Medindo o Turnover Lipídico da Membrana com o Análogo Lipídico Fluorescente Sensível ao pH ND6

Resumo

Este protocolo apresenta um método de imagem por fluorescência que utiliza uma classe de fluoróforos lipídicos sensíveis ao pH para monitorar o tráfego de membrana lipídica durante a exocitose celular e o ciclo de endocitose.

Resumo

Exo-/endocitose é um processo comum que medeia a troca de biomoléculas entre as células e seu ambiente e entre diferentes células. Células especializadas usam esse processo para executar funções vitais do corpo, como a secreção de insulina das células β e liberação de neurotransmissores das sinapses químicas. Devido ao seu significado fisiológico, a exo-/endocitose tem sido um dos tópicos mais estudados em biologia celular. Muitas ferramentas têm sido desenvolvidas para estudar este processo a nível de genes e proteínas, por causa das quais muito se sabe sobre a maquinaria proteica que participa neste processo. No entanto, poucos métodos foram desenvolvidos para medir o turnover lipídico da membrana, que é a base física da exo-/endocitose.

Este artigo apresenta uma classe de novos análogos lipídicos fluorescentes exibindo fluorescência dependente de pH e demonstra seu uso para rastrear a reciclagem lipídica entre a membrana plasmática e as vesículas secretoras. Auxiliados por simples manipulações de pH, esses análogos também permitem a quantificação da distribuição lipídica através da superfície e dos compartimentos da membrana intracelular, bem como a medida da taxa de turnover lipídico durante a exo-/endocitose. Esses novos repórteres lipídicos serão de grande interesse para vários campos de pesquisa biológica, como biologia celular e neurociência.

Introdução

A bicamada lipídica é um dos conjuntos de biomoléculas mais comuns e é indispensável para todas as células. Fora das células, forma a membrana plasmática que faz interface com as células e seu ambiente; Dentro das células, compartimentaliza várias organelas especializadas para designar funcionalidades. Mais dinâmicas do que paradas, as membranas lipídicas experimentam constantemente fusão e fissão, o que medeia o transporte de biomateriais, a reforma da organela, a mudança morfológica e a comunicação celular. Sem dúvida, a membrana lipídica é a base física para quase todos os processos celulares, e sua disfunção desempenha um papel crucial em várias desordens que vão desde o câncer¹ até a doença de Alzheimer². Embora as moléculas lipídicas sejam muito menos diversas do que as proteínas, a pesquisa de membrana até agora tem sido principalmente centrada em proteínas. Por exemplo, sabe-se muito mais sobre a maquinaria proteica do que sobre os lipídios na exocitose ^3,4,5. Além disso, a organização, distribuição, dinâmica e homeostase dos lipídios através das membranas superficiais e intracelulares permanecem em grande parte inexploradas em comparação com as proteínas de membrana⁶.

Isso não é surpreendente, pois técnicas modernas de biologia molecular, como a mutagênese, fornecem uma vantagem metodológica para estudar proteínas em vez de lipídios. Por exemplo, a marcação transgênica de proteína verde fluorescente sensível ao pH (também conhecida como pHluorina) para proteínas vesiculares facilita a medida quantitativa da quantidade e taxa de turnover proteico vesicular durante a exo-/endocitose ^7,8,9. No entanto, é quase impossível modificar geneticamente os lipídios da membrana in vivo. Além disso, manipulações qualitativas e mesmo quantitativas de quantidades e distribuições de proteínas são muito mais viáveis do que as de lipídios¹⁰. No entanto, lipídios fluorescentes nativos e sintéticos têm sido isolados e desenvolvidos para simular lipídios de membrana endógena in vitro e in vivo¹¹. Um grupo de lipídios fluorescentes amplamente utilizado são os corantes estiril, por exemplo, FM1-43, que exibem fluorescência realçada por membrana e são uma ferramenta poderosa no estudo da liberação de vesículas sinápticas (VS) em neurônios¹². Ultimamente, corantes lipídicos sensíveis ao ambiente têm sido inventados e amplamente utilizados como uma nova classe de repórteres para estudar várias propriedades da membrana celular, incluindo potencial de membrana¹¹, ordem de fase¹³ e secreção¹⁴.

