Méthode non invasive pour générer le modèle de lésion cartilagineuse intra-articulaire induite par la charge cyclique du genou du rat

Résumé

Ici, nous présentons le modèle de lésion cartilagineuse intra-articulaire induite par la charge cyclique du genou du rat, générée par 60 compressions cycliques sur 20 N, entraînant des dommages au cartilage condylien fémoral chez le rat.

Résumé

La physiopathologie de l’arthrose primaire (OA) reste incertaine. Cependant, une sous-classification spécifique de l’arthrose dans des groupes d’âge relativement plus jeunes est probablement corrélée à des antécédents de lésions du cartilage articulaire et d’avulsion ligamentaire. Les modèles chirurgicaux animaux de l’arthrose du genou jouent un rôle important dans la compréhension de l’apparition et de la progression de l’arthrose post-traumatique et aident au développement de nouvelles thérapies pour cette maladie. Cependant, des modèles non chirurgicaux ont récemment été envisagés pour éviter une inflammation traumatique qui pourrait affecter l’évaluation de l’intervention.

Dans cette étude, un modèle de lésion intra-articulaire du cartilage chez le rat induit par une charge compressive cyclique in vivo a été développé, ce qui a permis aux chercheurs (1) de déterminer l’ampleur, la vitesse et la durée optimales de la charge qui pourrait causer des lésions cartilagineuses focales; (2) évaluer les changements pathologiques spatio-temporels post-traumatiques de la vitalité des chondrocytes; et (3) évaluer l’expression histologique de molécules destructrices ou protectrices impliquées dans les mécanismes d’adaptation et de réparation contre les charges de compression articulaire. Ce rapport décrit le protocole expérimental pour cette nouvelle lésion cartilagineuse dans un modèle de rat.

Introduction

Traditionnellement, la transsection ou la déstabilisation du ménisque croisé antérieur (LCA) a été considérée comme optimale pour étudier l’arthrose post-traumatique (PTOA) chez les petits animaux. Ces dernières années, des modèles de compression cyclique non invasifs ont été utilisés pour étudier le PTOA. Ce modèle a été conçu à l’origine pour étudier la réponse osseuse spongieuse à la charge mécanique¹ et a ensuite été modifié en tant que modèle animal non chirurgical pour les études PTOA 2,3,4,5,6. La raison est de faire entrer en collision le cartilage articulaire en appliquant une force externe périodique, ce qui déclenche une série de réponses inflammatoires. Cependant, ce modèle n’a été appliqué qu’aux souris, et l’ampleur appropriée de la charge sur les animaux plus gros n’a pas été discutée.

Un autre problème avec le modèle précédent est que le protocole à volume élevé comprenait trop de cycles, ce qui provoquait un épaississement excessif de l’os sous-chondral, un effet secondaire indésirable, dans plusieurs échantillons⁷. Par conséquent, une nouvelle méthode de compression cyclique avec l’ampleur appropriée pour les gros animaux et un effet secondaire de charge plus faible a été mise au point⁸. L’objectif global du présent article est de décrire le protocole du modèle de compression cyclique non invasive chez le rat et d’observer les résultats représentatifs de la dégénérescence du cartilage. Le protocole actuel aiderait les lecteurs intéressés par l’application du modèle de compression cyclique non invasive sur les rats.

Protocole

Le protocole a été approuvé par le Comité de recherche animale de l’Université de Kyoto (numéro d’approbation: Med kyo 17616).

