Um Método Não Invasivo para Gerar o Modelo de Lesão da Cartilagem Intra-Articular Induzida por Carga Cíclica do Joelho de Rato

Resumo

Aqui, apresentamos o modelo de lesão da cartilagem intra-articular induzida por carga cíclica do joelho de rato, gerado por 60 compressões cíclicas acima de 20 N, resultando em danos à cartilagem condilar femoral em ratos.

Resumo

A fisiopatologia da osteoartrite primária (OA) permanece obscura. No entanto, uma subclassificação específica da OA em grupos etários relativamente mais jovens provavelmente está correlacionada com uma história de dano da cartilagem articular e avulsão ligamentar. Modelos animais cirúrgicos de OA do joelho desempenham um papel importante na compreensão do início e progressão da OA pós-traumática e auxiliam no desenvolvimento de novas terapias para esta doença. No entanto, modelos não cirúrgicos têm sido recentemente considerados para evitar inflamações traumáticas que poderiam afetar a avaliação da intervenção.

Neste estudo, foi desenvolvido um modelo de lesão de cartilagem intra-articular induzido por carga compressiva cíclica in vivo , o que permitiu aos pesquisadores (1) determinar a magnitude, velocidade e duração ideais da carga que poderia causar danos focais à cartilagem; (2) avaliar alterações patológicas espaço-temporais pós-traumáticas na vitalidade dos condrócitos; e (3) avaliar a expressão histológica de moléculas destrutivas ou protetoras envolvidas nos mecanismos de adaptação e reparo contra cargas compressivas articulares. Este relato descreve o protocolo experimental para esta nova lesão cartilaginosa em um modelo de rato.

Introdução

Tradicionalmente, a transecção do ligamento cruzado anterior (LCA) ou a desestabilização do menisco medial tem sido considerada ideal para investigar a osteoartrite pós-traumática (POTP) em pequenos animais. Nos últimos anos, modelos de compressão cíclica não invasiva têm sido usados para estudar a POTP. Este modelo foi originalmente desenhado para investigar a resposta óssea esponjosa à carga mecânica¹ e, em seguida, foi modificado como um modelo animal não cirúrgico para estudos de OTP 2,3,4,5,6. A lógica é colidir a cartilagem articular aplicando uma força externa periódica, que desencadeia uma série de respostas inflamatórias. No entanto, este modelo só foi aplicado a camundongos, e a magnitude apropriada da carga em animais maiores não foi discutida.

Outro problema com o modelo anterior é que o protocolo de alto volume incluiu muitos ciclos, o que causou espessamento excessivo do osso subcondral, um efeito colateral indesejado, em várias amostras⁷. Portanto, um novo método de compressão cíclica com a magnitude apropriada para animais de grande porte e um efeito colateral de menor carga foi desenvolvido⁸. O objetivo geral do presente artigo é descrever o protocolo do modelo de compressão cíclica não invasiva em ratos e observar os resultados representativos da degeneração da cartilagem. O protocolo atual ajudaria os leitores interessados na aplicação do modelo de compressão cíclica não invasiva em ratos.

Protocolo

O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Pesquisa Animal da Universidade de Kyoto (número de aprovação: Med kyo 17616).