Uma nova classe de miméticos lipídicos cuja fluorescência é sensível ao pH (por exemplo, pHluorina) e sensível à membrana (por exemplo, FM1-43) foi desenvolvida para medir diretamente a distribuição lipídica na membrana plasmática e endossomos/lisossomos e o tráfego lipídico durante a exo-/endocitose. Os conhecidos fluoróforos solvatocrômicos exibindo características push-pull devido à transferência de carga intramolecular foram selecionados para este propósito. Dentre os fluoróforos solvatocrômicos existentes, o arcabouço 1,8-naftalimida (ND) é relativamente fácil de modificar, versátil para marcação, único em fotofísica¹⁵ e, portanto, tem sido utilizado em intercaladores de DNA, diodos orgânicos emissores de luz e sensores de biomoléculas 16,17,18.

A ligação de um grupo doador de elétrons à posição C4 do arcabouço ND gera uma estrutura push-pull, que leva a um aumento do momento dipolar ao redistribuir a densidade eletrônica no estado excitado^19,20. Tal transferência de carga intramolecular produz grandes rendimentos quânticos e desvios de Stokes, resultando em fluorescência brilhante e estável²¹. Recentemente, esse grupo desenvolveu uma série de análogos lipídicos solvatocrômicos baseados no arcabouço ND e os obteve com bons rendimentos sintéticos²⁰.

A caracterização espectroscópica mostra que, dentre esses produtos, o ND6 possui as melhores propriedades de fluorescência (Figura 1)²⁰. Primeiro, ele tem picos de excitação e emissão bem separados (ou seja, ~400 nm e ~520 nm, respectivamente, na Figura 2A,B) em comparação com fluoróforos populares como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou GFP, tornando-o espectralmente separável deles e, portanto, útil para imagens multicoloridas. Em segundo lugar, a fluorescência ND6 exibe um aumento de mais de oito vezes em sua fluorescência na presença de micelas (Figura 2C), sugerindo uma forte dependência de membrana. Estudos prévios de fluorescência de células vivas com diferentes tipos de células mostraram excelente coloração de membrana por ND6²⁰. Terceiro, quando o pH da solução é diminuído de 7,5 (comumente encontrado em ambientes extracelulares ou citosólicos) para 5,5 (comumente encontrado em endossomos e lisossomos), o ND6 mostra um aumento de aproximadamente duas vezes na fluorescência (Figura 2D), mostrando sua sensibilidade ao pH. Além disso, a simulação de dinâmica molecular indica que o ND6 se integra prontamente à bicamada lipídica com seu arcabouço ND voltado para fora da membrana e do resíduo de piperazina mostrando fortes interações com grupos de cabeças de fosfolipídios (Figura 3). Em conjunto, essas características fazem do ND6 um análogo lipídico fluorescente ideal para visualizar e medir o turnover lipídico da membrana durante a exo-/endocitose.

Este trabalho apresenta um método para estudar a taxa de turnover e a dinâmica de lipídios SV usando cultura de neurônios hipocampais de camundongos. Ao estimular neurônios com soluções de Tyrode, com alto teor de K⁺, as VS e a membrana plasmática foram carregadas com ND6 (Figura 4A,B). Posteriormente, os neurônios foram reestimulados com diferentes estímulos, seguidos por soluções de NH₄Cl e pH 5,5 de Tyrode (Figura 4D). Esse protocolo facilita a mensuração quantitativa das taxas de exocitose e endocitose montadas em diferentes circunstâncias (Figura 4C).

Protocolo

O protocolo a seguir inclui (1) um procedimento simplificado para estabelecer culturas hipocampais e corticais de camundongos com base em um protocolo bem^{estabelecido22}, (2) uma breve introdução a uma instalação de microscópio de epifluorescência para neurônios vivos, (3) uma descrição detalhada da carga e imagem de ND6 em neurônios de camundongo, (4) uma discussão sobre a quantificação do tráfego de membrana pelo sinal ND6. Todos os procedimentos seguem as diretrizes de biossegurança e IACUC da Florida Atlantic University. A síntese de ND6 já foi descrita^{anteriormente20}.

1. Preparação das culturas hipocampal e cortical de camundongos

NOTA: Se não especificado de outra forma, todas as etapas devem ser executadas em uma capela de fluxo laminar nível 2 de biossegurança. Esterilizar todas as ferramentas e materiais.

