Mesure du renouvellement lipidique membranaire avec l’analogue lipidique fluorescent ND6 sensible au pH

Résumé

Ce protocole présente une méthode d’imagerie par fluorescence qui utilise une classe de fluorophores lipidiques sensibles au pH pour surveiller le trafic des membranes lipidiques pendant l’exocytose cellulaire et le cycle d’endocytose.

Résumé

L’exo-/endocytose est un processus courant qui médie l’échange de biomolécules entre les cellules et leur environnement et entre différentes cellules. Les cellules spécialisées utilisent ce processus pour exécuter des fonctions vitales du corps telles que la sécrétion d’insuline par les cellules β et la libération de neurotransmetteurs par les synapses chimiques. En raison de son importance physiologique, l’exocytose a été l’un des sujets les plus étudiés en biologie cellulaire. De nombreux outils ont été développés pour étudier ce processus au niveau des gènes et des protéines, grâce auxquels on sait beaucoup de choses sur la machinerie protéique participant à ce processus. Cependant, très peu de méthodes ont été développées pour mesurer le renouvellement lipidique membranaire, qui est la base physique de l’exo-/endocytose.

Cet article présente une classe de nouveaux analogues lipidiques fluorescents présentant une fluorescence dépendante du pH et démontre leur utilisation pour tracer le recyclage des lipides entre la membrane plasmique et les vésicules sécrétoires. Aidés par de simples manipulations du pH, ces analogues permettent également de quantifier la distribution des lipides à la surface et dans les compartiments de la membrane intracellulaire, ainsi que de mesurer le taux de renouvellement des lipides pendant l’exo-/endocytose. Ces nouveaux rapporteurs lipidiques seront d’un grand intérêt pour divers domaines de recherche biologique tels que la biologie cellulaire et les neurosciences.

Introduction

La bicouche lipidique est l’un des assemblages de biomolécules les plus courants et est indispensable à toutes les cellules. À l’extérieur des cellules, il forme la membrane plasmique qui interface les cellules et leur environnement ; À l’intérieur des cellules, il compartimente divers organites spécialisés pour des fonctionnalités désignées. Plutôt dynamiques qu’immobiles, les membranes lipidiques subissent constamment une fusion et une fission, qui interviennent dans le transport des biomatériaux, la réforme des organites, le changement morphologique et la communication cellulaire. Sans aucun doute, la membrane lipidique est la base physique de presque tous les processus cellulaires, et son dysfonctionnement joue un rôle crucial dans divers troubles allant du cancer¹ à la maladie d’Alzheimer². Bien que les molécules lipidiques soient beaucoup moins diversifiées que les protéines, la recherche sur les membranes a jusqu’à présent été principalement centrée sur les protéines. Par exemple, on en sait beaucoup plus sur la machinerie protéique que sur les lipides dans l’exocytose ^3,4,5. De plus, l’organisation, la distribution, la dynamique et l’homéostasie des lipides à travers les membranes de surface et intracellulaires restent largement inexplorées par rapport aux protéines membranaires⁶.

Ce n’est pas surprenant car les techniques modernes de biologie moléculaire, telles que la mutagénèse, offrent un avantage méthodologique pour étudier les protéines plutôt que les lipides. Par exemple, le marquage transgénique de la protéine fluorescente verte sensible au pH (pHluorine) sur les protéines vésiculaires facilite la mesure quantitative de la quantité et du taux de renouvellement des protéines vésiculaires au cours de l’exocytose^et de l’endocytose ^7,8,9. Cependant, il est presque impossible de modifier génétiquement les lipides membranaires in vivo. De plus, les manipulations qualitatives et même quantitatives des quantités et des distributions de protéines sont beaucoup plus réalisables que celles des lipides¹⁰. Néanmoins, des lipides fluorescents natifs et synthétiques ont été isolés et développés pour simuler des lipides membranaires endogènes in vitro et in vivo¹¹. Un groupe de lipides fluorescents largement utilisés sont les colorants styryliques, par exemple FM1-43, qui présentent une fluorescence membranaire améliorée et constituent un outil puissant dans l’étude de la libération de vésicules synaptiques (SV) dans les neurones¹². Dernièrement, des colorants lipidiques sensibles à l’environnement ont été inventés et largement utilisés comme nouvelle classe de rapporteurs pour étudier diverses propriétés de la membrane cellulaire, notamment le potentiel de membrane¹¹, l’ordre de phase¹³ et la sécrétion¹⁴.

