In This Article

Summary

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania fluorescencyjnego, która wykorzystuje klasę wrażliwych na pH fluoroforów lipidowych do monitorowania transportu błony lipidowej podczas egzocytozy komórkowej i cyklu endocytozy.

Abstract

Egzo-/endocytoza to powszechny proces pośredniczący w wymianie biomolekuł między komórkami a ich otoczeniem oraz między różnymi komórkami. Wyspecjalizowane komórki wykorzystują ten proces do wykonywania ważnych funkcji organizmu, takich jak wydzielanie insuliny z komórek β i uwalnianie neuroprzekaźników z synaps chemicznych. Ze względu na swoje znaczenie fizjologiczne, egzo-/endocytoza jest jednym z najczęściej badanych tematów w biologii komórki. Opracowano wiele narzędzi do badania tego procesu na poziomie genów i białek, dzięki czemu wiele wiadomo o maszynerii białkowej uczestniczącej w tym procesie. Jednak opracowano bardzo niewiele metod pomiaru obrotu lipidów błonowych, który jest fizyczną podstawą egzo-/endocytozy.

Ten artykuł przedstawia klasę nowych fluorescencyjnych analogów lipidów wykazujących fluorescencję zależną od pH i demonstruje ich zastosowanie do śledzenia recyklingu lipidów między błoną plazmatyczną a pęcherzykami wydzielniczymi. Wspomagane prostymi manipulacjami pH, analogi te umożliwiają również ilościowe określenie rozmieszczenia lipidów na powierzchni i przedziałach błony wewnątrzkomórkowej, a także pomiar szybkości obrotu lipidów podczas egzo-/endocytozy. Te nowatorskie reportery lipidowe będą bardzo interesujące dla różnych dziedzin badań biologicznych, takich jak biologia komórki i neuronauka.

Introduction

Dwuwarstwa lipidowa jest jednym z najpowszechniejszych zespołów biomolekuł i jest niezbędna dla wszystkich komórek. Na zewnątrz komórek tworzy błonę plazmatyczną łączącą komórki i ich środowisko; Wewnątrz komórek dzieli się na przedziały różnych organelli wyspecjalizowanych w określonych funkcjach. Błony lipidowe są raczej dynamiczne niż nieruchome, ponieważ nieustannie doświadczają fuzji i rozszczepienia, co pośredniczy w transporcie biomateriału, reformie organelli, zmianie morfologii i komunikacji komórkowej. Niewątpliwie błona lipidowa jest fizyczną podstawą prawie wszystkich procesów komórkowych, a jej dysfunkcja odgrywa kluczową rolę w różnych zaburzeniach, począwszy od raka1 po chorobę Alzheimera2. Chociaż cząsteczki lipidów są znacznie mniej zróżnicowane niż białka, dotychczasowe badania nad błonami koncentrowały się głównie na białkach. Na przykład o wiele więcej wiadomo o maszynerii białkowej niż o lipidach w egzocytozie3,4,5. Co więcej, organizacja, dystrybucja, dynamika i homeostaza lipidów na błonach powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych w dużej mierze pozostają niezbadane w porównaniu z białkami błonowymi6.

To nie jest zaskakujące, ponieważ nowoczesne techniki biologii molekularnej, takie jak mutageneza, zapewniają metodologiczną przewagę w badaniu białek, a nie lipidów. Na przykład, transgeniczne znakowanie wrażliwego na pH białka zielonej fluorescencji (znanego również jako pHluorin) do białek pęcherzykowych ułatwia ilościowy pomiar ilości i szybkości obrotu białek pęcherzykowych podczas egzo-/endocytozy7,8,9. Jednak genetyczna modyfikacja lipidów błonowych in vivo jest prawie niemożliwa. Co więcej, jakościowe, a nawet ilościowe manipulacje ilością i dystrybucją białek są znacznie bardziej wykonalne niż w przypadku lipids10. Niemniej jednak, natywne i syntetyczne lipidy fluorescencyjne zostały wyizolowane i opracowane w celu symulacji endogennych lipidów błonowych in vitro i in vivo11. Jedną z grup szeroko stosowanych lipidów fluorescencyjnych są barwniki styrylowe, np. FM1-43, które wykazują fluorescencję wzmocnioną błoną i są potężnym narzędziem w badaniu uwalniania pęcherzyków synaptycznych (SV) w neuronach12. Ostatnio wynaleziono wrażliwe na środowisko barwniki lipidowe i są one szeroko stosowane jako nowa klasa reporterów do badania różnych właściwości błony komórkowej, w tym potencjału błonowego11, phase order13 i secretion14.

