JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة تصوير مضان تستخدم فئة من الفلوروفورات الدهنية الحساسة لدرجة الحموضة لمراقبة الاتجار بالغشاء الدهني أثناء الإخراج الخلوي للخلايا ودورة التداخل الخلوي.

Abstract

Exo- / endocytosis هي عملية شائعة تتوسط في تبادل الجزيئات الحيوية بين الخلايا وبيئتها وبين الخلايا المختلفة. تستخدم الخلايا المتخصصة هذه العملية لتنفيذ وظائف الجسم الحيوية مثل إفراز الأنسولين من الخلايا β وإطلاق الناقل العصبي من المشابك الكيميائية. نظرا لأهميته الفسيولوجية ، كان exo-/ endocytosis أحد أكثر الموضوعات التي تمت دراستها في بيولوجيا الخلية. تم تطوير العديد من الأدوات لدراسة هذه العملية على مستوى الجينات والبروتين ، والتي بسببها يعرف الكثير عن آلية البروتين المشاركة في هذه العملية. ومع ذلك ، فقد تم تطوير عدد قليل جدا من الطرق لقياس معدل دوران الدهون الغشائية ، وهو الأساس المادي للخارج / البطانة الخلوية.

تقدم هذه الورقة فئة من نظائر الدهون الفلورية الجديدة التي تظهر مضان يعتمد على الأس الهيدروجيني وتوضح استخدامها لتتبع إعادة تدوير الدهون بين غشاء البلازما والحويصلات الإفرازية. بمساعدة التلاعب البسيط بالأس الهيدروجيني ، تسمح هذه النظائر أيضا بالقياس الكمي لتوزيع الدهون عبر السطح ومقصورات الغشاء داخل الخلايا ، بالإضافة إلى قياس معدل دوران الدهون أثناء التداخل الخلوي الخارجي. سيكون هؤلاء المراسلون الجدد للدهون موضع اهتمام كبير لمختلف مجالات البحث البيولوجي مثل بيولوجيا الخلية وعلم الأعصاب.

Introduction

الطبقة الثنائية الدهنية هي واحدة من أكثر مجموعات الجزيئات الحيوية شيوعا ولا غنى عنها لجميع الخلايا. الخلايا الخارجية ، فإنه يشكل الخلايا التي تربط غشاء البلازما وبيئتها. داخل الخلايا ، فإنه يقسم عضيات مختلفة متخصصة في وظائف معينة. بدلا من أن تكون الأغشية الدهنية ديناميكية أكثر من كونها ثابتة ، فإنها تشهد باستمرار الاندماج والانشطار ، مما يتوسط في نقل المواد الحيوية ، وإصلاح العضيات ، وتغيير التشكل ، والاتصال الخلوي. مما لا شك فيه أن الغشاء الدهني هو الأساس المادي لجميع العمليات الخلوية تقريبا ، ويلعب اختلاله الوظيفي دورا حاسما في اضطرابات مختلفة تتراوح من السرطان1 إلى مرض الزهايمر2. على الرغم من أن جزيئات الدهون أقل تنوعا بكثير من البروتينات ، إلا أن أبحاث الأغشية حتى الآن كانت تتمحور بشكل أساسي حول البروتين. على سبيل المثال ، يعرف الكثير عن آلات البروتين أكثر من الدهون في الإخراج الخلوي3،4،5. علاوة على ذلك ، فإن تنظيم وتوزيع وديناميكيات وتوازن الدهون عبر الأغشية السطحية وداخل الخلايا لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير مقارنة بالبروتينات الغشائية6.

