Eine nicht-invasive Methode zur Erzeugung des zyklischen Belastungsinduzierten intraartikulären Knorpelläsionsmodells des Rattenknies

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir das zyklisch belastungsinduzierte intraartikuläre Knorpelläsionsmodell des Rattenknies, das durch 60 zyklische Kompressionen über 20 N erzeugt wird, was bei Ratten zu einer Schädigung des femoralen Kondylenknorpels führt.

Zusammenfassung

Die Pathophysiologie der primären Arthrose (OA) bleibt unklar. Eine spezifische Subklassifizierung von OA in relativ jüngeren Altersgruppen korreliert jedoch wahrscheinlich mit einer Vorgeschichte von Gelenkknorpelschäden und Bänderavulsion. Chirurgische Tiermodelle von OA des Knies spielen eine wichtige Rolle beim Verständnis des Beginns und des Fortschreitens von posttraumatischer OA und helfen bei der Entwicklung neuartiger Therapien für diese Krankheit. In jüngster Zeit wurden jedoch nicht-chirurgische Modelle in Betracht gezogen, um traumatische Entzündungen zu vermeiden, die die Bewertung des Eingriffs beeinträchtigen könnten.

In dieser Studie wurde ein intraartikuläres Knorpelläsionsmodell entwickelt, das durch zyklische In-vivo-Druckbelastung induziert wurde, das es den Forschern ermöglichte, (1) die optimale Größe, Geschwindigkeit und Dauer der Belastung zu bestimmen, die fokale Knorpelschäden verursachen könnte; (2) Beurteilung posttraumatischer raumzeitpathologischer Veränderungen der Chondrozytenvitalität; und (3) die histologische Expression von destruktiven oder schützenden Molekülen zu bewerten, die an den Anpassungs- und Reparaturmechanismen gegen gemeinsame Druckbelastungen beteiligt sind. Dieser Bericht beschreibt das experimentelle Protokoll für diese neuartige Knorpelläsion in einem Rattenmodell.

Einleitung

Traditionell wurde die Durchtrennung des vorderen Kreuzbandes (ACL) oder die Destabilisierung des medialen Meniskus als optimal für die Untersuchung der posttraumatischen Osteoarthritis (PTOA) bei Kleintieren angesehen. In den letzten Jahren wurden nicht-invasive zyklische Kompressionsmodelle verwendet, um PTOA zu untersuchen. Dieses Modell wurde ursprünglich entwickelt, um die spongiöse Knochenreaktion auf mechanische Belastung¹ zu untersuchen und wurde dann als nicht-chirurgisches Tiermodell für die PTOA-Studien 2,3,4,5,6 modifiziert. Die Begründung besteht darin, den Gelenkknorpel durch Anwendung einer periodischen äußeren Kraft zu kollidieren, die eine Reihe von Entzündungsreaktionen auslöst. Dieses Modell wurde jedoch nur auf Mäuse angewendet, und das angemessene Ausmaß der Belastung größerer Tiere wurde nicht diskutiert.

Ein weiteres Problem des Vorgängermodells besteht darin, dass das Protokoll mit hohem Volumen zu viele Zyklen enthielt, was in mehreren Proben zu einer übermäßigen Verdickung des subchondralen Knochens führte, einer unerwünschten Nebenwirkung⁷. Daher wurde eine neuartige Methode der zyklischen Kompression mit der entsprechenden Größenordnung für große Tiere und einem geringeren Belastungsnebeneffekt entwickelt⁸. Das übergeordnete Ziel des vorliegenden Artikels ist es, das Protokoll des nicht-invasiven zyklischen Kompressionsmodells bei Ratten zu beschreiben und die repräsentativen Ergebnisse der Knorpeldegeneration zu beobachten. Das aktuelle Protokoll würde Lesern helfen, die an der Anwendung des nicht-invasiven zyklischen Kompressionsmodells bei Ratten interessiert sind.

Protokoll

Das Protokoll wurde vom Tierforschungskomitee der Universität Kyoto genehmigt (Zulassungsnummer: Med kyo 17616).