Nowa klasa mimetyki lipidów, których fluorescencja jest zarówno wrażliwa na pH (np. pHluorin), jak i na błonę (np. FM1-43), została opracowana do bezpośredniego pomiaru dystrybucji lipidów w błonie plazmatycznej i endosomach/lizosomach oraz ruchu lipidów podczas egzo-/endocytozy. W tym celu wybrano dobrze znane fluorofory solwatochromowe wykazujące charakterystykę push-pull ze względu na wewnątrzcząsteczkową wymianę ładunku. Spośród istniejących fluoroforów solwatochromowych, rusztowanie 1,8-naftalimidowe (ND) jest stosunkowo łatwe do modyfikacji, wszechstronne do znakowania i jest unikalne w fotofizyce15 i dlatego było używane w interkalatorach DNA, organicznych diodach elektroluminescencyjnych i czujnikach biomolekuł16,17,18.

Dołączenie grupy oddającej elektrony do pozycji C4 rusztowania ND generuje strukturę push-pull, która prowadzi do zwiększenia momentu dipolowego poprzez redystrybucję gęstości elektronów w stanie wzbudzonym19,20. Takie wewnątrzcząsteczkowe przeniesienie ładunku powoduje duże uzysk kwantowy i przesunięcia Stokesa, co skutkuje jasną i stabilną fluorescencją21. Grupa ta opracowała ostatnio serię solwatochromowych analogów lipidowych opartych na rusztowaniu ND i uzyskała je z dobrą wydajnością syntetyczną20.

Charakterystyka spektroskopowa pokazuje, że spośród tych produktów, ND6 posiada najlepsze właściwości fluorescencyjne (Rysunek 1)20. Po pierwsze, ma dobrze oddzielone piki wzbudzenia i emisji (tj. odpowiednio ~400 nm i ~520 nm, w Rysunek 2A,B) w porównaniu z popularnymi fluoroforami, takimi jak izotiocyjanian fluoresceiny, rodamina lub GFP, dzięki czemu jest od nich spektralnie oddzielalny, a tym samym przydatny do obrazowania wielobarwnego. Po drugie, fluorescencja ND6 wykazuje ponad ośmiokrotny wzrost fluorescencji w obecności miceli (Rysunek 2C), co sugeruje silną zależność od błony. Wcześniejsze badania obrazowania fluorescencji żywych komórek z różnymi typami komórek wykazały doskonałe barwienie błony przez ND620. Po trzecie, gdy pH roztworu zmniejsza się z 7,5 (powszechnie występujące w środowiskach zewnątrzkomórkowych lub cytozolowych) do 5,5 (powszechnie występujące w endosomach i lizosomach), ND6 wykazuje około dwukrotny wzrost fluorescencji (Rysunek 2D), co pokazuje jego wrażliwość pH. Co więcej, symulacja dynamiki molekularnej wskazuje, że ND6 łatwo integruje się z dwuwarstwą lipidową z rusztowaniem ND skierowanym na zewnątrz błony i resztą piperazyny, wykazując silne interakcje z grupami głów fosfolipidów (Rysunek 3). Podsumowując, te cechy sprawiają, że ND6 jest idealnym fluorescencyjnym analogiem lipidów do wizualizacji i pomiaru obrotu lipidów w błonie podczas egzo-/endocytozy.

Ten artykuł przedstawia metodę badania szybkości obrotu i dynamiki lipidów SV przy użyciu hodowanych mysich neuronów hipokampa. Stymulując neurony roztworami Tyrode'a o wysokiej zawartości K+, SV i błonę plazmatyczną załadowano ND6 (Figura 4A,B). Następnie neurony zostały ponownie stymulowane różnymi bodźcami, a następnie roztworami NH4Cl i pH 5,5 Tyrode (Ryc. 4D). Protokół ten ułatwia ilościowy pomiar złożonych wskaźników egzocytozy i endocytozy w różnych okolicznościach (Rysunek 4C).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Następujący protokół zawiera (1) uproszczoną procedurę tworzenia hodowli hipokampa i kory mózgowej myszy w oparciu o dobrze znany protokół22, (2) krótkie wprowadzenie do konfiguracji mikroskopu epifluorescencyjnego dla żywych neuronów, (3) szczegółowy opis ładowania i obrazowania ND6 w neuronach myszy, (4) dyskusję na temat kwantyfikacji transportu błonowego przez sygnał ND6. Wszystkie procedury są zgodne z wytycznymi bezpieczeństwa biologicznego i IACUC na Uniwersytecie Atlantyckim Florydy. Synteza ND6 została opisana wcześniej20.

