Неинвазивный метод генерации модели внутрисуставного поражения внутрисуставного хряща крысы, вызванной циклической нагрузкой

Резюме

Здесь мы представляем циклическую модель внутрисуставного хрящевого поражения колена крысы, вызванную циклической нагрузкой, вызванной 60 циклическими компрессиями более 20 Н, что приводит к повреждению бедренного кондилерного хряща у крыс.

Аннотация

Патофизиология первичного остеоартрита (ОА) остается неясной. Однако специфическая подклассификация ОА в относительно более молодых возрастных группах, вероятно, коррелирует с историей повреждения суставного хряща и авульсии связок. Хирургические животные модели ОА колена играют важную роль в понимании начала и прогрессирования посттравматического ОА и помогают в разработке новых методов лечения этого заболевания. Тем не менее, недавно были рассмотрены нехирургические модели, чтобы избежать травматического воспаления, которое может повлиять на оценку вмешательства.

В этом исследовании была разработана модель внутрисуставного поражения хряща крыс, индуцированная циклической сжимающей нагрузкой in vivo , которая позволила исследователям (1) определить оптимальную величину, скорость и продолжительность нагрузки, которые могут вызвать очаговое повреждение хряща; (2) оценить посттравматические пространственно-временные патологические изменения жизнеспособности хондроцитов; и (3) оценить гистологическую экспрессию деструктивных или защитных молекул, которые участвуют в механизмах адаптации и восстановления против суставных сжимающих нагрузок. В этом отчете описывается экспериментальный протокол для этого нового поражения хряща на модели крысы.

Введение

Традиционно трансекция передней крестообразной связки (ACL) или дестабилизация медиального мениска считается оптимальной для исследования посттравматического остеоартрита (ПТОА) у мелких животных. В последние годы для изучения ПТОА использовались неинвазивные циклические компрессионные модели. Эта модель была первоначально разработана для исследования реакции костной ткани на механическую нагрузку¹, а затем была модифицирована как нехирургическая модель на животных для исследований PTOA ^2,3,4,5,6. Обоснование состоит в том, чтобы столкнуть суставной хрящ путем применения периодической внешней силы, которая вызывает серию воспалительных реакций. Однако эта модель была применена только к мышам, и соответствующая величина нагрузки на более крупных животных не обсуждалась.

Другая проблема с предыдущей моделью заключается в том, что протокол большого объема включал слишком много циклов, что вызывало чрезмерное утолщение субхондральной кости, нежелательный побочный эффект, в нескольких образцах⁷. Поэтому был разработан новый метод циклического сжатия с соответствующей величиной для крупных животных и более низким побочным эффектом нагрузки⁸. Общей целью данной статьи является описание протокола неинвазивной циклической компрессионной модели у крыс и наблюдение за репрезентативными результатами дегенерации хряща. Текущий протокол поможет читателям, заинтересованным в применении неинвазивной модели циклического сжатия на крысах.

протокол

Протокол был одобрен Комитетом по исследованиям животных Киотского университета (номер одобрения: Med kyo 17616).