Une nouvelle classe de mimétiques lipidiques dont la fluorescence est à la fois sensible au pH (p. ex., pHluorin) et à la membrane (p. ex., FM1-43) a été mise au point pour mesurer directement la distribution des lipides dans la membrane plasmique et les endosomes/lysosomes et le trafic lipidique pendant l’exo-/endocytose. Les fluorophores solvatochromiques bien connus présentant des caractéristiques push-pull dues au transfert de charge intramoléculaire ont été sélectionnés à cette fin. Parmi les fluorophores solvatochromes existants, l’échafaudage de 1,8-naphtalimide (ND) est relativement facile à modifier, polyvalent pour le marquage, et est unique en photophysique¹⁵ et a donc été utilisé dans les intercalateurs d’ADN, les diodes électroluminescentes organiques et les capteurs de biomolécules 16,17,18.

L’attachement d’un groupe donneur d’électrons à la position C4 de l’échafaudage ND génère une structure push-pull, qui conduit à une augmentation du moment dipolaire en redistribuant la densité électronique dans l’état excité^19,20. Un tel transfert de charge intramoléculaire produit de grands rendements quantiques et des décalages de Stokes, ce qui donne une fluorescence brillante et stable²¹. Ce groupe a récemment développé une série d’analogues lipidiques solvatochromes basés sur l’échafaudage ND et les a obtenus avec de bons rendements synthétiques²⁰.

La caractérisation spectroscopique montre que parmi ces produits, ND6 possède les meilleures propriétés de fluorescence (Figure 1)²⁰. Tout d’abord, il a des pics d’excitation et d’émission bien séparés (c’est-à-dire ~400 nm et ~520 nm, respectivement, dans la figure 2A,B) par rapport aux fluorophores populaires tels que l’isothiocyanate de fluorescéine, la rhodamine ou la GFP, ce qui le rend spectrement séparable d’eux et donc utile pour l’imagerie multicolore. Deuxièmement, la fluorescence ND6 présente une augmentation de plus de huit fois de sa fluorescence en présence de micelles (Figure 2C), suggérant une forte dépendance membranaire. Des études antérieures d’imagerie par fluorescence de cellules vivantes avec différents types de cellules ont montré une excellente coloration membranaire par ND6²⁰. Troisièmement, lorsque le pH de la solution est réduit de 7,5 (couramment trouvé dans les environnements extracellulaires ou cytosoliques) à 5,5 (couramment trouvé dans les endosomes et les lysosomes), ND6 montre une augmentation d’environ deux fois de la fluorescence (Figure 2D), montrant sa sensibilité au pH. De plus, la simulation de dynamique moléculaire indique que ND6 s’intègre facilement dans la bicouche lipidique avec son échafaudage ND tourné vers l’extérieur de la membrane et le résidu de pipérazine montrant de fortes interactions avec les groupes de tête phospholipidiques (Figure 3). Ensemble, ces caractéristiques font de ND6 un analogue lipidique fluorescent idéal pour visualiser et mesurer le renouvellement lipidique membranaire pendant l’exo-/endocytose.

Cet article présente une méthode pour étudier le taux de renouvellement et la dynamique des lipides SV à l’aide de neurones hippocampiques de souris en culture. En stimulant les neurones avec des solutions de Tyrode à haute teneur en K⁺, les SV et la membrane plasmique ont été chargés en ND6 (Figure 4A,B). Par la suite, les neurones ont été restimulés avec différents stimuli suivis de solutions contenant du NH₄Cl et du pH 5,5 de Tyrode (Figure 4D). Ce protocole facilite la mesure quantitative des taux d’exocytose et d’endocytose assemblés dans différentes circonstances (Figure 4C).

Protocole

Le protocole suivant comprend (1) une procédure simplifiée pour établir des cultures hippocampiques et corticales de souris basée sur un protocole bien établi²², (2) une brève introduction à une configuration de microscope à épifluorescence pour les neurones vivants, (3) une description détaillée de la charge et de l’imagerie de ND6 dans les neurones de souris, (4) une discussion sur la quantification du trafic membranaire par le signal ND6. Toutes les procédures suivent les directives de biosécurité et de l’IACUC de la Florida Atlantic University. La synthèse de ND6 a été décrite précédemment²⁰.

1. Préparation des cultures hippocampiques et corticales de souris

REMARQUE : Sauf indication contraire, toutes les étapes doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire de niveau 2 de biosécurité. Stérilisez tous les outils et matériaux.