1. Przygotowanie kultur hipokampa i kory mózgowej myszy

UWAGA: Jeśli nie określono inaczej, wszystkie kroki muszą być wykonane w okapie z przepływem laminarnym poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2. Wysterylizuj wszystkie narzędzia i materiały.

  1. Użyj kleszczyków o rozmiarze 5, aby umieścić szklane szkiełka nakrywkowe na wielodołkowych płytkach hodowlanych.
    UWAGA: Na przykład płytka 24-dołkowa jest idealna do szkiełek nakrywkowych 12 mm figure-protocol-1 szkiełka nakrywkowe.
  2. Dodać odpowiednią objętość matryc zewnątrzkomórkowych, aby pokryć powierzchnię hodowli komórkowej (np. 75 μl roztworu macierzy błony podstawnej na 12 mm figure-protocol-2 szkiełko nakrywkowe; patrz Tabela Materiałów)
  3. Przygotowane płytki umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych (5% CO2, 100% wilgotności i 37 °C) na 1-4 godziny, aby umożliwić sieciowanie macierzy błony podstawnej.
  4. Złóż zwierzęta w ofierze, otwórz czaszkę i przenieś cały mózg na szalkę Petriego o średnicy 35 mm z 3 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) zawierającego 20% płodowej surowicy bydlęcej (H+20). Przetnij mózg wzdłuż linii środkowej i oddziel korę i hipokampy w okapie preparacyjnym z przepływem laminarnym, aby zmniejszyć zanieczyszczenie.
  5. Za pomocą mikronożyczek pokrój tkanki na małe kawałki (~1 mm3). Przenieś te tkanki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml H+20.
  6. Umyj chusteczki trzykrotnie 5 ml H+20 i trzy razy 5 ml HBSS.
  7. Dodać 1,5 ml 1% trypsyny z kwasem etylenodiaminotetraoctowym i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut w celu trawienia enzymatycznego.
  8. Powtórz krok 1.6 i na koniec użyj próżni, aby zassać HBSS.
  9. Dysocjować tkanki mechanicznie w 1 ml HBSS zawierającym 2,95 g/L MgSO4•7H2O za pomocą pipety ze szkła polerowanego ogniowo.
  10. Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 400 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  11. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości pożywki hodowlanej, aby uzyskać stężenie ~10 000 000 komórek/ml.
  12. Umieść komórki w temperaturze ~ 1 000 000 komórek/cm2 i umieść kulturę w inkubatorze (5% CO2, 100% wilgotności i 37 °C) na 1-4 godziny, aby ułatwić przyczepienie komórek do szklanych szkiełek nakrywkowych.
  13. Dodać odpowiednią objętość pożywki hodowlanej (np. 1 ml na dołek dla płytki 24-dołkowej). Dodaj tę samą objętość pożywki hodowlanej po 1 tygodniu. Po 2 tygodniach co tydzień zastępuj połowę istniejącej pożywki hodowlaną świeżą pożywką.

2. Ustawienie mikroskopu do obrazowania fluorescencji żywych komórek

UWAGA: Przykładowy zestaw do obrazowania (Rysunek 5) obejmuje co najmniej odwrócony mikroskop fluorescencyjny (patrz Tabela Materiałów), fluorescencyjne źródło światła z automatyczną migawką, zestawy filtrów fluorescencyjnych (np. do obrazowania ND6, użyj 405/10 BP do wzbudzenia, 495 LP do dichroicznej i 510/20 BP do emisji) oraz kamerę o wysokiej czułości (Tabela materiałów), z których wszystkie są kontrolowane przez oprogramowanie do akwizycji obrazów (tabela materiałów).