1. Führen Sie eine zyklische In-vivo-Kompression am Rattenknie durch.

1. Experimentelle Tieranästhesie induzieren
   1. Induktion einer Anästhesie bei einer 12 Wochen alten Wistar-Ratte (256,8 ± 8,7 g) durch Einatmen von 5% iger Isofluranlösung in der Anästhesiebox.
   2. Intraperitoneal injizieren Sie eine Mischung aus drei Anästhetika⁹, einschließlich Medetomidin, Midazolam und Butorphanol, bei 2 mg/kg des Körpergewichts der Ratte und rasieren Sie den Bereich um das rechte Kniegelenk. Bestätigen Sie eine ausreichende Betäubung durch fehlenden Pedalreflex zu einem Zehenklemmen.
2. Montieren Sie die betäubte Ratte auf der Fixiervorrichtung.
   1. Legen Sie die betäubte Ratte auf dem Bauch liegend auf die Grundplatte (Abbildung 1), wobei das rechte Knie an einem kleinen Stück Harz mit einer konkaven Rille befestigt ist. Platzieren Sie die rechte Hinterbeine in der Hüftstreckung, Kniebeugung und Knöchelstreckposition, wobei das Knie um ca. 140° gebeugt ist. Bringen Sie die Ferse der Ratte an der keilförmigen Nut der beweglichen Halterung unter.
   2. Bewegen Sie die Fixiervorrichtung zum Spannungs-/Zugprüfgerät (siehe Werkstofftabelle). Nachdem Sie sichergestellt haben, dass keine Kontakte mit der Wägezelle vorhanden sind, öffnen Sie die Steuerungssoftware für Spannungs-/Zugprüfgeräte (Materialtabelle) und klicken Sie auf die Schaltfläche Kalibrierung . Befestigen Sie nach der Kalibrierung die Oberseite des Rahmens vorsichtig an der Wägezelle. Um das Kniegelenk eng mit dem Rahmen zu verbinden, drehen Sie den Drehknopf am beweglichen Hauptbedienfeld langsam ein, bis die Vorspannung 5 N erreicht.
3. Erstellen Sie eine Lademethode und richten Sie den Drucktest ein.
   1. Klicken Sie im Hauptmenü auf Neue Methode erstellen | Systembezeichnung . Legen Sie Testmodus auf Zyklus und Testtyp auf Komprimierung fest. Klicken Sie auf das Sensoretikett und wählen Sie die Registerkarte Test , um zu überprüfen, ob der Grenzwert innerhalb von 60 N liegt. Wählen Sie außerdem die Registerkarte Strich und überprüfen Sie, ob die Grenze innerhalb von 500 mm liegt.
      HINWEIS: Der obige Schritt stoppt den Vorgang sofort, wenn es eine große Verschiebung am Spannungspunkt gibt.
   2. Wählen Sie unter der Bezeichnungsbezeichnung Teststeuerelement die Option Ursprung des Wachstums aus, um das Hauptprogramm mit 0,3 %/Skalenendwert zu starten. Stellen Sie von den vier Abschnitten in einem Ladezyklus die Hubgeschwindigkeit im 1. und 3^{. Abschnitt auf} 1 mm/s ein^. Stellen Sie die maximale Prüfkraft im 2. Abschnitt auf 20 N und die minimale Prüfkraft im 4^{. Abschnitt auf} 5 N ein^. Stellen Sie "die Haltedauer" auf 0,5 s für die Spitzenlast und 10 s für die Mindestlast ein (Abbildung 2).
      HINWEIS: Da dieser Schritt jeden Zyklus definiert, stellen Sie sicher, dass die Gelenkflächen miteinander in Kontakt stehen und sich mit einer angemessenen Geschwindigkeit bewegen und dass die Bewegung beibehalten wird.
   3. Stellen Sie auf der Registerkarte Vorspannung unten auf der Seite sicher, dass Ein aktiviert ist, die Geschwindigkeit der Umlenkungsentfernung auf 100 mm/min eingestellt ist und die maximale Kraft 5 N beträgt. Legen Sie in der Probenbeschriftung das Material auf Metall fest.
      HINWEIS: Diese detaillierten Einstellungen können für jeden Hersteller spezifisch sein.
   4. Wählen Sie im Hauptmenü im Abschnitt Methode und Test auswählen die soeben erstellte Methode aus und klicken Sie auf Start , um den Test zu starten.
      HINWEIS: Die Tabelle unten zeigt die tatsächlichen Messungen der Spitzenlast und -verschiebung.
   5. Stellen Sie die Anzahl der Zyklen auf 60 ein.
      HINWEIS: Die gesamte Ladesitzung umfasst 60 Zyklen, die ca. 12 Minuten dauern. In der Kontrollgruppe wurden die Ratten unter den gleichen Bedingungen einer 5-N-Vorladung für 12 Minuten Vorladung unterzogen.
4. Nach dem Laden die Ratte in ihren Käfig zurückbringen und bis zur vollständigen Genesung überwachen. Halten Sie einen 12-12 h Hell-Dunkel-Zeitplan im Käfig mit ausreichend Platz und Futter ad libitum ein. Nach den erforderlichen Versuchszeiten opfern Sie die Ratten mit einer Überdosis der Mischung der drei Anästhetika, die intraperitoneal injiziert wurden, oder Kohlendioxidinhalation zur Analyse (1 h-8 Wochen).

Ergebnisse

Ein repräsentatives Ergebnis der kurzfristigen Veränderungen (1 h und 12 h) der Chondrozytenlebensfähigkeit in Proben, die einer zyklischen Belastung von 20 N ausgesetzt waren, wurde erhalten. Wie in Abbildung 3 gezeigt, stieg die Anzahl der toten Chondrozyten (rote Fluoreszenz) 12 h nach dem Trauma an. Umgekehrt nahm die Anzahl lebender Chondrozyten (grüne Fluoreszenz) weiter ab, wobei einige Proben keine lebenden Chondrozyten im betroffenen Bereich enthielten.

Diskussion

Zum ersten Mal zeigt das aktuelle Protokoll, wie ein Modell der belastungsinduzierten Knorpelläsion auf dem lateralen Femurkondylen bei Ratten etabliert werden kann, ähnlich dem intraartikulären Schadensmodell bei kleineren Nagetieren wie der Maus². Das Belastungsprotokoll bei Mäusen verursachte jedoch eine schwere Osteophytenbildung und Kreuzbandläsionen, was für die Bewertung der Auswirkungen einer zyklischen Kompression nicht ideal war. Das aktuelle Protokoll erzeugte eine fokale Knorpell...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic Apparatus for Small Animals	SHINANO MFG CO.,LTD.	SN-487-0T
Autograph AG-X	Shimadzu Corp	N.A.	Precision Universal / Tensile Tester
Fluoview FV10i microscope	Olympus Corp	N.A.	A fully automated confocal laser-scanning microscope
ISOFLURANE Inhalation Solution	Pfizer Japan Inc.	(01)14987114133400
LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit	Thermo Fisher Scientific Japan Inc	L3224	A quick and easy two-color assay to determine viability of cells
TRAPEZIUM X Software	Shimadzu Corp	N.A.	Data processing software for Autograph AG-X