1. Use pinças de tamanho 5 para colocar tampas de vidro em placas de cultura multipoço.
   NOTA: Por exemplo, uma placa de 24 poços é ideal para lamínulas de 12 mm .
2. Adicionar o volume apropriado de matrizes extracelulares para revestir a superfície de cultura celular (por exemplo, 75 μL de solução de matriz de membrana basal por lamínula de 12 mm ; ver Tabela de Materiais)
3. Colocar as placas preparadas na incubadora de cultura de tecidos (5% CO₂, 100% de umidade e 37 °C) por 1-4 h para permitir a reticulação da matriz da membrana basal.
4. Sacrificar os animais, abrir o crânio e transferir todo o cérebro para uma placa de Petri de 35 mm com 3 mL de Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) contendo 20% de soro fetal bovino (H+20). Corte o cérebro ao longo da linha média e separe os córtices e hipocampos em uma capela de dissecção de fluxo laminar para reduzir a contaminação.
5. Use microtesouras para cortar os tecidos em pequenos pedaços (~1 mm³). Transfira esses tecidos para um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de H+20.
6. Lavar os tecidos três vezes com 5 mL de H+20 e três vezes com 5 mL de HBSS.
7. Adicionar 1,5 ml de tripsina a 1% com ácido etilenodiaminotetracético e incubar a 37 °C durante 10 minutos para digestão enzimática.
8. Repita o passo 1.6 e utilize o vácuo para aspirar HBSS no final.
9. Dissociar os tecidos mecanicamente em 1 mL de HBSS contendo 2,95 g/L de MgSO₄•7H₂O usando uma pipeta de vidro polido a fogo.
10. Centrifugar a suspensão celular a 400 × g, 4 °C durante 5 min.
11. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em um volume apropriado de meio de cultura para obter uma concentração de ~10.000.000 células/ml.
12. Plaquear as células a ~1.000.000 células/cm² e colocar a cultura na incubadora (5% CO₂, 100% de umidade e 37 °C) por 1-4 h para facilitar a fixação das células às lamínulas de vidro.
13. Adicione um volume apropriado de meio de cultura (por exemplo, 1 mL por poço para uma placa de 24 poços). Adicione o mesmo volume de meio de cultura após 1 semana. Após 2 semanas, substitua metade do meio de cultura existente por meios frescos a cada semana.

2. Configuração do microscópio para imagens de fluorescência de células vivas

NOTA: Uma configuração de imagem exemplar (Figura 5) inclui pelo menos um microscópio de fluorescência invertida (consulte a Tabela de Materiais), fonte de luz de fluorescência com obturador automático, conjuntos de filtros de fluorescência (por exemplo, para geração de imagens ND6, use 405/10 BP para excitação, 495 LP para dicroico e 510/20 BP para emissão) e uma câmera de alta sensibilidade (Tabela de Materiais), todos controlados por software de aquisição de imagens (Tabela de Materiais).

1. Prepare uma câmara de imagem que permita o controle de temperatura e a entrada/saída de solução para imagens de fluorescência de células vivas.
   NOTA: Por exemplo, uma câmara de imagem de banho aberto modificada fixada em uma plataforma de aquecimento foi usada neste protocolo (Figura 6).
2. Configure um dispositivo programável para alternar as soluções de perfusão e fornecer o estímulo elétrico em pontos de tempo definidos durante a aquisição de imagens.
   NOTA: A sincronização de hardware e software é necessária para análises quantitativas (Figura 7). Por exemplo, nesse protocolo, uma saída de gatilho da câmera de imagem foi usada para iniciar um programa de computador que controla um dispositivo de comutação automática, que controla um sistema de perfusão multicanal e um estimulador de pulso quadrado.
3. Para co-imagear dois ou mais repórteres fluorescentes, execute imagens de fluorescência multicanal alternando sequencialmente conjuntos de filtros ou dividindo simultaneamente diferentes emissões de fluorescência e projetando para a mesma câmera.