  1. Przygotuj komorę obrazowania, która umożliwia kontrolę temperatury i wejście/wyjście roztworu do obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek.
    UWAGA: Na przykład w tym protokole zastosowano zmodyfikowaną komorę obrazowania w wannie otwartej zamocowaną na platformie grzewczej (Rysunek 6).
  2. Skonfiguruj programowalne urządzenie, aby przełączać roztwory perfuzyjne i dostarczać bodziec elektryczny w określonych punktach czasowych podczas obrazowania.
    UWAGA: Synchronizacja sprzętowa i programowa jest niezbędna do analiz ilościowych (Rysunek 7). Na przykład w tym protokole wyjście wyzwalające z kamery obrazującej zostało użyte do uruchomienia programu komputerowego, który steruje automatycznym urządzeniem przełączającym, które steruje wielokanałowym systemem perfuzyjnym i stymulatorem impulsów kwadratowych.
  3. Aby uzyskać jednoczesne obrazowanie dwóch lub więcej reporterów fluorescencyjnych, należy wykonać wielokanałowe obrazowanie fluorescencyjne, sekwencyjnie przełączając zestawy filtrów lub jednocześnie rozdzielając różne emisje fluorescencji i wyświetlając je w tej samej kamerze.

3. Ładowanie i obrazowanie ND6 w kulturach neuronalnych

  1. Odważyć odpowiednią ilość ND6, rozpuścić go w dimetylosulfotlenku (DMSO) i pozostawić do rozpuszczenia w temperaturze pokojowej; dokonać krótkiej sonikacji (np. 3 min). Przefiltrować surowy roztwór podstawowy za pomocą filtra 0,22 μm w celu usunięcia dużych agregatów barwnika. Po filtracji oznaczyć stężenie barwnika za pomocą spektroskopii absorpcyjnej przy długości fali 405 nm przy użyciu spektrofotometru konwencjonalnego lub mikroobjętościowego, przyjmując ε = 10 700 M-1 cm-1.
  2. Przed zastosowaniem rozcieńczyć roztwór podstawowy do stężenia 1 μM przy użyciu roztworu do kąpieli. Roztwór podstawowy należy przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności.
  3. Znakowanie endosomów i pęcherzyków synaptycznych
    1. Aby wszędobylnie znakować endocytozowane przedziały błonowe, takie jak endosomy, dodaj roztwór podstawowy ND6 (np. 1 mM w DMSO) do pożywki hodowlanej o końcowym stężeniu 1 μM i inkubuj w temperaturze 5% CO2, 100% wilgotności i 37 °C przez 30 minut. Aby zmniejszyć zakres znakowania SV, należy farmakologicznie hamować spontaniczną aktywność neuronalną. Na przykład użyj tetrodotoksyny do zablokowania potencjałów czynnościowych lub 2,3-diokso-6-nitro-1,2,3,4-tetrahydrobenzo[f]chinoksalino-7-sulfonamidu (NBQX) i kwasu D-(-)-2-amino-5-fosfonopentanowego (D-AP5) w celu zahamowania transmisji pobudzającej23.
    2. Aby selektywnie oznaczyć SVs, użyj krótkiej, ale silnej stymulacji, aby wywołać presynaptyczną egzo-/endocytozę. Najpierw przenieś szkiełko nakrywkowe (szkiełka) hodowlane na 35 mm figure-protocol-3 szalkę Petriego zawierającą 2 ml normalnego roztworu Tyrode'a w temperaturze pokojowej. Po drugie, rozcieńczyć roztwór podstawowy ND6 w roztworze Tyrode'a o wysokiej zawartości K+ (90 mM KCl) przy końcowym stężeniu 1 μM. Po trzecie, zastąpić normalny roztwór Tyrode'a na szalce Petriego roztworem Tyrode'a o wysokiej zawartości K+ ND6 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
  4. Przenieś kulturę komórkową znakowaną ND6 do komory obrazowania wypełnionej wstępnie podgrzanym normalnym roztworem Tyrode'a zawierającym 10 μM NBQX i 10 μM D-AP5.
  5. Dostosuj prędkość perfuzji do ~0,2 ml / s (tj. 1 kropla na sekundę) i rozpocznij perfuzję wstępnie podgrzanego normalnego roztworu Tyrode zawierającego NBQX i D-AP5 w celu usunięcia nadmiaru ND6 z hodowli.
  6. Dostosuj ostrość i zlokalizuj odpowiednie pole widzenia zawierające zdrowe i dobrze rozsiane neurony z połączonymi neurytami. Unikaj obszarów zawierających nierozwiązane koloidy barwników.
  7. Spróbuj zobrazować komórki obciążone ND6 z różnymi czasami naświetlania, aby określić najlepsze ustawienia obrazowania.
    UWAGA: Aby uzyskać najlepszy czas ekspozycji, najwyższa intensywność fluorescencji pikseli w wynikowym obrazie wynosi około połowy zakresu bitów (np. dla obrazu 16-bitowego zakres bitów wynosi od 0 do 65 535), co pozwoli na dalszy wzrost fluorescencji po zastosowaniu roztworu kąpieli kwaśnej. Wybrany czas ekspozycji powinien być używany do wszystkich obrazowań ND6.
  8. Ustaw protokół stymulacji i perfuzji, interwał ramki i całkowity czas trwania. Na przykład w poniższym protokole użyj linii podstawowej 30 s, stymulacji polem elektrycznym 10 s 30 Hz, 50 s odzyskiwania, 120 s 90 mM K+, 60 s odzysku, 60 s roztworu Tyrode'a z 50 mM NH4Cl, 60 s roztworu Tyrode'a o pH 5,5 i odstępu między ramkami 3 s.
  9. Rozpocznij akwizycję obrazu, której towarzyszy zsynchronizowana stymulacja i perfuzja. Monitoruj symulację i wymianę rozwiązań podczas obrazowania.
  10. Zatrzymaj perfuzję po zakończeniu obrazowania, usuń szkiełko nakrywkowe i wyczyść komorę obrazowania do następnej próby.

