Messung des Membranlipidumsatzes mit dem pH-empfindlichen Fluoreszenz-Lipid-Analogon ND6

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine Fluoreszenzbildgebungsmethode vor, die eine Klasse von pH-empfindlichen Lipidfluorophoren verwendet, um den Lipidmembrantransport während der Zellexozytose und des Endozytosezyklus zu überwachen.

Zusammenfassung

Die Exo-/Endozytose ist ein gängiger Prozess, der den Austausch von Biomolekülen zwischen Zellen und ihrer Umgebung sowie zwischen verschiedenen Zellen vermittelt. Spezialisierte Zellen nutzen diesen Prozess, um lebenswichtige Körperfunktionen wie die Insulinsekretion von β Zellen und die Freisetzung von Neurotransmittern aus chemischen Synapsen auszuführen. Aufgrund ihrer physiologischen Bedeutung ist die Exo-/Endozytose eines der am meisten untersuchten Themen in der Zellbiologie. Es wurden viele Werkzeuge entwickelt, um diesen Prozess auf Gen- und Proteinebene zu untersuchen, weshalb viel über die an diesem Prozess beteiligte Proteinmaschinerie bekannt ist. Es wurden jedoch nur sehr wenige Methoden entwickelt, um den Membranlipidumsatz zu messen, der die physikalische Grundlage der Exo-/Endozytose ist.

In dieser Arbeit wird eine Klasse neuer fluoreszierender Lipidanaloga vorgestellt, die eine pH-abhängige Fluoreszenz aufweisen, und ihre Verwendung zur Verfolgung des Lipidrecyclings zwischen der Plasmamembran und den sekretorischen Vesikeln demonstriert. Mit Hilfe einfacher pH-Manipulationen ermöglichen diese Analoga auch die Quantifizierung der Lipidverteilung über die Oberfläche und die intrazellulären Membrankompartimente sowie die Messung der Lipidumsatzrate während der Exo-/Endozytose. Diese neuartigen Lipidreporter werden für verschiedene biologische Forschungsbereiche wie Zellbiologie und Neurowissenschaften von großem Interesse sein.

Einleitung

Die Lipiddoppelschicht ist eine der häufigsten Biomolekül-Anordnungen und für alle Zellen unverzichtbar. Außerhalb der Zellen bildet es die Plasmamembran, die Zellen und ihre Umgebung miteinander verbindet; In Zellen unterteilt es verschiedene Organellen, die auf bestimmte Funktionalitäten spezialisiert sind. Lipidmembranen sind eher dynamisch als still und erfahren ständig Fusion und Spaltung, die den Transport von Biomaterial, die Organellenreform, die Morphologieänderung und die zelluläre Kommunikation vermittelt. Zweifellos ist die Lipidmembran die physikalische Grundlage für fast alle zellulären Prozesse, und ihre Funktionsstörung spielt eine entscheidende Rolle bei verschiedenen Erkrankungen von Krebs¹ bis Alzheimer². Obwohl Lipidmoleküle weit weniger vielfältig sind als Proteine, war die Membranforschung bisher hauptsächlich proteinzentriert. Zum Beispiel ist viel mehr über die Proteinmaschinerie als über Lipide in der Exozytose^{bekannt 3,4,5}. Darüber hinaus sind die Organisation, Verteilung, Dynamik und Homöostase von Lipiden über Oberflächen- und intrazelluläre Membranen im Vergleich zu Membranproteinen weitgehend unerforscht⁶.

Dies ist nicht verwunderlich, da moderne molekularbiologische Techniken wie die Mutagenese einen methodischen Vorteil für die Untersuchung von Proteinen anstelle von Lipiden bieten. Beispielsweise erleichtert die transgene Markierung von pH-empfindlichem grün fluoreszierendem Protein (auch bekannt als pHluorin) an vesikuläre Proteine die quantitative Messung der Menge und Geschwindigkeit des vesikulären Proteinumsatzes während der Exo-/Endozytose ^7,8,9. Es ist jedoch fast unmöglich, Membranlipide in vivo genetisch zu verändern. Darüber hinaus sind qualitative und sogar quantitative Manipulationen von Proteinmengen und -verteilungen viel praktikabler als die von Lipiden¹⁰. Dennoch wurden native und synthetische fluoreszierende Lipide isoliert und entwickelt, um endogene Membranlipide in vitro und in vivo zu simulieren ¹¹. Eine Gruppe weit verbreiteter fluoreszierender Lipide sind Styrylfarbstoffe, z. B. FM1-43, die membranverstärkte Fluoreszenz aufweisen und ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Freisetzung synaptischer Vesikel (SV) in Neuronen sind¹². In letzter Zeit wurden umweltempfindliche Lipidfarbstoffe erfunden und als neue Klasse von Reportern verwendet, um verschiedene Zellmembraneigenschaften zu untersuchen, einschließlich Membranpotential¹¹, Phasenordnung¹³ und Sekretion¹⁴.