3. Carregamento e obtenção de imagens ND6 em culturas neuronais

1. Pesar uma quantidade adequada de ND6, dissolvê-lo em dimetilsulfóxido (DMSO) e deixá-lo solubilizar à temperatura ambiente; sonicar brevemente (por exemplo, 3 min). Filtrar a solução-mãe bruta utilizando um filtro de 0,22 μm para remover grandes agregados corantes. Após filtração, determinar a concentração do corante por espectroscopia de absorção a 405 nm usando um espectrofotômetro convencional ou de microvolume usando ε = 10.700 ^{M-1 cm-1}.
2. Antes da aplicação, diluir a solução-mãe até uma concentração de 1 μM utilizando a solução de banho. Manter a solução-mãe à temperatura ambiente no escuro.
3. Marcação de endossomos e vesículas sinápticas
   1. Para rotular de forma ubíqua compartimentos de membrana endocitosados, como endossomos, adicione a solução estoque de ND6 (por exemplo, 1 mM em DMSO) ao meio de cultura na concentração final de 1 μM e incube a 5% de CO₂, 100% de umidade e 37 °C por 30 min. Para reduzir a extensão da marcação de VS, suprimir farmacologicamente a atividade neuronal espontânea. Por exemplo, utilizar a tetrodotoxina para bloquear potenciais de ação ou o ácido 2,3-dioxo-6-nitro-1,2,3,4-tetraidrobenzo[f]quinoxalina-7-sulfonamida (NBQX) e o ácido D-(-)-2-amino-5-fosfonopentanóico (D-AP5) para inibir a transmissão excitatória²³.
   2. Para marcar seletivamente as SVs, use estimulação breve, mas forte, para evocar exo-/endocitose pré-sináptica. Primeiro, transfira a(s) tampa(s) de cultura para uma placa de Petri de 35 mm contendo 2 mL de solução normal de Tyrode à temperatura ambiente. Em segundo lugar, diluir a solução-estoque de ND6 em solução de Tyrode com alto teor de K⁺ (KCl 90 mM) na concentração final de 1 μM. Em terceiro lugar, substitua a solução normal de Tyrode na placa de Petri por uma solução de Tyrode com alto teor de K⁺ ND6 e incube à temperatura ambiente durante 2 minutos.
4. Transferir a cultura celular marcada com ND6 para a câmara de imagem preenchida com solução normal de Tyrode pré-aquecida contendo 10 μM NBQX e 10 μM D-AP5.
5. Ajustar a velocidade de perfusão para ~0,2 mL/s (ou seja, 1 gota por segundo) e iniciar a perfusão da solução normal de Tyrode pré-aquecida contendo NBQX e D-AP5 para remover o excesso de ND6 na cultura.
6. Ajuste o foco e localize o campo de visão apropriado contendo neurônios saudáveis e bem espalhados com neuritos conectados. Evite áreas que contenham coloides corantes não resolvidos.
7. Tente criar imagens de células carregadas com ND6 com diferentes tempos de exposição para identificar as melhores configurações de imagem.
   NOTA: Para o melhor tempo de exposição, a maior intensidade de fluorescência de pixels na imagem resultante é cerca de metade do intervalo de bits (por exemplo, para uma imagem de 16 bits, o intervalo de bits é de 0 a 65.535), o que permitirá um aumento adicional na fluorescência quando a solução de banho ácido for aplicada. O tempo de exposição selecionado deve ser usado para todas as imagens ND6.
8. Estabeleça o protocolo de estimulação e perfusão, o frame interval e a duração total. Por exemplo, no protocolo a seguir, use uma linha de base de 30 s, uma estimulação de campo elétrico de 10 s 30 Hz, recuperação de 50 s, K⁺ de 120 s 90 mM, recuperação de 60 s, solução de Tyrode de 60 s com NH₄Cl de 50 mM, solução de Tirode de 60 s em pH 5,5 e um intervalo de quadros de 3 s.
9. Iniciar a aquisição das imagens acompanhado da estimulação e perfusão sincronizadas. Monitore a simulação e a troca de soluções durante a aquisição de imagens.
10. Pare a perfusão após o término da imagem, remova a lamínula e limpe a câmara de imagem para o próximo teste.