1. Utiliser une pince de taille 5 pour placer les lamelles de verre dans des plaques de culture multipuits.
   REMARQUE : Par exemple, une plaque à 24 puits est idéale pour les lamelles de 12 mm .
2. Ajouter le volume approprié de matrices extracellulaires pour recouvrir la surface de culture cellulaire (p. ex., 75 μL de solution de matrice de membrane basale par lamelle de 12 mm  ; voir le tableau des matières)
3. Placer les plaques préparées dans l’incubateur de culture tissulaire (5 % de CO₂, 100 % d’humidité et 37 °C) pendant 1 à 4 h pour permettre la réticulation de la matrice de la membrane basale.
4. Sacrifiez les animaux, ouvrez le crâne et transférez tout le cerveau dans une boîte de Pétri de 35 mm avec 3 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) contenant 20 % de sérum fœtal bovin (H+20). Coupez le cerveau le long de la ligne médiane et séparez les cortex et l’hippocampe dans une hotte de dissection à flux laminaire pour réduire la contamination.
5. Utilisez des microciseaux pour couper les tissus en petits morceaux (~1 mm³). Transférez ces tissus dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de H+20.
6. Lavez les mouchoirs trois fois avec 5 ml de H+20 et trois fois avec 5 ml de HBSS.
7. Ajouter 1,5 mL de trypsine à 1 % avec de l’acide éthylènediamine tétraacétique et incuber à 37 °C pendant 10 minutes pour la digestion enzymatique.
8. Répétez l’étape 1.6 et utilisez le vide pour aspirer HBSS à la fin.
9. Dissocier mécaniquement les tissus dans 1 mL de HBSS contenant 2,95 g/L de MgSO₄•7H₂O à l’aide d’une pipette en verre poli au feu.
10. Centrifuger la suspension cellulaire à 400 × g, 4 °C pendant 5 min.
11. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans un volume approprié de milieu de culture pour obtenir une concentration de ~10 000 000 cellules/ml.
12. Plaquez les cellules à ~1 000 000 cellules/cm² et placez la culture dans l’incubateur (5 % de CO₂, 100 % d’humidité et 37 °C) pendant 1 à 4 h pour faciliter la fixation des cellules aux lamelles de verre.
13. Ajouter un volume approprié de milieu de culture (p. ex., 1 mL par puits pour une plaque de 24 puits). Ajouter le même volume de milieu de culture après 1 semaine. Après 2 semaines, remplacez la moitié du milieu de culture existant par des milieux frais chaque semaine.

2. Configuration du microscope pour l’imagerie par fluorescence de cellules vivantes

REMARQUE : Une configuration d’imagerie exemplaire (Figure 5) comprend au moins un microscope à fluorescence inversée (voir le tableau des matériaux), une source lumineuse de fluorescence avec obturateur automatique, des jeux de filtres de fluorescence (par exemple, pour l’imagerie ND6, utilisez 405/10 BP pour l’excitation, 495 LP pour le dichroïque et 510/20 BP pour l’émission) et une caméra haute sensibilité (Table des matériaux), tous contrôlés par un logiciel d’acquisition d’images (Table des matériaux).

1. Préparez une chambre d’imagerie qui permet le contrôle de la température et l’entrée/sortie de solution pour l’imagerie par fluorescence de cellules vivantes.
   REMARQUE : Par exemple, une chambre d’imagerie à bain ouvert modifiée fixée sur une plate-forme chauffante a été utilisée dans ce protocole (Figure 6).
2. Configurez un dispositif programmable pour changer les solutions de perfusion et délivrer le stimulus électrique à des moments définis pendant l’imagerie.
   REMARQUE : La synchronisation matérielle et logicielle est nécessaire pour les analyses quantitatives (Figure 7). Par exemple, dans ce protocole, une sortie de déclenchement de la caméra d’imagerie a été utilisée pour démarrer un programme informatique qui contrôle un dispositif de commutation automatique, qui contrôle un système de perfusion multicanal et un stimulateur à impulsions carrées.
3. Pour co-imager deux rapporteurs fluorescents ou plus, effectuez une imagerie de fluorescence multicanal soit en changeant séquentiellement d’ensembles de filtres, soit en divisant simultanément différentes émissions de fluorescence et en projetant sur la même caméra.