هذا ليس مفاجئا لأن تقنيات البيولوجيا الجزيئية الحديثة ، مثل الطفرات ، توفر ميزة منهجية لدراسة البروتينات بدلا من الدهون. على سبيل المثال ، يسهل وضع العلامات المعدلة وراثيا للبروتين الفلوري الأخضر الحساس للأس الهيدروجيني (المعروف أيضا باسم pHluorin) إلى البروتينات الحويصلية القياس الكمي لكمية ومعدل دوران البروتين الحويصلي أثناء الإخراج الخلوي / التداخلالخلوي 7،8،9. ومع ذلك ، يكاد يكون من المستحيل تعديل الدهون الغشائية وراثيا في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، فإن التلاعب النوعي وحتى الكمي بكميات البروتين وتوزيعاته أكثر جدوى من تلك الموجودة في الدهون10. ومع ذلك ، تم عزل الدهون الفلورية الأصلية والاصطناعية وتطويرها لمحاكاة الدهون الغشائية الداخلية في المختبر وفي الجسم الحي11. مجموعة واحدة من الدهون الفلورية المستخدمة على نطاق واسع هي أصباغ الستيريل ، على سبيل المثال ، FM1-43 ، والتي تظهر مضان معزز بالغشاء وهي أداة قوية في دراسة إطلاق الحويصلة المشبكية (SV) في الخلايا العصبية12. في الآونة الأخيرة ، تم اختراع أصباغ دهنية حساسة للبيئة واستخدامها على نطاق واسع كفئة جديدة من المراسلين لدراسة خصائص غشاء الخلية المختلفة ، بما في ذلك إمكانات الغشاء11 ، وترتيب الطور13 ، والإفراز14.

تم تطوير فئة جديدة من محاكيات الدهون التي يكون مضانها حساسا لدرجة الحموضة (على سبيل المثال ، pHluorin) وحساسا للغشاء (على سبيل المثال ، FM1-43) لقياس توزيع الدهون مباشرة في غشاء البلازما والإندوسومات / الليزوزومات وحركة الدهون أثناء الإخراج الخلوي / البطانة الداخلية. تم اختيار فلوروفورات solvatochromic المعروفة التي تظهر خصائص الدفع والسحب بسبب نقل الشحنة داخل الجزيئات لهذا الغرض. من بين الفلوروفورات الحلفاتوكرومية الموجودة ، فإن سقالة 1،8-naphthalimide (ND) سهلة التعديل نسبيا ، ومتعددة الاستخدامات لوضع العلامات ، وهي فريدة من نوعها في الفيزياء الضوئية15 ، وبالتالي تم استخدامها في مقحمات الحمض النووي ، والثنائيات العضوية الباعثة للضوء ، وأجهزة استشعار الجزيئات الحيوية16،17،18.

يؤدي ربط مجموعة مانحة للإلكترون بموضع C4 لسقالة ND إلى توليد هيكل دفع وسحب ، مما يؤدي إلى زيادة عزم ثنائي القطب عن طريق إعادة توزيع كثافة الإلكترون في الحالة المثارة19,20. ينتج عن نقل الشحنة داخل الجزيئات عوائد كمية كبيرة وتحولات ستوكس ، مما يؤدي إلى مضان ساطع ومستقر21. طورت هذه المجموعة مؤخرا سلسلة من نظائر الدهون المذابة على أساس سقالة ND وحصلت عليها بإنتاجية اصطناعية جيدة20.