4. Quantificação do tráfego de membrana por uma mudança na fluorescência ND6

1. Faça backup e/ou cópia eletrônica de todos os arquivos de imagem.
2. Escolha um programa de análise para extração de dados, por exemplo, um software de análise de imagem de código aberto como o ImageJ²⁴ e/ou FIJI²⁵.
3. Abra ou importe uma pilha de imagens para o programa de análise.
4. Defina a primeira imagem como referência e alinhe o restante a ela usando funções/plugins como o Rigid Registration²⁶, que mitigará artefatos devido ao xy-drifting. Consulte a Figura 8 para ver imagens de exemplo.
5. Média de todas as imagens adquiridas durante a pré-linha de base de 30 s para produzir uma imagem de referência. Salve uma cópia desta imagem para referência futura.
6. Defina o limite de intensidade para gerar uma imagem binária a partir da imagem média da linha de base.
7. Use Watershed no ImageJ ou funções semelhantes em outro programa para separar neuritos ou células de conexão.
8. Use a função Analisar Partícula com tamanho de área e circularidade apropriados para solicitar regiões de interesse (ROIs) correspondentes a membranas celulares, endossomos, lisossomos ou boutons sinápticos. Salve todos os ROIs selecionados.
9. Selecione quatro ROIs em segundo plano em regiões livres de células dentro do campo de visão.
10. Meça as intensidades médias de pixel para cada ROI em cada quadro da pilha de imagens e exporte os resultados para análise estatística.
11. Calcule a intensidade média das ROIs de fundo como o ruído basal, que será subtraído das intensidades médias de pixel para cada ROI.
12. Média das três maiores intensidades médias para cada ROI selecionada durante a aplicação da solução de Tyrode pH 5,5 para obtenção da intensidade máxima de fluorescência, que é definida como 100% para normalização.
13. Média das três menores intensidades médias para cada ROI selecionada durante a aplicação de 50 mM NH₄Cl para definir a intensidade mínima de fluorescência, que é definida como 0% para normalização.
14. Calcule as mudanças relativas de fluorescência para cada ROI com base em suas próprias intensidades de 0% e 100%. Derive mudanças de fluorescência média, cinética de mudança e outros valores/gráficos de dados individuais de ROI.

Resultados

As VS são especializadas na liberação de neurotransmissores via exo-/endocitose evocada²⁷. As SVs têm lúmen altamente ácido (i.e., pH 5,5), o que é ideal para ND6. Utilizamos alta estimulação com K⁺ para evocar a VS exo-/endocitose a fim de permitir que o ND6 acessasse o VS. Esperava-se que pontos fluorescentes verde-vivos ao longo dos processos neuronais aparecessem após a carga (Figura 9A). O perfil de retas mostrado na Figura 4B

Discussão

Corantes à base de lipídios, como 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina (DiI) e perclorato de 3,3′-dioctadeciloxacarbocianina (DiO), têm sido usados há muito tempo para ilustrar a morfologia celular e rastrear processos celulares, como as projeções axonais dos neurônios. Corantes de estirila, como o FM1-43, têm sido inventados e utilizados com sucesso para o estudo da exocitose³⁴. Devido à sua baixa afinidade com a membrana, eles marcam seletivamente as vesículas ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digidata 1440A Data Acquistion System	Molecular Devices	Digidata 1440A	For synchronized stimulation and solution exchange
Dual Channel Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B	For live-cell imaging
Fetal Bovine Serum	OMEGA Scientific	FB-01	For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera	Hamamatsu Inc.	C13440-20CU	high-sensitivity camera
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma	H6648	For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Heated Platform	Warner Instruments	PH-1	For live-cell imaging
Matrigel	BD Biosciences	354234	For tissue culture
Micro-G Vibration Isolation Table	TMC	63-564	For live-cell imaging
Micro-manager	https://micro-manager.org/	NA	For image acquisition control
Multi-Line In-Line Solution Heater	Warner Instruments	SHM-6	For live-cell imaging
Neurobasal Plus Medium	THermoFisher Scientific	A3582901	For tissue culture
Nikon Ti-E Inverted Microscope	Nikon	Ti-E/B	For live-cell imaging
ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera	Hamamatsu	C1340-20CU	For live-cell imaging
Perfusion Chamber	Warner Instruments	RC-26G	For live-cell imaging
Six-Channel Valve Control Perfusion System	Warner Instruments	VC-6	For solution exchange
Square Pulse Stimulator	Grass Instrument	SD9	For electric field stimulation