1. Effectuer une compression cyclique in vivo sur le genou du rat

1. Induire une anesthésie animale expérimentale
   1. Induire l’anesthésie chez un rat Wistar âgé de 12 semaines (256,8 ± 8,7 g) par inhalation d’une solution d’isoflurane à 5% dans la boîte d’anesthésie.
   2. Injecter par voie intrapéritonéale un mélange de trois agents anesthésiques⁹, y compris la médétomidine, le midazolam et le butorphanol, à 2 mg / kg du poids corporel du rat, et raser la zone autour de l’articulation du genou droit. Confirmer une anesthésie suffisante par l’absence de réflexe de pédale à un pincement de l’orteil.
2. Montez le rat anesthésié sur le dispositif de fixation.
   1. Placez le rat anesthésié couché sur le ventre sur la plaque de base (Figure 1), le genou droit étant attaché à un petit morceau de résine avec une rainure concave. Placez le membre postérieur droit dans les positions d’extension de la hanche, de flexion du genou et d’extension de la cheville, avec le genou fléchi à environ 140°. Accommodez le talon du rat sur la rainure en forme de coin sur le luminaire mobile.
   2. Déplacer le dispositif de fixation vers l’instrument d’essai de contrainte/traction (voir le tableau des matériaux). Après vous être assuré qu’il n’y a pas de contact avec le capteur de force, ouvrez le logiciel de contrôle de l’instrument d’essai de contrainte/traction (Table des matériaux) et cliquez sur le bouton Étalonnage . Après l’étalonnage, fixez soigneusement le haut du cadre au capteur de pesage. Pour maintenir l’articulation du genou étroitement attachée au cadre, allumez lentement le bouton rotatif du panneau de commande principal mobile jusqu’à ce que la précharge atteigne 5 N.
3. Construisez une méthode de chargement et configurez le test de compression.
   1. Dans le menu principal, cliquez sur Créer une nouvelle méthode | Étiquette du système . Définissez le mode de test sur Cycle et Type de test sur Compression. Cliquez sur l’étiquette du capteur et sélectionnez l’onglet Test pour vérifier que la limite est comprise entre 60 N. De plus, sélectionnez l’onglet Contour et vérifiez que la limite est inférieure à 500 mm.
      REMARQUE: L’étape ci-dessus arrêtera immédiatement l’opération s’il y a un déplacement important sur le point de contrainte.
   2. Sous l’étiquette de contrôle Test, sélectionnez Origine de la croissance pour démarrer le programme principal avec 0,3 %/pleine échelle. Sur les quatre sections d’un cycle de chargement, régler la vitesse de course en commande dans les 1 ère et 3ème^{sections à} 1^mm/s. Régler la force d’essai maximale dans la 2e section sur 20 N et la force d’essai minimale dans la 4e^{section sur} 5 N. Régler « la durée de maintien » sur 0,5 s pour la charge maximale et 10 s pour la charge minimale (figure 2).
      REMARQUE : Comme cette étape définit chaque cycle, assurez-vous que les surfaces des joints sont en contact les unes avec les autres et se déplacent à une vitesse raisonnable et que le mouvement est maintenu.
   3. Dans l’onglet Préchargement au bas de la page, assurez-vous que l’option On est cochée, que la vitesse de déviation est réglée sur 100 mm/min et que la force maximale est de 5 N. Dans l’étiquette Échantillon , définissez le matériau sur Métal.
      REMARQUE: Ces paramètres détaillés peuvent être spécifiques à chaque fabricant.
   4. Dans le menu principal, sous la section Sélectionner la méthode et le test, sélectionnez la méthode qui vient d’être générée, puis cliquez sur Démarrer pour commencer le test.
      NOTE: Le tableau en bas montre les mesures réelles de la charge de pointe et du déplacement.
   5. Définissez le nombre de cycles sur 60.
      REMARQUE: La session de chargement complète comprend 60 cycles, qui durent environ 12 min. Dans le groupe témoin, les rats ont subi une précharge de 5 N pendant 12 minutes de précharge dans les mêmes conditions.
4. Après le chargement, remettez le rat dans sa cage et surveillez jusqu’à la récupération complète. Maintenez un horaire de 12 à 12 heures dans l’obscurité claire dans la cage avec suffisamment d’espace et de nourriture ad libitum. Après les périodes expérimentales requises, sacrifier les rats avec un surdosage du mélange des trois agents anesthésiques injectés par voie intrapéritonéale ou inhalation de dioxyde de carbone pour analyse (1 h-8 semaines).

Résultats

Un résultat représentatif des changements à court terme (1 h et 12 h) de la viabilité des chondrocytes dans des échantillons soumis à une charge cyclique de 20 N a été obtenu. Comme le montre la figure 3, le nombre de chondrocytes morts (fluorescence rouge) a augmenté 12 h après le traumatisme. Inversement, le nombre de chondrocytes vivants (fluorescence verte) a continué de diminuer, certains échantillons ne contenant aucun chondrocytes vivants dans la zone touchée.

Discussion

Pour la première fois, le protocole actuel montre comment établir un modèle de lésion cartilagineuse induite par la charge sur le condyle fémoral latéral chez le rat, similaire au modèle de lésions intra-articulaires chez les rongeurs plus petits tels que la souris². Cependant, le protocole de charge chez la souris a provoqué une formation sévère d’ostéophytes et des lésions ligamentaires croisées, ce qui n’était pas idéal pour évaluer les effets de la compression cyclique. Le...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic Apparatus for Small Animals	SHINANO MFG CO.,LTD.	SN-487-0T
Autograph AG-X	Shimadzu Corp	N.A.	Precision Universal / Tensile Tester
Fluoview FV10i microscope	Olympus Corp	N.A.	A fully automated confocal laser-scanning microscope
ISOFLURANE Inhalation Solution	Pfizer Japan Inc.	(01)14987114133400
LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit	Thermo Fisher Scientific Japan Inc	L3224	A quick and easy two-color assay to determine viability of cells
TRAPEZIUM X Software	Shimadzu Corp	N.A.	Data processing software for Autograph AG-X