Eine neue Klasse von Lipidmimetika, deren Fluoreszenz sowohl pH-sensitiv (z.B. pHluorin) als auch membransensitiv (z.B. FM1-43) ist, wurde entwickelt, um die Lipidverteilung in der Plasmamembran und den Endosomen/Lysosomen sowie den Lipidverkehr während der Exo-/Endozytose direkt zu messen. Zu diesem Zweck wurden die bekannten solvatochromen Fluorophore ausgewählt, die aufgrund des intramolekularen Ladungstransfers Push-Pull-Eigenschaften aufweisen. Unter den bestehenden solvatochromen Fluorophoren ist das 1,8-Naphthalimid (ND)-Gerüst relativ leicht zu modifizieren, vielseitig für die Markierung und einzigartig in der Photophysik¹⁵ und wurde daher in DNA-Interkalatoren, organischen Leuchtdioden und Biomolekülsensoren verwendet 16,17,18.

Durch das Anbringen einer elektronenabgebenden Gruppe an der C4-Position des ND-Gerüsts wird eine Push-Pull-Struktur erzeugt, die durch Umverteilung der Elektronendichte im angeregten Zustand^19,20 zu einem erhöhten Dipolmoment führt. Ein solcher intramolekularer Ladungstransfer erzeugt große Quantenausbeuten und Stokes-Verschiebungen, was zu einer hellen und stabilen Fluoreszenz^{führt 21}. Diese Gruppe hat kürzlich eine Reihe von solvatochromen Lipidanaloga auf der Grundlage des ND-Gerüsts entwickelt und sie mit guten synthetischen Ausbeuten^{erhalten 20}.

Die spektroskopische Charakterisierung zeigt, dass ND6 unter diesen Produkten die besten Fluoreszenzeigenschaften besitzt (Abbildung 1)²⁰. Erstens hat es im Vergleich zu gängigen Fluorophoren wie Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder GFP gut getrennte Anregungs- und Emissionspeaks (d. h. ~400 nm bzw. ~520 nm in Abbildung 2A, B), wodurch es spektral von ihnen getrennt werden kann und daher für die mehrfarbige Bildgebung nützlich ist. Zweitens weist die ND6-Fluoreszenz in Gegenwart von Mizellen einen mehr als achtfachen Anstieg ihrer Fluoreszenz auf (Abbildung 2C), was auf eine starke Membranabhängigkeit hindeutet. Frühere Fluoreszenz-Bildgebungsstudien mit verschiedenen Zelltypen zeigten eine hervorragende Membranfärbung durch ND6²⁰. Drittens, wenn der pH-Wert der Lösung von 7,5 (häufig in extrazellulären oder zytosolischen Umgebungen zu finden) auf 5,5 (häufig in Endosomen und Lysosomen zu finden) gesenkt wird, zeigt ND6 einen etwa zweifachen Anstieg der Fluoreszenz (Abbildung 2D), was seine pH-Empfindlichkeit zeigt. Darüber hinaus zeigt die Molekulardynamik-Simulation, dass sich ND6 leicht in die Lipiddoppelschicht integriert, wobei sein ND-Gerüst aus der Membran und dem Piperazinrest herausragt und starke Wechselwirkungen mit Phospholipidkopfgruppen zeigt (Abbildung 3). Insgesamt machen diese Eigenschaften ND6 zu einem idealen fluoreszierenden Lipidanalogon zur Visualisierung und Messung des Membranlipidumsatzes während der Exo-/Endozytose.

