציטים; ו-(3) להעריך את הביטוי ההיסטולוגי של מולקולות הרסניות או מגינות המעורבות במנגנוני ההסתגלות והתיקון כנגד עומסי דחיסה של המפרקים. דו"ח זה מתאר את פרוטוקול הניסוי של נגע סחוס חדשני זה במודל של חולדה.

Introduction

באופן מסורתי, טרנסקציה של רצועה צולבת קדמית (ACL) או ערעור היציבות של המניסקוס המדיאלי נחשבו אופטימליים לחקר דלקת מפרקים ניוונית פוסט טראומטית (PTOA) בחיות קטנות. בשנים האחרונות נעשה שימוש במודלים לא פולשניים של דחיסה מחזורית כדי לחקור PTOA. דגם זה תוכנן במקור כדי לחקור את תגובת העצם להעמסה מכנית¹ ולאחר מכן שונה כמודל בעלי חיים לא ניתוחי עבור מחקרי PTOA 2,3,4,5,6. הרציונל הוא להתנגש בסחוס המפרקי על ידי הפעלת כוח חיצוני מחזורי, המעורר סדרה של תגובות דלקתיות. עם זאת, מודל זה הוחל רק על עכברים, ואת הגודל המתאים של העמסה על בעלי חיים גדולים יותר לא נדון.

בעיה נוספת עם המודל הקודם היא שהפרוטוקול בנפח גבוה כלל יותר מדי מחזורים, מה שגרם לעיבוי מוגזם של העצם התת-כונדרלית, תופעת לוואי לא רצויה, במספר דגימות⁷. לכן, פותחה שיטה חדשנית של דחיסה מחזורית עם הגודל המתאים לבעלי חיים גדולים ותופעת לוואי של העמסה נמוכה יותר⁸. המטרה הכוללת של המאמר הנוכחי היא לתאר את הפרוטוקול של מודל הדחיסה המחזורית הלא פולשנית בחולדות ולבחון את התוצאות המייצגות של ניוון הסחוס. הפרוטוקול הנוכחי יעזור לקוראים המעוניינים ביישום מודל הדחיסה המחזורית הלא פולשנית על חולדות.

Protocol

הפרוטוקול אושר על ידי ועדת המחקר בבעלי חיים של אוניברסיטת קיוטו (מספר אישור: Med kyo 17616).