3. Chargement et imagerie de ND6 dans les cultures neuronales

1. Pesez une quantité appropriée de ND6, dissolvez-le dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) et laissez-le se solubiliser à température ambiante ; sonicate brièvement (p. ex., 3 min). Filtrer la solution brute à l’aide d’un filtre de 0,22 μm pour éliminer les gros agrégats de colorant. Après filtration, déterminer la concentration du colorant par spectroscopie d’absorption à 405 nm à l’aide d’un spectrophotomètre conventionnel ou microvolume en utilisant ε = 10 700 ^{M-1 cm-1}.
2. Avant l’application, diluer la solution mère à une concentration de 1 μM à l’aide de la solution de bain. Conservez la solution mère à température ambiante dans l’obscurité.
3. Marquage des endosomes et des vésicules synaptiques
   1. Pour marquer de manière ubiquitaire les compartiments membranaires endocytosés tels que les endosomes, ajouter une solution mère de ND6 (p. ex., 1 mM dans le DMSO) au milieu de culture à la concentration finale de 1 μM, et incuber à 5 % de CO₂, 100 % d’humidité et 37 °C pendant 30 minutes. Pour réduire l’étendue du marquage SV, supprimer l’activité neuronale spontanée pharmacologiquement. Par exemple, utiliser la tétrodotoxine pour bloquer les potentiels d’action ou l’acide 2,3-dioxo-6-nitro-1,2,3,4-tétrahydrobenzo[f]quinoxaline-7-sulfonamide (NBQX) et l’acide D-(-)-2-amino-5-phosphonopentanoïque (D-AP5) pour inhiber la transmission excitatrice²³.
   2. Pour marquer sélectivement les SV, utilisez une stimulation brève mais forte pour évoquer l’exo-/endocytose présynaptique. Tout d’abord, transférez la ou les lamelles de culture dans une boîte de Pétri de 35 mm contenant 2 mL de solution normale de Tyrode à température ambiante. Deuxièmement, diluer la solution mère de ND6 dans une solution de Tyrode à haute teneur en K⁺ (90 mM de KCl) à la concentration finale de 1 μM. Troisièmement, remplacer la solution normale de Tyrode dans la boîte de Pétri par une solution de Tyrode à haute teneur en K⁺ contenant du ND6 et incuber à température ambiante pendant 2 min.
4. Transférer la culture cellulaire marquée ND6 dans la chambre d’imagerie remplie de solution normale de Tyrode préchauffée contenant 10 μM de NBQX et 10 μM de D-AP5.
5. Ajuster la vitesse de perfusion à ~0,2 mL/s (c.-à-d. 1 goutte par seconde) et commencer la perfusion d’une solution normale préchauffée de Tyrode contenant du NBQX et du D-AP5 pour éliminer l’excès de ND6 dans la culture.
6. Ajustez la mise au point et localisez le champ de vision approprié contenant des neurones sains et bien répartis portant des neurites connectées. Évitez les zones contenant des colloïdes de colorant non résolus.
7. Essayez d’imager des cellules chargées de ND6 avec des temps d’exposition différents pour identifier les meilleurs paramètres d’imagerie.
   REMARQUE : Pour un temps d’exposition optimal, l’intensité de fluorescence des pixels la plus élevée dans l’image résultante est d’environ la moitié de la plage de bits (par exemple, pour une image 16 bits, la plage de bits est de 0 à 65 535), ce qui permettra une augmentation supplémentaire de la fluorescence lorsque la solution de bain acide est appliquée. Le temps d’exposition sélectionné doit être utilisé pour toutes les images ND6.
8. Configurez le protocole de stimulation et de perfusion, l’intervalle de cadre et la durée totale. Par exemple, dans le protocole suivant, utilisez une ligne de base de 30 s, une stimulation du champ électrique de 10 s à 30 Hz, une récupération de 50 s, une récupération de 120 s à 90 mM K⁺, une récupération de 60 s, une solution de Tyrode à 60 s avec 50 mM de NH₄Cl, une solution de Tyrode à 60 s à pH 5,5 et un intervalle de trame de 3 s.
9. Démarrez l’acquisition d’images accompagnée de la stimulation et de la perfusion synchronisées. Surveillez la simulation et l’échange de solution pendant l’imagerie.
10. Arrêtez la perfusion une fois l’imagerie terminée, retirez la lamelle et nettoyez la chambre d’imagerie pour le prochain essai.