4. Kwantyfikacja transportu błonowego na podstawie zmiany fluorescencji ND6

  1. Utwórz kopię zapasową i/lub elektroniczną kopię wszystkich plików graficznych.
  2. Wybierz program do analizy do ekstrakcji danych, np. oprogramowanie do analizy obrazów typu open source, takie jak ImageJ24 i/lub FIJI25.
  3. Otwórz lub zaimportuj stos obrazów do programu analitycznego.
  4. Ustaw pierwszy obraz jako odniesienie i wyrównaj do niego resztę za pomocą funkcji/wtyczek, takich jak Rigid Registration26, które ograniczą artefakty spowodowane dryfowaniem xy. Zapoznaj się z Rysunek 8, aby zapoznać się z przykładowymi obrazami.
  5. Uśrednij wszystkie obrazy uzyskane w ciągu 30 sekund przed linią bazową, aby uzyskać obraz referencyjny. Zapisz kopię tego obrazu do wykorzystania w przyszłości.
  6. Ustaw próg intensywności, aby wygenerować obraz binarny na podstawie obrazu uśrednionego według linii bazowej.
  7. Użyj Watershed w ImageJ lub podobnych funkcji w innym programie, aby oddzielić łączące neuryty lub komórki.
  8. Użyj funkcji Analizuj cząstkę z odpowiednim rozmiarem obszaru i kołowością, aby uzyskać obszary zainteresowania (ROI) odpowiadające błonom komórkowym, endosomom, lizosomom lub butonom synaptycznym. Zapisz wszystkie wybrane ROI.
  9. Wybierz cztery obszary robocze tła w regionach wolnych od komórek w polu widzenia.
  10. Zmierz średnią intensywność pikseli dla każdego zwrotu z inwestycji w każdej klatce stosu obrazów i wyeksportuj wyniki do analizy statystycznej.
  11. Oblicz średnią intensywność ROI tła jako szum linii bazowej, który zostanie odjęty od średniej intensywności pikseli dla każdego ROI.
  12. Uśrednij trzy najwyższe średnie intensywności dla każdego wybranego ROI podczas aplikacji roztworu Tyrode o pH 5,5, aby uzyskać maksymalną intensywność fluorescencji, która jest zdefiniowana jako 100% dla normalizacji.
  13. Uśrednij trzy najniższe średnie intensywności dla każdego wybranego ROI podczas aplikacji 50 mM NH4Cl, aby ustawić minimalną intensywność fluorescencji, która jest zdefiniowana jako 0% dla normalizacji.
  14. Oblicz względne zmiany fluorescencji dla każdego ROI na podstawie jego własnych intensywności 0% i 100%. Wyprowadzaj średnie zmiany fluorescencji, kinetykę zmian i inne wartości/wykresy z indywidualnych danych ROI.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