1. Выполните циклическое сжатие in vivo на колене крысы

1. Индуцировать экспериментальную анестезию животных
   1. Индуцировать анестезию у 12-недельной крысы Вистар (256,8 ± 8,7 г) путем вдыхания 5% раствора изофлурана в анестезиологическом боксе.
   2. Внутрибрюшинно вводят смесь трех анестетиков⁹, включая медетомидин, мидазолам и буторфанол, при 2 мг/кг массы тела крысы и сбривают область вокруг правого коленного сустава. Подтвердите достаточную анестезию отсутствием педального рефлекса к защемлению пальца ноги.
2. Установите анестезированную крысу на фиксирующее устройство.
   1. Поместите обезболенную крысу, лежащую на животе на опорной пластине (рисунок 1), с правым коленом, прикрепленным к небольшому кусочку смолы с вогнутой канавкой. Поместите правую заднюю конечность в положение разгибания бедра, сгибания колена и разгибания лодыжки, при этом колено согнуто примерно на 140°. Разместите пятку крысы на клиновидной канавке на подвижном приспособлении.
   2. Переместите фиксирующее устройство к прибору для испытания на напряжение/растяжение (см. Таблицу материалов). Убедившись, что контакты с тензодатчиком отсутствуют, откройте программное обеспечение для управления прибором для испытания на напряжение/растяжение (Таблица материалов) и нажмите кнопку Калибровка . После калибровки аккуратно прикрепите верхнюю часть рамы к тензодатчику. Чтобы коленный сустав был плотно прикреплен к раме, медленно включайте поворотную ручку на подвижной основной операционной панели, пока предварительная нагрузка не достигнет 5 Н.
3. Создайте метод загрузки и настройте тест сжатия.
   1. В Главном меню выберите команду Создать новый метод | Системная метка. Установите для параметра Тестовый режим значение Цикл, а для параметра Тип теста — значение Сжатие. Нажмите на метку Датчик и выберите вкладку Тест , чтобы убедиться, что предел находится в пределах 60 Н. Кроме того, выберите вкладку «Обводка» и убедитесь, что ограничение находится в пределах 500 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанный шаг немедленно остановит операцию, если есть большое смещение на точке напряжения.
   2. Под контрольной меткой Тестирование выберите Происхождение роста , чтобы запустить основную программу с 0,3% / полная шкала. Из четырех секций в цикле загрузки установите скорость хода в управлении в^1-й и^{3-й секциях} на 1 мм/с. Установите максимальное испытательное усилие во^2-й секции на 20 Н, а минимальное испытательное усилие в^{4-м участке} на 5 Н. Установите "Длительность удержания" на 0,5 с для пиковой нагрузки и 10 с для минимальной нагрузки (рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку этот этап определяет каждый цикл, убедитесь, что суставные поверхности находятся в контакте друг с другом и движутся с разумной скоростью и что движение поддерживается.
   3. На вкладке Предварительная загрузка в нижней части страницы убедитесь, что установлен флажок Вкл ., скорость удаления отклонения установлена на 100 мм/мин, а максимальное усилие равно 5 Н. В метке Образец установите Материал как Металл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти подробные настройки могут быть специфичными для каждого производителя.
   4. В главном меню в разделе Выбор метода и теста выберите только что созданный метод и нажмите кнопку Пуск , чтобы начать тест.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице внизу показаны фактические измерения пиковой нагрузки и смещения.
   5. Установите число циклов равным 60.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Весь сеанс загрузки включает в себя 60 циклов, которые длятся примерно 12 минут. В контрольной группе крысы подвергались предварительной загрузке 5 Н в течение 12 мин предварительной нагрузки в тех же условиях.
4. После загрузки верните крысу в клетку и следите за полным выздоровлением. Поддерживайте 12-12 ч светло-темный график в клетке с достаточным пространством и пищей ad libitum. После необходимых экспериментальных периодов приносят в жертву крысам при передозировке смесь трех анестетиков, вводимых внутрибрюшинно или ингаляцией углекислого газа для анализа (1 ч-8 недель).

Результаты

Получен репрезентативный результат кратковременных изменений (1 ч и 12 ч) жизнеспособности хондроцитов в образцах, подвергшихся циклической нагрузке 20 Н. Как показано на рисунке 3, количество мертвых хондроцитов (красная флуоресценция) увеличилось через 12 ч после травмы....

Обсуждение

Впервые текущий протокол показывает, как установить модель вызванного нагрузкой поражения хряща на боковом мыщелке бедренной кости у крыс, аналогичную модели внутрисуставного повреждения у более мелких грызунов, таких как мышь². Однако протокол загрузки у мышей вызывал т...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic Apparatus for Small Animals	SHINANO MFG CO.,LTD.	SN-487-0T
Autograph AG-X	Shimadzu Corp	N.A.	Precision Universal / Tensile Tester
Fluoview FV10i microscope	Olympus Corp	N.A.	A fully automated confocal laser-scanning microscope
ISOFLURANE Inhalation Solution	Pfizer Japan Inc.	(01)14987114133400
LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit	Thermo Fisher Scientific Japan Inc	L3224	A quick and easy two-color assay to determine viability of cells
TRAPEZIUM X Software	Shimadzu Corp	N.A.	Data processing software for Autograph AG-X