يظهر التوصيف الطيفي أنه من بين هذه المنتجات ، يمتلك ND6 أفضل خصائص مضان (الشكل 1)20. أولا ، لديها قمم إثارة وانبعاث منفصلة جيدا (أي ~ 400 نانومتر و ~ 520 نانومتر ، على التوالي ، في الشكل 2A ، B) مقارنة بالفلوروفورات الشائعة مثل الفلوريسئين أيزوثيوسيانات أو رودامين أو GFP ، مما يجعلها قابلة للفصل الطيفي عنها وبالتالي فهي مفيدة للتصوير متعدد الألوان. ثانيا ، يظهر مضان ND6 زيادة بأكثر من ثمانية أضعاف في مضانه في وجود المذيلات (الشكل 2C) ، مما يشير إلى اعتماد قوي على الغشاء. أظهرت دراسات التصوير الفلوري السابقة للخلايا الحية مع أنواع مختلفة من الخلايا تلطيخا غشائيا ممتازا بواسطة ND620. ثالثا ، عندما ينخفض الرقم الهيدروجيني للمحلول من 7.5 (يوجد عادة في البيئات خارج الخلية أو الخلوية) إلى 5.5 (يوجد عادة في الإندوسومات والليزوزومات) ، يظهر ND6 زيادة بمقدار الضعف تقريبا في التألق (الشكل 2 د) ، مما يدل على حساسية الأس الهيدروجيني. علاوة على ذلك ، تشير محاكاة الديناميات الجزيئية إلى أن ND6 يندمج بسهولة في طبقة الدهون المزدوجة مع سقالة ND التي تواجه خارج الغشاء وبقايا البيبيرازين التي تظهر تفاعلات قوية مع مجموعات رأس الفوسفوليبيد (الشكل 3). إجمالا ، تجعل هذه الميزات ND6 نظيرا مثاليا للدهون الفلورية لتصور وقياس معدل دوران الدهون الغشائية أثناء الإخراج الخلوي / التداخل الخلوي.

يقدم هذا البحث طريقة لدراسة معدل دوران وديناميكيات الدهون SV باستخدام الخلايا العصبية الحصين للفأر المستزرعة. من خلال تحفيز الخلايا العصبية باستخدام محاليل K + Tyrode العالية ، تم تحميل SVs وغشاء البلازما ب ND6 (الشكل 4A ، B). بعد ذلك ، تم إعادة تحفيز الخلايا العصبية بمحفزات مختلفة تليها محاليل التيرود المحتوية على NH4Cl و pH 5.5 (الشكل 4D). يسهل هذا البروتوكول القياس الكمي لمعدلات الإخراج الخلوي والخلوي المجمعة في ظل ظروف مختلفة (الشكل 4C).

Protocol

يتضمن البروتوكول التالي (1) إجراء مبسطا لإنشاء حصن فأر وثقافات قشرية بناء على بروتوكول راسخ22 ، (2) مقدمة موجزة لإعداد مجهر التألق للخلايا العصبية الحية ، (3) وصف مفصل لتحميل وتصوير ND6 في الخلايا العصبية للفأر ، (4) مناقشة حول القياس الكمي لتهريب الغشاء بواسطة إشارة ND6. تتبع جميع الإجراءات إرشادات السلامة الأحيائية و IACUC في جامعة فلوريدا أتلانتيك. تم وصف توليف ND6 سابقا20.

1. إعداد الحصين الفأر والثقافات القشرية

ملاحظة: إذا لم يتم تحديد خلاف ذلك ، يجب تنفيذ جميع الخطوات في غطاء التدفق الصفحي من المستوى 2 للسلامة البيولوجية. تعقيم جميع الأدوات والمواد.