4. Quantification du trafic membranaire par une modification de la fluorescence ND6

1. Sauvegardez et/ou faites une copie électronique de tous les fichiers image.
2. Choisissez un programme d’analyse pour l’extraction de données, par exemple un logiciel d’analyse d’images open source tel que ImageJ²⁴ et/ou FIJI²⁵.
3. Ouvrez ou importez une pile d’images dans le programme d’analyse.
4. Définissez la première image comme référence et alignez le reste sur celle-ci à l’aide de fonctions/plugins tels que Rigid Registration²⁶, qui atténuera les artefacts dus à la dérive xy. Reportez-vous à la figure 8 pour des exemples d’images.
5. Faites la moyenne de toutes les images acquises au cours des 30 secondes précédant la ligne de base pour produire une image de référence. Enregistrez une copie de cette image pour référence future.
6. Définissez le seuil d’intensité pour générer une image binaire à partir de l’image moyenne de base.
7. Utilisez Watershed dans ImageJ ou des fonctions similaires dans un autre programme pour séparer les neurites ou les cellules connectées.
8. Utilisez la fonction Analyser les particules avec la taille de zone et la circularité appropriées pour solliciter des régions d’intérêt correspondant aux membranes cellulaires, aux endosomes, aux lysosomes ou aux boutons synaptiques. Enregistrez tous les retours sur investissement sélectionnés.
9. Sélectionnez quatre zones d’intérêt d’arrière-plan dans des régions sans cellule dans le champ de vision.
10. Mesurez l’intensité moyenne des pixels pour chaque retour sur investissement dans chaque image de la pile d’images et exportez les résultats pour une analyse statistique.
11. Calculez l’intensité moyenne des ROI d’arrière-plan comme bruit de base, qui sera soustrait des intensités moyennes des pixels pour chaque ROI.
12. Faites la moyenne des trois intensités moyennes les plus élevées pour chaque retour sur investissement sélectionné lors de l’application de la solution de pH 5,5 Tyrode pour obtenir l’intensité de fluorescence maximale, définie à 100 % pour la normalisation.
13. Faites la moyenne des trois intensités moyennes les plus basses pour chaque retour sur investissement sélectionné lors de l’application de 50 mM NH₄Cl pour définir l’intensité de fluorescence minimale, définie à 0 % pour la normalisation.
14. Calculez les changements de fluorescence relatifs pour chaque retour sur investissement en fonction de ses propres intensités de 0 % et 100 %. Dérivez les changements de fluorescence moyens, la cinétique des changements et d’autres valeurs/graphiques à partir des données de retour sur investissement individuelles.

Résultats

Les SV sont spécialisés dans la libération de neurotransmetteurs via l’exocytose/endocytose^{évoquée 27}. Les SV ont une lumière très acide (c’est-à-dire pH 5,5), ce qui est idéal pour le ND6. Nous avons utilisé une stimulation K⁺ élevée pour évoquer l’exo-/endocytose SV afin de permettre à ND6 d’accéder à SV. Comme on pouvait s’y attendre, des ponctuations fluorescentes vert vif le long des processus neuronaux sont apparues après la charge (...

Discussion

Les colorants à base de lipides, tels que le 1,1′-dioctadécyl-3,3,3′,3′-tétraméthylindocarbocyanine (DiI) et le perchlorate de 3,3′-dioctadécyloxacarbocyanine (DiO), sont utilisés depuis longtemps pour illustrer la morphologie cellulaire et suivre les processus cellulaires tels que les projections axonales des neurones. Les colorants styryliques, tels que FM1-43, ont été inventés et utilisés avec succès pour l’étude de l’exocytose³⁴. En raison de leur faible affinité membr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digidata 1440A Data Acquistion System	Molecular Devices	Digidata 1440A	For synchronized stimulation and solution exchange
Dual Channel Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B	For live-cell imaging
Fetal Bovine Serum	OMEGA Scientific	FB-01	For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera	Hamamatsu Inc.	C13440-20CU	high-sensitivity camera
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma	H6648	For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Heated Platform	Warner Instruments	PH-1	For live-cell imaging
Matrigel	BD Biosciences	354234	For tissue culture
Micro-G Vibration Isolation Table	TMC	63-564	For live-cell imaging
Micro-manager	https://micro-manager.org/	NA	For image acquisition control
Multi-Line In-Line Solution Heater	Warner Instruments	SHM-6	For live-cell imaging
Neurobasal Plus Medium	THermoFisher Scientific	A3582901	For tissue culture
Nikon Ti-E Inverted Microscope	Nikon	Ti-E/B	For live-cell imaging
ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera	Hamamatsu	C1340-20CU	For live-cell imaging
Perfusion Chamber	Warner Instruments	RC-26G	For live-cell imaging
Six-Channel Valve Control Perfusion System	Warner Instruments	VC-6	For solution exchange
Square Pulse Stimulator	Grass Instrument	SD9	For electric field stimulation