1. בצע דחיסה מחזורית in vivo על ברך החולדה

1. לגרום להרדמה ניסיונית של בעלי חיים
   1. השרה הרדמה בחולדת Wistar בת 12 שבועות (256.8 ± 8.7 גרם) על ידי שאיפה של תמיסת איזופלורן 5% בתיבת ההרדמה.
   2. יש להזריק באופן תוך-צפקי תערובת של שלושה חומרי הרדמה⁹, כולל מדטומידין, מידזולם ובוטורפנול, במינון 2 מ"ג/ק"ג ממשקל גוף החולדה, ולגלח את האזור סביב מפרק ברך ימין. אשרו הרדמה מספקת על ידי חוסר רפלקס דוושה לצביטת בוהן.
2. הר את החולדה המורדמת על מכשיר הקיבוע.
   1. הניחו את החולדה המורדמת שוכבת על בטנה על לוחית הבסיס (איור 1), כאשר ברך ימין מחוברת לחתיכת שרף קטנה עם חריץ קעור. מקמו את הגפה האחורית הימנית בתנוחות הארכת הירך, כיפוף הברך והארכת הקרסול, כאשר הברך מכופפת בטמפרטורה של כ-140 מעלות. התאימו את העקב של החולדה על החריץ בצורת טריז על המתקן הנייד.
   2. העבר את מכשיר הקיבוע למכשיר בדיקת הלחץ/מתיחה (ראה טבלת חומרים). לאחר שווידאתם שאין מגעים עם תא העומס, פתחו את תוכנת בקרת מכשיר בדיקת הלחץ/מתיחה (Table of Materials) ולחצו על כפתור הכיול . לאחר הכיול, חבר את החלק העליון של המסגרת לתא הטעינה בזהירות. כדי לשמור על מפרק הברך מחובר היטב למסגרת, הפעל את הידית הסיבובית בלוח התפעול הראשי הנייד באיטיות עד שהעומס מראש מגיע ל-5 N.
3. בנה שיטת טעינה והגדר את בדיקת הדחיסה.
   1. בתפריט הראשי, לחץ על צור שיטה חדשה | תווית מערכת . הגדר את מצב הבדיקה למחזור, ואת סוג הבדיקה לדחיסה. לחץ על תווית החיישן ובחר בכרטיסייה בדיקה כדי לבדוק שהמגבלה היא בטווח של 60 N. בנוסף, בחר את הכרטיסייה קו ולבדוק כי המגבלה היא בתוך 500 מ"מ.
      הערה: השלב לעיל יפסיק את הפעולה באופן מיידי אם יש תזוזה גדולה על נקודת הלחץ.
   2. תחת תווית בקרת הבדיקה, בחר מקור הצמיחה כדי להתחיל את התוכנית הראשית עם קנה מידה מלא של 0.3%. מבין ארבעת המקטעים במחזור טעינה, הגדר את מהירות השבץ בשליטה בקטעים 1 st ו^{- 3 ל- 1} מ"מ לשנייה. הגדר את כוח הבדיקה המרבי בחלק^השני ל- 20 N, ואת כוח הבדיקה המינימלי בחלק^הרביעי עד 5 N. הגדר את "משך ההחזקה" ל- 0.5 שניות עבור עומס השיא ו- 10 שניות עבור העומס המינימלי (איור 2).
      הערה: מכיוון ששלב זה מגדיר כל מחזור, ודא שמשטחי המפרקים נמצאים במגע זה עם זה ונעים במהירות סבירה ושהתנועה נשמרת.
   3. בכרטיסייה Pre-load בתחתית הדף, ודא שהאפשרות מופעל מסומנת, מהירות הסרת הסטייה מוגדרת ל- 100 מ"מ לדקה, והכוח המרבי הוא 5 N. בתווית 'דגימה', הגדר את החומר כמתכת.
      הערה: הגדרות מפורטות אלה עשויות להיות ספציפיות עבור כל יצרן.
   4. בתפריט הראשי, תחת הקטע בחר שיטה ובדיקה, בחר את השיטה שזה עתה נבנתה ולחץ על התחל כדי להתחיל בבדיקה.
      הערה: הטבלה בתחתית מציגה את המדידות בפועל של עומס השיא והתזוזה.
   5. הגדר את מספר המחזורים ל- 60.
      הערה: כל סשן הטעינה כולל 60 מחזורים, שנמשכים כ-12 דקות. בקבוצת הביקורת, החולדות עברו 5 N טעינה מוקדמת במשך 12 דקות לפני הטעינה באותם תנאים.
4. לאחר הטעינה, החזירו את החולדה לכלוב שלה ועקבו אחריה עד להחלמה מלאה. שמרו על לוח זמנים של 12-12 שעות בהיר-חושך בכלוב עם מספיק מקום ומזון עד ליביטום. לאחר תקופות הניסוי הנדרשות, להקריב את החולדות עם מנת יתר של תערובת של שלושת חומרי ההרדמה מוזרק תוך צפק או שאיפת פחמן דו חמצני לניתוח (1 h-8 שבועות).

תוצאות

התקבלה תוצאה מייצגת של השינויים קצרי הטווח (1 שעות ו-12 שעות) בכדאיות הכונדרוציטים בדגימות שהיו נתונות להעמסה מחזורית של 20 N. כפי שניתן לראות באיור 3, מספר הכונדרוציטים המתים (פלואורסצנציה אדומה) עלה ב-12 שעות לאחר טראומה. לעומת זאת, מספר הכונדרוציטים החיים (פלואורסצנציה ירוקה) ...

Discussion

לראשונה, הפרוטוקול הנוכחי מראה כיצד לבסס מודל של נגע סחוס הנגרם על ידי העמסה על קונדיל הירך הלטרלי בחולדות, בדומה למודל הנזק התוך-מפרקי במכרסמים קטנים יותר כמו העכבר². עם זאת, פרוטוקול ההעמסה בעכברים גרם להיווצרות אוסטאופיטים חמורים ונגעים ברצועות צלב, מה שלא היה אידיאלי להער?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic Apparatus for Small Animals	SHINANO MFG CO.,LTD.	SN-487-0T
Autograph AG-X	Shimadzu Corp	N.A.	Precision Universal / Tensile Tester
Fluoview FV10i microscope	Olympus Corp	N.A.	A fully automated confocal laser-scanning microscope
ISOFLURANE Inhalation Solution	Pfizer Japan Inc.	(01)14987114133400
LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit	Thermo Fisher Scientific Japan Inc	L3224	A quick and easy two-color assay to determine viability of cells
TRAPEZIUM X Software	Shimadzu Corp	N.A.	Data processing software for Autograph AG-X