  1. استخدم حجم 5 ملقط لوضع أغطية زجاجية في ألواح استزراع متعددة الآبار.
    ملاحظة: على سبيل المثال ، تعتبر اللوحة ذات 24 بئرا مثالية لأغطية الغطاء مقاس 12 مم figure-protocol-855 .
  2. أضف الحجم المناسب من المصفوفات خارج الخلية لتغطية سطح زراعة الخلية (على سبيل المثال ، 75 ميكرولتر من محلول مصفوفة الغشاء القاعدي لكل غطاء 12 مم figure-protocol-1080 ؛ انظر جدول المواد)
  3. ضع الألواح المحضرة في حاضنة زراعة الأنسجة (5٪ CO2 ، رطوبة 100٪ ، و 37 درجة مئوية) لمدة 1-4 ساعات للسماح بتشابك مصفوفة الغشاء القاعدي.
  4. التضحية بالحيوانات ، وفتح الجمجمة ، ونقل الدماغ كله إلى طبق بتري 35 مم مع 3 مل من محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) الذي يحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني (H + 20). قطع الدماغ على طول خط الوسط ، وفصل القشرة والحصين في غطاء تشريح التدفق الصفحي لتقليل التلوث.
  5. استخدم المقص الدقيق لتقطيع الأنسجة إلى قطع صغيرة (~ 1 مم3). انقل هذه الأنسجة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من H + 20.
  6. اغسل المناديل ثلاث مرات باستخدام 5 مل من H + 20 وثلاث مرات باستخدام 5 مل من HBSS.
  7. يضاف 1.5 مل من 1٪ تربسين مع حمض رباعي الخليك إيثيلين ديامين ويحتضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لهضم الإنزيم.
  8. كرر الخطوة 1.6 واستخدم الفراغ لاستنشاق HBSS في النهاية.
  9. فصل الأنسجة ميكانيكيا في 1 مل من HBSS يحتوي على 2.95 جم / لتر MgSO4 • 7H2O باستخدام ماصة زجاجية مصقولة بالنار.
  10. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 400 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  11. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في حجم مناسب من وسائط الاستزراع للحصول على تركيز ~ 10,000,000 خلية / مل.
  12. قم بطلاء الخلايا عند ~ 1,000,000 خلية / سم2 وضع الثقافة في الحاضنة (5٪ CO2 ، رطوبة 100٪ ، و 37 درجة مئوية) لمدة 1-4 ساعات لتسهيل ارتباط الخلية بأغطية الزجاج.
  13. أضف حجما مناسبا من وسط الاستزراع (على سبيل المثال ، 1 مل لكل بئر للوحة 24 بئر). أضف نفس الحجم من وسط الثقافة بعد 1 أسبوع. بعد 2 أسابيع ، استبدل نصف الوسط الثقافي الحالي بوسائط جديدة كل أسبوع.

2. إعداد المجهر لتصوير مضان الخلايا الحية

ملاحظة: يتضمن إعداد التصوير المثالي (الشكل 5) مجهرا مضانا مقلوبا على الأقل (انظر جدول المواد) ، ومصدر ضوء مضان مع مصراع تلقائي ، ومجموعات مرشحات مضان (على سبيل المثال ، للتصوير ND6 ، استخدم 405/10 BP للإثارة ، و 495 LP لثنائي اللون ، و 510/20 BP للانبعاثات) ، وكاميرا عالية الحساسية (جدول المواد) ، وكلها يتم التحكم فيها بواسطة برنامج الحصول على الصور (جدول المواد).

  1. قم بإعداد غرفة تصوير تسمح بالتحكم في درجة الحرارة وإدخال / إخراج المحلول للتصوير الفلوري للخلايا الحية.
    ملاحظة: على سبيل المثال ، تم استخدام غرفة تصوير معدلة في الحمام المفتوح مثبتة على منصة تدفئة في هذا البروتوكول (الشكل 6).
  2. قم بإعداد جهاز قابل للبرمجة لتبديل حلول التروية وتوصيل التحفيز الكهربائي في نقاط زمنية محددة أثناء التصوير.
    ملاحظة: تعد مزامنة الأجهزة والبرامج ضرورية للتحليلات الكمية (الشكل 7). على سبيل المثال ، في هذا البروتوكول ، تم استخدام إخراج الزناد من كاميرا التصوير لبدء برنامج كمبيوتر يتحكم في جهاز تبديل تلقائي ، والذي يتحكم في نظام نضح متعدد القنوات ومحفز نبض مربع.
  3. للمشاركة في تصوير اثنين أو أكثر من مراسلي الفلورسنت ، قم بإجراء تصوير مضان متعدد القنوات إما عن طريق تبديل مجموعات المرشحات بالتتابع أو عن طريق تقسيم انبعاثات مضان مختلفة في نفس الوقت والعرض على نفس الكاميرا.