1. Realizar compressão cíclica in vivo no joelho do rato

1. Induzir anestesia experimental em animais
   1. Induzir anestesia em um rato Wistar de 12 semanas de idade (256,8 ± 8,7 g) por inalação de solução de isoflurano a 5% na caixa de anestesia.
   2. Injetar por via intraperitoneal uma mistura de três agentes anestésicos⁹, incluindo medetomidina, midazolam e butorfanol, a 2 mg/kg do peso corporal do rato, e raspar a área ao redor da articulação do joelho direito. Confirme anestesia suficiente por falta de reflexo do pedal para uma beliscão do dedo do pé.
2. Monte o rato anestesiado no dispositivo de fixação.
   1. Colocar o rato anestesiado deitado de barriga para baixo sobre a placa de base (Figura 1), com o joelho direito preso a um pequeno pedaço de resina com sulco côncavo. Coloque o membro posterior direito nas posições de extensão do quadril, flexão do joelho e extensão do tornozelo, com o joelho flexionado a aproximadamente 140°. Acomodem o calcanhar do rato no sulco em forma de cunha no acessório móvel.
   2. Mova o dispositivo de fixação para o instrumento de ensaio de tensão/tração (consulte o Quadro de Materiais). Depois de garantir que não há contatos com a célula de carga, abra o software de controle do instrumento de teste de tensão/tração (Tabela de Materiais) e clique no botão Calibração . Após a calibração, prenda a parte superior do quadro à célula de carga com cuidado. Para manter a articulação do joelho intimamente ligada ao quadro, ligue o botão rotativo no painel operacional principal móvel lentamente até que a pré-carga atinja 5 N.
3. Crie um método de carregamento e configure o teste de compressão.
   1. No menu Principal, clique em Criar um novo método | Rótulo do sistema . Defina Modo de teste como Ciclo e Tipo de teste como Compactação. Clique na etiqueta Sensor e selecione a guia Teste para verificar se o limite está dentro de 60 N. Além disso, selecione a guia Traçado e verifique se o limite está dentro de 500 mm.
      NOTA: A etapa acima interromperá a operação imediatamente se houver um grande deslocamento no ponto de tensão.
   2. No rótulo Controle de teste, selecione Origem do crescimento para iniciar o programa principal com 0,3%/escala completa. Das quatro seções em um ciclo de carregamento, defina a velocidade de curso no controle na 1ª e^3ª seções para 1 mm / s. Defina a Força máxima de teste na 2ª seção como 20 N e a Força mínima de teste na^4ª seção como 5 N. Defina "a Duração da suspensão" como 0,5 s para a carga de pico e 10 s para a carga mínima (Figura 2).
      NOTA: Como esta etapa define cada ciclo, certifique-se de que as superfícies articulares estão em contato umas com as outras e estão se movendo a uma velocidade razoável e que o movimento é mantido.
   3. Na guia Pré-carregamento na parte inferior da página, verifique se Ativado está marcado, a Velocidade de remoção de deflexão está definida como 100 mm/min e a força máxima é de 5 N. No rótulo Espécime , defina o Material como Metal.
      Observação : essas configurações detalhadas podem ser específicas para cada fabricante.
   4. No menu Principal, na seção Selecionar método e teste, selecione o método que acabou de ser criado e clique em Iniciar para iniciar o teste.
      NOTA: A tabela na parte inferior mostra as medidas reais da carga de pico e do deslocamento.
   5. Defina o número de ciclos como 60.
      NOTA: Toda a sessão de carregamento inclui 60 ciclos, que dura aproximadamente 12 minutos. No grupo controle, os ratos foram submetidos a pré-carga de 5 N por 12 min de pré-carga nas mesmas condições.
4. Após o carregamento, devolva o rato à sua gaiola e monitore até a recuperação completa. Mantenha um horário claro-escuro de 12-12 h na gaiola com espaço suficiente e comida ad libitum. Após os períodos experimentais necessários, sacrificar os ratos com uma overdose da mistura dos três agentes anestésicos injetados por via intraperitoneal ou inalação de dióxido de carbono para análise (1 h-8 semanas).

Resultados

Obteve-se um resultado representativo das mudanças de curto prazo (1 h e 12 h) na viabilidade do condrócitos em amostras submetidas à carga cíclica de 20 N. Como mostra a Figura 3, o número de condrócitos mortos (fluorescência vermelha) aumentou às 12 h pós-trauma. Por outro lado, o número de condrócitos vivos (fluorescência verde) continuou a diminuir, com algumas amostras não contendo condrócitos vivos na área afetada.

A histologia mostrou que a c...

Discussão

Pela primeira vez, o presente protocolo mostra como estabelecer um modelo de lesão cartilaginosa induzida por carga no côndilo femoral lateral em ratos, semelhante ao modelo de dano intra-articular em roedores menores, como o camundongo². No entanto, o protocolo de carga em camundongos causou grave formação de osteófitos e lesões do ligamento cruzado, o que não foi ideal para avaliar os efeitos da compressão cíclica. O protocolo atual criou uma lesão focal da cartilagem em ratos com uma ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic Apparatus for Small Animals	SHINANO MFG CO.,LTD.	SN-487-0T
Autograph AG-X	Shimadzu Corp	N.A.	Precision Universal / Tensile Tester
Fluoview FV10i microscope	Olympus Corp	N.A.	A fully automated confocal laser-scanning microscope
ISOFLURANE Inhalation Solution	Pfizer Japan Inc.	(01)14987114133400
LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit	Thermo Fisher Scientific Japan Inc	L3224	A quick and easy two-color assay to determine viability of cells
TRAPEZIUM X Software	Shimadzu Corp	N.A.	Data processing software for Autograph AG-X