SVs są wyspecjalizowane w uwalnianiu neuroprzekaźników poprzez wywołaną egzo-/endocytozę27. SV mają bardzo kwaśny strumień świetlny (tj. pH 5,5), który jest idealny dla ND6. Zastosowaliśmy stymulację o wysokiej zawartości K+, aby wywołać egzo-/endocytozę SV, aby umożliwić ND6 dostęp do SV. Można się było spodziewać, że po załadowaniu pojawiły się jasnozielone fluorescencyjne punkty wzdłuż procesów neuronalnych (Ryc. 9A). Profil...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Barwniki na bazie lipidów, takie jak 1,1′-dioktadecylo-3,3,3′,3′-tetrametyloindokarbocyjanina (DiI) i nadchloran 3,3′-dioktadecyloksakarbocyjaniny (DiO), od dawna są używane do ilustrowania morfologii komórek i śledzenia procesów komórkowych, takich jak projekcje aksonów neuronów. Barwniki styrylowe, takie jak FM1-43, zostały wynalezione i z powodzeniem stosowane do badania egzocytozy34. Ze względu na ich niskie powinowactwo do błony, selektywnie znakują pęcherzyki endocytozo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Acknowledgements

Ta praca była wspierana przez Florida Atlantic University Office of Undergraduate Research and Inquiry grant (M.J.S.), Florida Department of Health Ed and Ethel Moore Pilot Grant 20A17 (Q.Z.), Alzheimer's Association grant AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) oraz NIA R21 grant AG061656-01A1 (Q.Z.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Digidata 1440A Data Acquistion SystemUrządzenia molekularneDigidata 1440ADo zsynchronizowanej stymulacji i wymiany roztworów
Dwukanałowy regulator temperaturyWarner InstrumentsTC-344BDo obrazowania żywych komórek
Surowica bydlęcapłodu OMEGA ScientificFB-01Do sporządzania roztworu H+20 stosowanego w sekcjach i hodowlach tkankowych
Hamamatsu Flash4.0 sCOMS kameraHamamatsu Inc.Kamera C13440-20CUwysokiej czułości
Zrównoważony roztwór soliHanka SigmaH6648Do wytwarzania roztworu H+20 stosowanego w sekcjach i hodowlach tkankowych
Podgrzewana platformaWarner InstrumentsPH-1Do obrazowania żywych komórek
MatrigelBD Biosciences354234Do hodowli tkankowej
Stół do izolacji drgań Micro-GTMC63-564Do obrazowania żywych komórek
Micro-managerhttps://micro-manager.org/NADo kontroli akwizycji obrazu
Wieloliniowy podgrzewacz roztworuWarner InstrumentsSHM-6Do obrazowania żywych komórek
Neurobasal Plus MediumTHermoFisher ScientificA3582901Do hodowli tkankowych
Mikroskop odwrócony Nikon Ti-ENikonTi-E/BDo obrazowania żywych komórek
ORCA-Flash4.0 Cyfrowa kamera CMOSHamamatsuC1340-20CUDo obrazowania żywych komórek
Komora perfuzyjnaWarner InstrumentsRC-26GDo obrazowania żywych komórek
Sześciokanałowy system perfuzji sterowania zaworemWarner InstrumentsVC-6Do wymiany roztworu
Kwadratowy stymulator impulsówInstrument do trawySD9Do stymulacji pola elektrycznego
o

References

  1. Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P. Endocytosis and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 16 (2), 156-161 (2004).
  2. Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection. Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010).
  3. Augustine, G. J., Burns, M. E., DeBello, W. M., Pettit, D. L., Schweizer, F. E. Exocytosis: proteins and perturbations. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 659-701 (1996).
  4. Ammar, M. R., Kassas, N., Chasserot-Golaz, S., Bader, M. F., Vitale, N. Lipids in regulated exocytosis: what are they doing. Frontiers in Endocrinology. 4, 125(2013).
  5. Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112 (4), 519-533 (2003).
  6. Chabanon, M., Stachowiak, J. C., Rangamani, P. Systems biology of cellular membranes: a convergence with biophysics. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 9 (5), 1386(2017).
  7. Prosser, D. C., Wrasman, K., Woodard, T. K., O'Donnell, A. F., Wendland, B. Applications of pHluorin for quantitative, kinetic and high-throughput analysis of endocytosis in budding yeast. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54587(2016).
  8. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nature Protocols. 1 (6), 2970-2978 (2006).
  9. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  10. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  11. Demchenko, A. P., Mély, Y., Duportail, G., Klymchenko, A. S. Monitoring biophysical properties of lipid membranes by environment-sensitive fluorescent probes. Biophysical Journal. 96 (9), 3461-3470 (2009).
  12. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).
  13. Gaus, K., Zech, T., Harder, T. Visualizing membrane microdomains by Laurdan 2-photon microscopy. Molecular Membrane Biology. 23 (1), 41-48 (2006).
  14. Kahms, M., Klingauf, J. Novel pH-sensitive lipid based exo-endocytosis tracers reveal fast intermixing of synaptic vesicle pools. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 18(2018).
  15. Zhou, L., Xie, L., Liu, C., Xiao, Y. New trends of molecular probes based on the fluorophore 4-amino-1,8-naphthalimide. Chinese Chemical Letters. 30 (10), 1799-1808 (2019).
  16. Tomczyk, M. D., Walczak, K. Z. l,8-Naphthalimide based DNA intercalators and anticancer agents. A systematic review from 2007 to 2017. European Journal of Medicinal Chemistry. 159, 393-422 (2018).
  17. Ulla, H., et al. Blue emitting 1,8-naphthalimides with electron transport properties for organic light emitting diode applications. Journal of Molecular Structure. 1143 (5), 344-354 (2017).
  18. Duke, R. M., Veale, E. B., Pfeffer, F. M., Kruger, P. E., Gunnlaugsson, T. Colorimetric and fluorescent anion sensors: An overview of recent developments in the use of 1,8-naphthalimide-based chemosensors. Chemical Society Reviews. 39 (10), 3936-3953 (2010).
  19. Panja, S. K., Dwivedi, N., Saha, S. Tuning the intramolecular charge transfer (ICT) process in push-pull systems: Effect of nitro groups. RSC Advances. 6 (107), 105786-105794 (2016).
  20. Thomas, D., et al. Solvatochromic and pH-sensitive fluorescent membrane probes for imaging of live cells. ACS Chemical Neuroscience. 12 (4), 719-734 (2021).
  21. Leslie, K. G., Jacquemin, D., New, E. J., Jolliffe, K. A. Expanding the breadth of 4-amino-1,8-naphthalimide photophysical properties through substitution of the naphthalimide core. Chemistry - A European Journal. 24 (21), 5569-5573 (2018).
  22. Liu, G. S., Tsien, R. W. Properties of synaptic transmission at single hippocampal synaptic boutons. Nature. 375 (6530), 404-408 (1995).
  23. Zhang, Q., Cao, Y. -Q., Tsien, R. W. Quantum dots provide an optical signal specific to full collapse fusion of synaptic vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 104 (45), 17843-17848 (2007).
  24. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  27. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annual Review of Neuroscience. 27, 509-547 (2004).
  28. Lazarenko, R. M., DelBove, C. E., Strothman, C. E., Zhang, Q. Ammonium chloride alters neuronal excitability and synaptic vesicle release. Scientific Reports. 7 (1), 5061(2017).
  29. Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344 (6187), 1023-1028 (2014).
  30. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (1), 57-69 (2005).
  31. DelBove, C. E., et al. Reciprocal modulation between amyloid precursor protein and synaptic membrane cholesterol revealed by live cell imaging. Neurobiology of Disease. 127, 449-461 (2019).
  32. Dason, J. S., Smith, A. J., Marin, L., Charlton, M. P. Vesicular sterols are essential for synaptic vesicle cycling. Journal of Neuroscience. 30 (47), 15856-15865 (2010).
  33. Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms. Journal of Neuroscience. 39 (42), 8209-8216 (2019).
  34. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200(1992).
  35. Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins. Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

B onowy obr t lipid wwra liwy na PH fluorescencyjny analog lipidowysonda ND6egzocytozaendocytozaintensywno fluorescencjibiologia kom rkitransport b ony lipidowejbiologiczne rodowisko b onykomora obrazowaniaobrazowanie fluorescencji ywych kom rekznakowanie p cherzyk w synaptycznychsupresja farmakologicznast enie barwnikapo ywka hodowlana