3. تحميل وتصوير ND6 في الثقافات العصبية

  1. وزن كمية مناسبة من ND6 ، قم بحلها في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، واتركها تذوب في درجة حرارة الغرفة ؛ سونيكات لفترة وجيزة (على سبيل المثال ، 3 دقائق). قم بتصفية محلول المخزون الخام باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر لإزالة مجاميع الأصباغ الكبيرة. بعد الترشيح ، حدد تركيز الصبغة بواسطة التحليل الطيفي للامتصاص عند 405 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي التقليدي أو microvolume باستخدام ε = 10700 M-1 cm-1.
  2. قبل التطبيق ، قم بتخفيف محلول المخزون إلى تركيز 1 ميكرومتر باستخدام محلول الحمام. حافظ على محلول المخزون في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  3. وضع العلامات على الإندوسومات والحويصلات المشبكية
    1. لتسمية مقصورات الغشاء الداخلي في كل مكان مثل الإندوسومات ، أضف محلول مخزون ND6 (على سبيل المثال ، 1 mM في DMSO) إلى وسط الاستزراع عند التركيز النهائي 1 μM ، واحتضان عند 5٪ CO2 ، رطوبة 100٪ ، و 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لتقليل مدى وضع العلامات على SV ، قم بقمع النشاط العصبي التلقائي دوائيا. على سبيل المثال ، استخدم tetrodotoxin لمنع جهود الفعل أو 2،3-dioxo-6-nitro-1،2،3،4-رباعي هيدروبنزو [f] كينوكسالين -7-سلفوناميد (NBQX) و D- (-) -2-أمينو-5-حمض فوسفونوبنتانويك (D-AP5) لتثبيط انتقال الإثارة23.
    2. لتسمية SVs بشكل انتقائي ، استخدم تحفيزا قصيرا ولكن قويا لاستحضار exo- / endocytosis قبل المشبكي. أولا ، انقل غطاء (سلات) الاستزراع إلى طبق بتري 35 مم figure-protocol-5650 يحتوي على 2 مل من محلول Tyrode العادي في درجة حرارة الغرفة. ثانيا ، قم بتخفيف محلول مخزون ND6 في محلول Tyrode عالي K + (90 mM KCl) عند التركيز النهائي البالغ 1 ميكرومتر. ثالثا ، استبدل محلول Tyrode العادي في طبق Petri بمحلول Tyrode عالي K + يحتوي على ND6 واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
  4. انقل ثقافة الخلايا التي تحمل علامة ND6 إلى غرفة التصوير المليئة بمحلول Tyrode العادي المسخن مسبقا الذي يحتوي على 10 μM NBQX و 10 μM D-AP5.
  5. اضبط سرعة التروية على ~ 0.2 مل / ثانية (أي 1 قطرة في الثانية) وابدأ نضح محلول Tyrode العادي المسخن مسبقا الذي يحتوي على NBQX و D-AP5 لإزالة ND6 الزائد في الثقافة.
  6. اضبط التركيز وحدد مجال الرؤية المناسب الذي يحتوي على خلايا عصبية صحية ومنتشرة جيدا تحمل خلايا عصبية متصلة. تجنب المناطق التي تحتوي على غرويات صبغية لم يتم حلها.
  7. جرب تصوير الخلايا المحملة ب ND6 بأوقات تعرض مختلفة لتحديد أفضل إعدادات التصوير.
    ملاحظة: للحصول على أفضل وقت للتعريض ، تكون أعلى كثافة مضان بكسل في الصورة الناتجة حوالي نصف نطاق البت (على سبيل المثال ، بالنسبة لصورة 16 بت ، يكون نطاق البت من 0 إلى 65535) ، مما سيسمح بزيادة أخرى في التألق عند تطبيق محلول الحمام الحمضي. يجب استخدام وقت التعرض المحدد لجميع صور ND6.
  8. قم بإعداد بروتوكول التحفيز والتروية والفاصل الزمني للإطار والمدة الإجمالية. على سبيل المثال ، في البروتوكول التالي ، استخدم خط أساس 30 ثانية ، وتحفيز المجال الكهربائي 10 ثوان 30 هرتز ، واسترداد 50 ثانية ، و 120 ثانية 90 مللي متر K + ، واسترداد 60 ثانية ، ومحلول تيرود 60 ثانية مع 50 مللي متر NH4Cl ، ومحلول Tyrode 60 s عند الرقم الهيدروجيني 5.5 ، وفاصل إطار 3 ثوان.
  9. ابدأ في الحصول على الصورة مصحوبا بالتحفيز والتروية المتزامنين. مراقبة المحاكاة وتبادل الحلول أثناء التصوير.
  10. أوقف التروية بعد انتهاء التصوير ، وقم بإزالة غطاء الغطاء ، ونظف حجرة التصوير للتجربة التالية.