In dieser Arbeit wird eine Methode zur Untersuchung der Umsatzrate und Dynamik von SV-Lipiden unter Verwendung kultivierter Maus-Hippocampus-Neuronen vorgestellt. Durch die Stimulation von Neuronen mit hohen K⁺-Tyrode-Lösungen wurden SVs und die Plasmamembran mit ND6 beladen (Abbildung 4A,B). Anschließend wurden die Neuronen mit verschiedenen Stimuli restimuliert, gefolgt von NH₄Cl-haltigen und pH 5,5 Tyrode-Lösungen (Abbildung 4D). Dieses Protokoll erleichtert die quantitative Messung der zusammengestellten Exozytose- und Endozytoseraten unter verschiedenen Umständen (Abbildung 4C).

Protokoll

Das folgende Protokoll enthält (1) ein vereinfachtes Verfahren zur Etablierung von Hippocampus- und Kortikalkulturen der Maus auf der Grundlage eines etablierten Protokolls²², (2) eine kurze Einführung in einen Epifluoreszenzmikroskop-Aufbau für lebende Neuronen, (3) eine detaillierte Beschreibung der Beladung und Abbildung von ND6 in Mausneuronen, (4) eine Diskussion über die Quantifizierung des Membrantransports durch ND6-Signal. Alle Verfahren folgen den Biosicherheits- und IACUC-Richtlinien der Florida Atlantic University. Die Synthese von ND6 wurde bereits beschrieben²⁰.

1. Präparation von Hippocampus- und Kortikalkulturen der Maus

HINWEIS: Wenn nicht anders angegeben, müssen alle Schritte in einer Laminar-Flow-Haube der Biosicherheitsstufe 2 durchgeführt werden. Sterilisieren Sie alle Werkzeuge und Materialien.

1. Verwenden Sie eine Pinzette der Größe 5, um Glasdeckgläser in Multiwell-Kulturplatten zu legen.
   HINWEIS: Eine 24-Well-Platte ist beispielsweise ideal für 12-mm-Deckgläser .
2. Fügen Sie das entsprechende Volumen an extrazellulären Matrizen hinzu, um die Zellkulturoberfläche zu beschichten (z. B. 75 μl Basalmembranmatrixlösung pro 12 mm Deckglas; siehe Materialtabelle)
3. Legen Sie die vorbereiteten Platten für 1-4 Stunden in den Gewebekultur-Inkubator (5 % CO₂, 100 % Luftfeuchtigkeit und 37 °C), um die Vernetzung der Basalmembranmatrix zu ermöglichen.
4. Opfern Sie die Tiere, öffnen Sie den Schädel und geben Sie das gesamte Gehirn in eine 35-mm-Petrischale mit 3 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), die 20% fötales Rinderserum (H+20) enthält. Schneiden Sie das Gehirn entlang der Mittellinie und trennen Sie die Kortexe und Hippocampi in einer Laminar-Flow-Dissektionshaube, um die Kontamination zu reduzieren.
5. Schneiden Sie das Gewebe mit einer Mikroschere in kleine Stücke (~1 mm³). Übertragen Sie diese Gewebe in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 5 ml H+20.
6. Waschen Sie die Tücher dreimal mit 5 ml H+20 und dreimal mit 5 ml HBSS.
7. 1,5 ml 1% Trypsin mit Ethylendiamintetraessigsäure zugeben und 10 Minuten lang bei 37 °C für den Enzymaufschluss inkubieren.
8. Wiederholen Sie Schritt 1.6 und verwenden Sie am Ende Vakuum, um HBSS abzusaugen.
9. Dissoziieren Sie das Gewebe mechanisch in 1 ml HBSS mit 2,95 g/l MgSO₄•7H₂O mit einer feuerpolierten Glaspipette.
10. Die Zellsuspension bei 400 × g, 4 °C 5 min zentrifugieren.
11. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen von Kulturmedien, um eine Konzentration von ~10.000.000 Zellen/ml zu erhalten.
12. Plattieren Sie die Zellen mit ~1.000.000 Zellen/^cm2 und legen Sie die Kultur für 1-4 Stunden in den Inkubator (5 % CO₂, 100 % Luftfeuchtigkeit und 37 °C), um die Zellanhaftung an die Glasdeckgläser zu erleichtern.
13. Fügen Sie ein geeignetes Volumen des Kulturmediums hinzu (z. B. 1 ml pro Vertiefung für eine 24-Well-Platte). Fügen Sie nach 1 Woche das gleiche Volumen des Nährmediums hinzu. Ersetzen Sie nach 2 Wochen jede Woche die Hälfte des vorhandenen Nährmediums durch frisches Medium.

2. Mikroskopaufbau für die Fluoreszenzbildgebung lebender Zellen

HINWEIS: Ein beispielhafter Bildgebungsaufbau (Abbildung 5) umfasst mindestens ein inverses Fluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle), eine Fluoreszenzlichtquelle mit automatischem Verschluss, Fluoreszenzfiltersätze (z. B. für die Bildgebung von ND6 verwenden Sie 405/10 BP für die Anregung, 495 LP für dichroitische und 510/20 BP für die Emission) und eine hochempfindliche Kamera (Materialtabelle), die alle von einer Bilderfassungssoftware (Materialtabelle) gesteuert werden.

1. Bereiten Sie eine Bildgebungskammer vor, die eine Temperaturregelung und einen Ein-/Ausgang der Lösung für die Fluoreszenzbildgebung lebender Zellen ermöglicht.
   HINWEIS: In diesem Protokoll wurde beispielsweise eine modifizierte Bildgebungskammer mit offenem Bad verwendet, die auf einer Heizplattform befestigt ist (Abbildung 6).
2. Richten Sie ein programmierbares Gerät ein, um die Perfusionslösungen umzuschalten und den elektrischen Stimulus zu definierten Zeitpunkten während der Bildgebung abzugeben.
   HINWEIS: Für quantitative Analysen ist eine Hardware- und Softwaresynchronisierung erforderlich (Abbildung 7). In diesem Protokoll wurde beispielsweise ein Triggerausgang der Bildkamera verwendet, um ein Computerprogramm zu starten, das eine automatische Schaltvorrichtung steuert, die ein Mehrkanal-Perfusionssystem und einen Rechteckpulsstimulator steuert.
3. Um zwei oder mehr Fluoreszenzreporter gemeinsam abzubilden, führen Sie eine Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebung durch, indem Sie entweder nacheinander die Filtersätze wechseln oder gleichzeitig verschiedene Fluoreszenzemissionen aufteilen und auf dieselbe Kamera projizieren.

3. Laden und Imaging von ND6 in neuronalen Kulturen

1. Wiegen Sie eine angemessene Menge ND6 ab, lösen Sie es in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf und lassen Sie es bei Raumtemperatur löslich werden. kurz beschallen (z. B. 3 min). Filtrieren Sie die Rohstammlösung mit einem 0,22-μm-Filter, um große Farbstoffaggregate zu entfernen. Nach der Filtration wird die Farbstoffkonzentration durch Absorptionsspektroskopie bei 405 nm mit einem herkömmlichen oder Mikrovolumen-Spektrophotometer mit ε = 10.700 ^{M-1 cm-1} bestimmt.
2. Vor der Anwendung die Stammlösung mit der Badlösung auf eine Konzentration von 1 μM verdünnen. Bewahren Sie die Stammlösung bei Raumtemperatur im Dunkeln auf.
3. Markierung von Endosomen und synaptischen Vesikeln
   1. Um endozytierte Membrankompartimente wie Endosomen ubiquitär zu markieren, geben Sie ND6-Stammlösung (z. B. 1 mM in DMSO) in der Endkonzentration von 1 μM in das Kulturmedium und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 5 % CO₂, 100 % Luftfeuchtigkeit und 37 °C. Um das Ausmaß der SV-Markierung zu reduzieren, unterdrücken Sie die spontane neuronale Aktivität pharmakologisch. Verwenden Sie beispielsweise Tetrodotoxin, um Aktionspotentiale zu blockieren, oder 2,3-Dioxo-6-nitro-1,2,3,4-tetrahydrobenzo[f]chinoxalin-7-sulfonamid (NBQX) und D-(-)-2-amino-5-phosphonopentansäure (D-AP5), um die exzitatorische Übertragung^{zu hemmen 23}.
   2. Um SVs selektiv zu markieren, verwenden Sie eine kurze, aber starke Stimulation, um präsynaptische Exo-/Endozytose hervorzurufen. Zuerst werden die Kulturdeckgläser in eine 35-mm-Petrischale mit 2 ml normaler Tyrode-Lösung bei Raumtemperatur gegeben. Zweitens wird die ND6-Stammlösung in der Tyrodelösung mit hohem K⁺ -Gehalt (90 mM KCl) auf die Endkonzentration von 1 μM verdünnt. Drittens ersetzen Sie die normale Tyrode-Lösung in der Petrischale durch ND6-haltige High-K⁺ -Tyrode-Lösung und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang bei Raumtemperatur.
4. Die ND6-markierte Zellkultur wird in die Bildgebungskammer überführt, die mit vorgewärmter normaler Tyrode-Lösung gefüllt ist, die 10 μM NBQX und 10 μM D-AP5 enthält.
5. Stellen Sie die Perfusionsgeschwindigkeit auf ~0,2 ml/s (d. h. 1 Tropfen pro Sekunde) ein und beginnen Sie mit der Perfusion der vorgewärmten normalen Tyrode-Lösung, die NBQX und D-AP5 enthält, um überschüssiges ND6 in der Kultur zu entfernen.
6. Passen Sie den Fokus an und suchen Sie das entsprechende Sichtfeld mit gesunden und gut verteilten Neuronen, die verbundene Neuriten tragen. Vermeiden Sie Bereiche mit ungelösten Farbstoffkolloiden.
7. Versuchen Sie, ND6-beladene Zellen mit unterschiedlichen Belichtungszeiten zu fotografieren, um die besten Bildgebungseinstellungen zu ermitteln.
   HINWEIS: Für die beste Belichtungszeit beträgt die höchste Pixelfluoreszenzintensität im resultierenden Bild etwa die Hälfte des Bitbereichs (z. B. für ein 16-Bit-Bild liegt der Bitbereich zwischen 0 und 65.535), was eine weitere Erhöhung der Fluoreszenz ermöglicht, wenn die saure Badlösung aufgetragen wird. Die gewählte Belichtungszeit sollte für alle ND6-Aufnahmen verwendet werden.
8. Richten Sie das Stimulations- und Perfusionsprotokoll, das Bildintervall und die Gesamtdauer ein. Verwenden Sie im folgenden Protokoll beispielsweise eine 30 s Basislinie, eine 10 s 30 Hz elektrische Feldstimulation, 50 s Erholung, 120 s 90 mM K⁺, 60 s Erholung, 60 s Tyrode-Lösung mit 50 mM NH₄Cl, 60 s Tyrode-Lösung bei pH 5,5 und ein Frame-Intervall von 3 s.
9. Starten Sie die Bildaufnahme begleitet von der synchronisierten Stimulation und Perfusion. Überwachen Sie die Simulation und den Lösungsaustausch während der Bildgebung.
10. Stoppen Sie die Perfusion nach Beendigung der Bildgebung, entfernen Sie das Deckglas und reinigen Sie die Bildgebungskammer für den nächsten Versuch.

4. Quantifizierung des Membrantransports durch eine Änderung der ND6-Fluoreszenz

1. Sichern und/oder erstellen Sie eine elektronische Kopie aller Bilddateien.
2. Wählen Sie ein Analyseprogramm für die Datenextraktion, z. B. eine Open-Source-Bildanalysesoftware wie ImageJ²⁴ und/oder FIJI²⁵.
3. Öffnen oder importieren Sie einen Bildstapel in das Analyseprogramm.
4. Legen Sie das erste Bild als Referenz fest und richten Sie den Rest mit Funktionen/Plugins wie Rigid Registration²⁶ daran aus, wodurch Artefakte aufgrund von xy-Drifting gemildert werden. In Abbildung 8 finden Sie Beispielbilder.
5. Mittelung aller Bilder, die während der 30 Sekunden vor der Baseline aufgenommen wurden, um ein Referenzbild zu erstellen. Speichern Sie eine Kopie dieses Bildes zum späteren Nachschlagen.
6. Legen Sie den Intensitätsschwellenwert fest, um ein binäres Bild aus dem gemittelten Basislinienbild zu generieren.
7. Verwenden Sie Watershed in ImageJ oder ähnliche Funktionen in einem anderen Programm, um Verbindungsneuriten oder Zellen zu trennen.
8. Verwenden Sie die Funktion Partikel analysieren mit geeigneter Flächengröße und Zirkularität, um ROIs (Regions of Interest) anzufordern, die Zellmembranen, Endosomen, Lysosomen oder synaptischen Boutons entsprechen. Speichern Sie alle ausgewählten ROIs.
9. Wählen Sie vier Hintergrund-ROIs in zellenfreien Bereichen innerhalb des Sichtfelds aus.
10. Messen Sie die durchschnittliche Pixelintensität für jeden ROI in jedem Frame des Bildstapels und exportieren Sie die Ergebnisse für statistische Analysen.
11. Berechnen Sie die mittlere Intensität der Hintergrund-ROIs als Basisrauschen, das von den durchschnittlichen Pixelintensitäten für jeden ROI subtrahiert wird.
12. Mittelung der drei höchsten durchschnittlichen Intensitäten für jeden ausgewählten ROI während der Anwendung der pH 5,5 Tyrode-Lösung, um die maximale Fluoreszenzintensität zu erhalten, die für die Normalisierung als 100% definiert ist.
13. Mittelung der drei niedrigsten durchschnittlichen Intensitäten für jeden ausgewählten ROI während der Anwendung von 50 mM NH₄Cl, um die minimale Fluoreszenzintensität festzulegen, die für die Normalisierung als 0 % definiert ist.
14. Berechnen Sie die relativen Fluoreszenzänderungen für jeden ROI basierend auf seinen eigenen 0 % und 100 % Intensitäten. Ableiten von mittleren Fluoreszenzänderungen, Änderungskinetiken und anderen Werten/Diagrammen aus einzelnen ROI-Daten.

Ergebnisse

SVs sind auf die Freisetzung von Neurotransmittern über evozierte Exo-/Endozytose^{spezialisiert 27}. SVs haben ein stark saures Lumen (d. h. pH 5,5), was ideal für ND6 ist. Wir verwendeten eine hohe K⁺ -Stimulation, um SV-Exo-/Endozytose hervorzurufen, um ND6 den Zugang zu SV zu ermöglichen. Erwartungsgemäß zeigten sich nach dem Laden hellgrün fluoreszierende Punkte entlang neuronaler Prozesse (Abbildung 9A). Das in Abbildung 4B gezeigt...

Diskussion

Farbstoffe auf Lipidbasis wie 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanin (DiI) und 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat (DiO) werden seit langem verwendet, um die Zellmorphologie zu veranschaulichen und zelluläre Prozesse wie die Axonprojektionen von Neuronen zu verfolgen. Styrylfarbstoffe wie FM1-43 wurden erfunden und erfolgreich zur Untersuchung der Exozytose^{eingesetzt 34}. Aufgrund ihrer geringen Membranaffinität markieren sie selektiv endozytierte Vesikel, wo sie einge...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digidata 1440A Data Acquistion System	Molecular Devices	Digidata 1440A	For synchronized stimulation and solution exchange
Dual Channel Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B	For live-cell imaging
Fetal Bovine Serum	OMEGA Scientific	FB-01	For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera	Hamamatsu Inc.	C13440-20CU	high-sensitivity camera
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma	H6648	For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Heated Platform	Warner Instruments	PH-1	For live-cell imaging
Matrigel	BD Biosciences	354234	For tissue culture
Micro-G Vibration Isolation Table	TMC	63-564	For live-cell imaging
Micro-manager	https://micro-manager.org/	NA	For image acquisition control
Multi-Line In-Line Solution Heater	Warner Instruments	SHM-6	For live-cell imaging
Neurobasal Plus Medium	THermoFisher Scientific	A3582901	For tissue culture
Nikon Ti-E Inverted Microscope	Nikon	Ti-E/B	For live-cell imaging
ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera	Hamamatsu	C1340-20CU	For live-cell imaging
Perfusion Chamber	Warner Instruments	RC-26G	For live-cell imaging
Six-Channel Valve Control Perfusion System	Warner Instruments	VC-6	For solution exchange
Square Pulse Stimulator	Grass Instrument	SD9	For electric field stimulation