4. القياس الكمي للاتجار بالأغشية عن طريق تغيير مضان ND6

  1. قم بعمل نسخة احتياطية و / أو قم بعمل نسخة إلكترونية من جميع ملفات الصور.
  2. اختر برنامج تحليل لاستخراج البيانات ، على سبيل المثال ، برنامج تحليل صور مفتوح المصدر مثل ImageJ24 و / أو FIJI25.
  3. افتح أو قم باستيراد مكدس صور إلى برنامج التحليل.
  4. قم بتعيين الصورة الأولى كمرجع وقم بمحاذاة الباقي إليها باستخدام وظائف / مكونات إضافية مثل Rigid Registration26 ، والتي ستخفف من القطع الأثرية بسبب الانجراف xy. راجع الشكل 8 على سبيل المثال الصور.
  5. متوسط جميع الصور التي تم الحصول عليها خلال 30-s قبل خط الأساس لإنتاج صورة مرجعية. احفظ نسخة من هذه الصورة للرجوع إليها في المستقبل.
  6. اضبط حد الكثافة لتوليد صورة ثنائية من الصورة ذات المتوسط الأساسي.
  7. استخدم مستجمعات المياه في ImageJ أو وظائف مماثلة في برنامج آخر لفصل الخلايا العصبية أو الخلايا المتصلة.
  8. استخدم وظيفة تحليل الجسيمات مع حجم المنطقة المناسب والدائرية لالتماس مناطق الاهتمام (ROIs) المقابلة لأغشية الخلايا أو الإندوسومات أو الجسيمات الحالة أو العروة المشبكية. احفظ جميع عائد الاستثمار المحدد.
  9. حدد أربعة عائد استثمار في الخلفية في المناطق الخالية من الخلايا داخل مجال الرؤية.
  10. قم بقياس متوسط كثافة البكسل لكل عائد استثمار في كل إطار من مكدس الصور ، وقم بتصدير النتائج للتحليل الإحصائي.
  11. احسب متوسط كثافة عائد الاستثمار في الخلفية كضوضاء خط الأساس ، والتي سيتم طرحها من متوسط كثافة البكسل لكل عائد استثمار.
  12. متوسط أعلى ثلاثة متوسط شدة لكل عائد استثمار محدد أثناء تطبيق محلول الأس الهيدروجيني 5.5 Tyrode للحصول على أقصى شدة مضان ، والتي يتم تعريفها على أنها 100٪ للتطبيع.
  13. متوسط أقل ثلاثة متوسط شدة لكل عائد استثمار محدد أثناء تطبيق 50 mM NH4Cl لتعيين الحد الأدنى من شدة التألق ، والذي يتم تعريفه على أنه 0٪ للتطبيع.
  14. احسب التغيرات النسبية في التألق لكل عائد استثمار بناء على شدته البالغة 0٪ و 100٪. اشتقاق متوسط التغييرات الفلورية ، وتغيير الحركية ، والقيم / المخططات الأخرى من بيانات عائد الاستثمار الفردية.

النتائج

SVs متخصصة في إطلاق الناقل العصبي عبر exo- / endocytosis27. تحتوي SVs على تجويف شديد الحموضة (أي درجة الحموضة 5.5) ، وهو مثالي ل ND6. استخدمنا تحفيز K + العالي لاستحضار SV exo- / endocytosis من أجل السماح ل ND6 بالوصول إلى SV. من المتوقع ، ظهرت نقطة الفلورسنت الخضراء الزاهية على طول العمليات العصبية بع...

Discussion

منذ فترة طويلة تستخدم الأصباغ القائمة على الدهون ، مثل 1،1′-dioctadecyl-3،3،3′،3′-tetramethylindocarbocyanine (DiI) و 3،3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) ، لتوضيح مورفولوجيا الخلية وتتبع العمليات الخلوية مثل الإسقاطات المحورية للخلايا العصبية. تم اختراع أصباغ الستيريل ، مثل FM1-43 ، واستخدامها بنجاح لدراسة الإخراج

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل منحة مكتب جامعة فلوريدا أتلانتيك للأبحاث والاستفسار الجامعي (M.J.S.) ، ومنحة وزارة الصحة في فلوريدا Ed and Ethel Moore Pilot Grant 20A17 (QZ) ، ومنحة جمعية الزهايمر AARG-NTF-19-618710 (QZ) ، ومنحة NIA R21 AG061656-01A1 (Q.Z.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Digidata 1440A Data Acquistion SystemMolecular DevicesDigidata 1440AFor synchronized stimulation and solution exchange
Dual Channel Temperature ControllerWarner InstrumentsTC-344BFor live-cell imaging
Fetal Bovine SerumOMEGA ScientificFB-01For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Hamamatsu Flash4.0 sCOMS cameraHamamatsu Inc.C13440-20CUhigh-sensitivity camera
Hank's Balanced Salt SolutionSigmaH6648For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Heated PlatformWarner InstrumentsPH-1For live-cell imaging
MatrigelBD Biosciences354234For tissue culture
Micro-G Vibration Isolation TableTMC63-564For live-cell imaging
Micro-managerhttps://micro-manager.org/NAFor image acquisition control
Multi-Line In-Line Solution HeaterWarner InstrumentsSHM-6For live-cell imaging
Neurobasal Plus MediumTHermoFisher ScientificA3582901For tissue culture
Nikon Ti-E Inverted MicroscopeNikonTi-E/BFor live-cell imaging
ORCA-Flash4.0 Digital CMOS cameraHamamatsuC1340-20CUFor live-cell imaging
Perfusion ChamberWarner InstrumentsRC-26GFor live-cell imaging
Six-Channel Valve Control Perfusion SystemWarner InstrumentsVC-6For solution exchange
Square Pulse StimulatorGrass InstrumentSD9For electric field stimulation

References

  1. Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P. Endocytosis and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 16 (2), 156-161 (2004).
  2. Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection. Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010).
  3. Augustine, G. J., Burns, M. E., DeBello, W. M., Pettit, D. L., Schweizer, F. E. Exocytosis: proteins and perturbations. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 659-701 (1996).
  4. Ammar, M. R., Kassas, N., Chasserot-Golaz, S., Bader, M. F., Vitale, N. Lipids in regulated exocytosis: what are they doing. Frontiers in Endocrinology. 4, 125 (2013).
  5. Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112 (4), 519-533 (2003).
  6. Chabanon, M., Stachowiak, J. C., Rangamani, P. Systems biology of cellular membranes: a convergence with biophysics. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 9 (5), 1386 (2017).
  7. Prosser, D. C., Wrasman, K., Woodard, T. K., O'Donnell, A. F., Wendland, B. Applications of pHluorin for quantitative, kinetic and high-throughput analysis of endocytosis in budding yeast. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54587 (2016).
  8. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nature Protocols. 1 (6), 2970-2978 (2006).
  9. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  10. Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  11. Demchenko, A. P., Mély, Y., Duportail, G., Klymchenko, A. S. Monitoring biophysical properties of lipid membranes by environment-sensitive fluorescent probes. Biophysical Journal. 96 (9), 3461-3470 (2009).
  12. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).
  13. Gaus, K., Zech, T., Harder, T. Visualizing membrane microdomains by Laurdan 2-photon microscopy. Molecular Membrane Biology. 23 (1), 41-48 (2006).
  14. Kahms, M., Klingauf, J. Novel pH-sensitive lipid based exo-endocytosis tracers reveal fast intermixing of synaptic vesicle pools. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 18 (2018).
  15. Zhou, L., Xie, L., Liu, C., Xiao, Y. New trends of molecular probes based on the fluorophore 4-amino-1,8-naphthalimide. Chinese Chemical Letters. 30 (10), 1799-1808 (2019).
  16. Tomczyk, M. D., Walczak, K. Z. l,8-Naphthalimide based DNA intercalators and anticancer agents. A systematic review from 2007 to 2017. European Journal of Medicinal Chemistry. 159, 393-422 (2018).
  17. Ulla, H., et al. Blue emitting 1,8-naphthalimides with electron transport properties for organic light emitting diode applications. Journal of Molecular Structure. 1143 (5), 344-354 (2017).
  18. Duke, R. M., Veale, E. B., Pfeffer, F. M., Kruger, P. E., Gunnlaugsson, T. Colorimetric and fluorescent anion sensors: An overview of recent developments in the use of 1,8-naphthalimide-based chemosensors. Chemical Society Reviews. 39 (10), 3936-3953 (2010).
  19. Panja, S. K., Dwivedi, N., Saha, S. Tuning the intramolecular charge transfer (ICT) process in push-pull systems: Effect of nitro groups. RSC Advances. 6 (107), 105786-105794 (2016).
  20. Thomas, D., et al. Solvatochromic and pH-sensitive fluorescent membrane probes for imaging of live cells. ACS Chemical Neuroscience. 12 (4), 719-734 (2021).
  21. Leslie, K. G., Jacquemin, D., New, E. J., Jolliffe, K. A. Expanding the breadth of 4-amino-1,8-naphthalimide photophysical properties through substitution of the naphthalimide core. Chemistry - A European Journal. 24 (21), 5569-5573 (2018).
  22. Liu, G. S., Tsien, R. W. Properties of synaptic transmission at single hippocampal synaptic boutons. Nature. 375 (6530), 404-408 (1995).
  23. Zhang, Q., Cao, Y. -. Q., Tsien, R. W. Quantum dots provide an optical signal specific to full collapse fusion of synaptic vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 104 (45), 17843-17848 (2007).
  24. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  27. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annual Review of Neuroscience. 27, 509-547 (2004).
  28. Lazarenko, R. M., DelBove, C. E., Strothman, C. E., Zhang, Q. Ammonium chloride alters neuronal excitability and synaptic vesicle release. Scientific Reports. 7 (1), 5061 (2017).
  29. Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344 (6187), 1023-1028 (2014).
  30. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (1), 57-69 (2005).
  31. DelBove, C. E., et al. Reciprocal modulation between amyloid precursor protein and synaptic membrane cholesterol revealed by live cell imaging. Neurobiology of Disease. 127, 449-461 (2019).
  32. Dason, J. S., Smith, A. J., Marin, L., Charlton, M. P. Vesicular sterols are essential for synaptic vesicle cycling. Journal of Neuroscience. 30 (47), 15856-15865 (2010).
  33. Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms. Journal of Neuroscience. 39 (42), 8209-8216 (2019).
  34. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200 (1992).
  35. Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins. Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

ND6Exo endocytosis Exo endocytosis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved