pH에 민감한 형광 지질 아날로그 ND6를 사용한 막 지질 회전율 측정

요약

이 프로토콜은 세포 엑소사이토시스(exocytosis) 및 세포내이입(endocytosis) 주기 동안 지질 막 이동을 모니터링하기 위해 pH에 민감한 지질 형광단 클래스를 사용하는 형광 이미징 방법을 제시합니다.

초록

엑소/엔도사이토시스(exo-/endocytosis)는 세포와 환경 사이 및 서로 다른 세포 간의 생체 분자 교환을 매개하는 일반적인 과정입니다. 특수 세포는 이 과정을 사용하여 β 세포에서 인슐린 분비 및 화학 시냅스에서 신경 전달 물질 방출과 같은 중요한 신체 기능을 수행합니다. 생리학적 중요성으로 인해 외포/세포내이입은 세포 생물학에서 가장 많이 연구되는 주제 중 하나입니다. 유전자 및 단백질 수준에서 이 과정을 연구하기 위해 많은 도구가 개발되었으며, 그 때문에 이 과정에 참여하는 단백질 기계에 대해 많이 알려져 있습니다. 그러나 세포막의 지질 회전율을 측정하기 위한 방법은 거의 개발되지 않았으며, 이는 엑소/내포작용의 물리적 기초입니다.

이 논문은 pH 의존성 형광을 나타내는 새로운 형광 지질 유사체 클래스를 소개하고 원형질막과 분비 소포 사이의 지질 재활용을 추적하는 데 사용하는 방법을 보여줍니다. 간단한 pH 조작을 통해 이러한 유사체는 표면과 세포내 막 구획에 걸친 지질 분포를 정량화할 수 있을 뿐만 아니라 엑소/내포작용 중 지질 회전율을 측정할 수 있습니다. 이 새로운 지질 리포터는 세포 생물학 및 신경 과학과 같은 다양한 생물학 연구 분야에 큰 관심을 가질 것입니다.

서문

지질 이중층은 가장 일반적인 생체 분자 어셈블리 중 하나이며 모든 세포에 없어서는 안될 필수 요소입니다. 세포 외부에서는 세포와 그 환경을 연결하는 원형질막을 형성합니다. 세포 내부에서는 지정된 기능에 특화된 다양한 세포 기관을 구획화합니다. 지질막은 정지된 상태라기보다는 역동적인 융합과 핵분열을 지속적으로 경험하며, 이는 생체 물질 수송, 세포 기관 개혁, 형태 변화 및 세포 통신을 매개합니다. 의심할 여지 없이, 지질막은 거의 모든 세포 과정의 물리적 토대이며, 지질막의 기능 장애는 암¹에서 알츠하이머병²에 이르는 다양한 질환에서 중요한 역할을 한다. 지질 분자는 단백질보다 훨씬 덜 다양하지만, 지금까지의 막 연구는 주로 단백질 중심이었습니다. 예를 들어, 엑소사이토시스(exocytosis) ^3,4,5에서 지질에 대해 알려진 것보다 단백질 기계에 대해 훨씬 더 많이 알려져 있습니다. 더욱이, 표면 및 세포내 막에 걸친 지질의 조직, 분포, 역학 및 항상성은 막 단백질에 비해 대부분 미연구로 남아 있습니다⁶.

돌연변이 유발과 같은 현대 분자 생물학 기술이 지질이 아닌 단백질을 연구하기 위한 방법론적 이점을 제공하기 때문에 이는 놀라운 일이 아닙니다. 예를 들어, 소포성 단백질에 대한 pH 민감성 녹색 형광 단백질(일명 pHluorin)의 형질전환 태깅은 엑소/세포내이입 중 소포성 단백질 회전율의 양과 속도의 정량적 측정을 용이하게 합니다 ^7,8,9. 그러나 생체 내에서 막 지질을 유전적으로 변형하는 것은 거의 불가능합니다. 더욱이, 단백질의 양과 분포에 대한 정성적 및 정량적 조작은 지질의 그것보다 훨씬 더 실현 가능하다¹⁰. 그럼에도 불구하고, native 및 synthetic fluorescent lipids는 in vitro 및 in vivo¹¹에서 내인성 막 지질을 시뮬레이션하기 위해 분리되고 개발되었다. 널리 사용되는 형광 지질의 한 그룹은 스티릴 염료(예: FM1-43)로, 이는 막-강화 형광을 나타내며 뉴런의 시냅스 소포(SV) 방출을 연구하는 데 강력한 도구이다¹². 최근에는 환경에 민감한 지질 염료가 발명되어 막 전위^{(membrane potential)11}, 위상 순서(^{phase order) 13}, 분비(^{secretion) 14} 등 다양한 세포막 특성을 연구하는 새로운 부류의 리포터로 널리 사용되고 있습니다.

형광이 pH에 민감한(예: pHluorin) 및 막에 민감한(예: FM1-43) 새로운 종류의 지질 모방체가 개발되어 원형질막과 엔도솜/리소좀의 지질 분포와 엑소/엔도사이토시스 중 지질 트래픽을 직접 측정할 수 있습니다. 이를 위해 분자 내 전하 전달로 인해 푸시-풀 특성을 나타내는 잘 알려진 solvatochromic fluorophore가 선택되었습니다. 현존하는 solvatochromic fluorophores 중에서, 1,8-naphthalimide (ND) 스캐폴드는 비교적 수정하기 쉽고, 태깅에 다재다능하며, 광물리학¹⁵에서 유일하며, 따라서 DNA intercalator, 유기 발광 다이오드 및 생체 분자 센서^(16,17,18)에 사용되어 왔다.

전자 공여기를 ND 스캐폴드의 C4 위치에 부착하면 푸시-풀 구조가 생성되며, 이는 여기 상태^19,20에서 전자 밀도를 재분배하여 쌍극자 모멘트를 증가시킵니다. 이러한 분자 내 전하 전달은 큰 양자 수율과 스톡스 이동을 생성하여 밝고 안정적인 형광²¹을 생성합니다. 이 그룹은 최근 ND 스캐폴드를 기반으로 한 일련의 solvatochromic 지질 유사체를 개발하여 우수한 합성 수율²⁰으로 얻었습니다.

분광 특성 분석은 이러한 제품 중에서 ND6가 최고의 형광 특성을 가지고 있음을 보여줍니다(그림 1)²⁰. 첫째, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 GFP와 같은 인기 있는 형광단에 비해 잘 분리된 여기 및 방출 피크(즉, 그림 2A,B에서 각각 ~400nm 및 ~520nm)를 가지므로 스펙트럼으로 분리할 수 있어 다색 이미징에 유용합니다. 둘째, ND6 형광은 미셀이 있을 때 형광이 8배 이상 증가하며(그림 2C), 이는 강력한 막 의존성을 시사합니다. 다양한 유형의 세포를 사용한 이전의 살아있는 세포 형광 이미징 연구는 ND6²⁰에 의한 우수한 막 염색을 보여주었습니다. 셋째, 용액의 pH가 7.5(세포외 또는 세포질 환경에서 일반적으로 발견됨)에서 5.5(엔도솜 및 리소좀에서 일반적으로 발견됨)로 감소하면 ND6는 형광이 약 2배 증가하여 pH 민감도를 나타냅니다(그림 2D). 또한 분자 역학 시뮬레이션에 따르면 ND6는 ND 스캐폴드가 멤브레인 바깥쪽을 향하고 피페라진 잔류물이 인지질 헤드 그룹과 강한 상호 작용을 보이는 지질 이중층에 쉽게 통합됩니다(그림 3). 이러한 특징들로 인해 ND6는 엑소/내포작용 중 막 지질 회전율을 시각화하고 측정하는 데 이상적인 형광 지질 유사체입니다.

이 논문은 배양된 쥐 해마 뉴런을 사용하여 SV 지질의 회전율과 역학을 연구하는 방법을 제시합니다. 높은 K⁺ Tyrode의 용액으로 뉴런을 자극함으로써 SV와 원형질막에 ND6가 로드되었습니다(그림 4A,B). 그 후, 뉴런을 다른 자극으로 다시 자극한 후 NH₄Cl 함유 및 pH 5.5 Tyrode 용액을 투여했습니다(그림 4D). 이 프로토콜은 다양한 상황에서 조립된 엑소사이토시스(exocytosis) 및 엔도사이토시스(endocytosis) 속도의 정량적 측정을 용이하게 합니다(그림 4C).

프로토콜

다음 프로토콜에는 (1) 잘 확립된 프로토콜²²에 기초하여 마우스 해마 및 피질 배양을 확립하기 위한 간소화된 절차, (2) 살아있는 뉴런에 대한 epifluorescence 현미경 설정에 대한 간략한 소개, (3) 마우스 뉴런에서 ND6 로딩 및 이미징에 대한 자세한 설명, (4) ND6 신호에 의한 막 이동의 정량화에 대한 논의가 포함됩니다. 모든 절차는 플로리다 애틀랜틱 대학교의 생물 안전 및 IACUC 지침을 따릅니다. ND6의 합성은 앞서²⁰에서 설명하였다.

1. 쥐의 해마 및 피질 배양의 준비

알림: 달리 지정하지 않으면 모든 단계는 생물 안전 레벨 2 층류 후드에서 수행해야 합니다. 모든 도구와 재료를 소독하십시오.

1. 크기 5 집게를 사용하여 멀티웰 배양 플레이트에 유리 커버슬립을 놓습니다.
   참고: 예를 들어, 24웰 플레이트는 12mm 커버슬립에 이상적입니다.
2. 세포 배양 표면을 코팅하기 위해 적절한 부피의 세포외 기질을 추가합니다(예: 12mm 커버슬립당 75μL의 기저막 매트릭스 용액, 재료 표 참조).
3. 준비된 플레이트를 조직 배양 인큐베이터(5% CO₂, 100% 습도 및 37°C)에 1-4시간 동안 놓아 기저막 매트릭스 가교를 허용합니다.
4. 동물을 희생시키고 두개골을 연 다음 20% 소 태아 혈청(H+20)이 함유된 3mL의 행크스 균형 소금 용액(HBSS)이 든 35mm 페트리 접시에 뇌 전체를 옮깁니다. 정중선을 따라 뇌를 자르고 피질과 해마를 층류 해부 후드에서 분리하여 오염을 줄입니다.
5. 마이크로 가위를 사용하여 조직을 작은 조각으로 자릅니다 (~ 1mm³). 이 조직을 5mL의 H+20이 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 옮깁니다.
6. 5mL의 H+20으로 3회, 5mL의 HBSS로 3회 세척합니다.
7. 1.5mL의 1% 트립신과 에틸렌디아민 테트라아세트산을 넣고 효소 분해를 위해 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
8. 1.6단계를 반복하고 진공을 사용하여 마지막에 HBSS를 흡인합니다.
9. 파이어 폴리싱 유리 피펫을 사용하여 2.95g/L MgSO₄•7H₂O를 포함하는 HBSS 1mL에서 조직을 기계적으로 해리합니다.
10. 셀 현탁액을 400× g, 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
11. 상층액을 흡인하고 세포를 적절한 양의 배양 배지에 재현탁시켜 ~10,000,000 cells/ml의 농도를 얻습니다.
12. 세포를 ~1,000,000 cells/^cm2 로 플레이트하고 배양액을 인큐베이터(5% CO₂, 100% 습도 및 37°C)에 1-4시간 동안 두어 유리 커버슬립에 세포를 쉽게 부착할 수 있도록 합니다.
13. 적절한 부피의 배양 배지(예: 24웰 플레이트의 경우 웰당 1mL)를 추가합니다. 1주일 후에 같은 양의 배양액을 추가합니다. 2주 후에는 매주 기존 배양 배지의 절반을 새로운 배지로 교체합니다.

2. 살아있는 세포 형광 이미징을 위한 현미경 설정

참고: 예시적인 이미징 설정(그림 5)에는 적어도 도립 형광 현미경( 재료 표 참조), 자동 셔터가 있는 형광 광원, 형광 필터 세트(예: ND6 이미징의 경우 여기의 경우 405/10 BP, 이색성의 경우 495 LP, 방출의 경우 510/20 BP 사용) 및 고감도 카메라(재료 표)가 포함되며, 이 모든 것은 이미지 획득 소프트웨어(재료 표)에 의해 제어됩니다.

1. 살아있는 세포 형광 이미징을 위한 온도 제어 및 용액 입출력이 가능한 이미징 챔버를 준비합니다.
   참고: 예를 들어, 가열 플랫폼에 고정된 수정된 노천탕 이미징 챔버가 이 프로토콜에 사용되었습니다(그림 6).
2. 관류 용액을 전환하고 이미징 중에 정의된 시점에 전기 자극을 전달하도록 프로그래밍 가능한 장치를 설정합니다.
   참고: 하드웨어 및 소프트웨어 동기화는 정량 분석을 위해 필요합니다(그림 7). 예를 들어, 이 프로토콜에서 이미징 카메라에서 출력되는 트리거는 다중 채널 관류 시스템 및 사각 펄스 자극기를 제어하는 자동 스위치 장치를 제어하는 컴퓨터 프로그램을 시작하는 데 사용되었습니다.
3. 두 개 이상의 형광 리포터를 함께 이미징하려면 필터 세트를 순차적으로 전환하거나 서로 다른 형광 방출을 동시에 분할하고 동일한 카메라에 투사하여 다중 채널 형광 이미징을 수행합니다.

3. 신경 세포 배양에서 ND6 로딩 및 이미징

1. 적절한 양의 ND6을 계량하고 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시키고 실온에서 용해되도록 합니다. 짧게(예: 3분) 초음파 처리합니다. 0.22μm 필터를 사용하여 원유 용액을 여과하여 큰 염료 응집체를 제거합니다. 여과 후 ε = 10,700 ^{M-1 cm-1}을 사용하여 기존 분광 광도계를 사용하여 405nm에서 흡수 분광법으로 염료 농도를 측정합니다.
2. 적용하기 전에 수조 용액을 사용하여 원액을 1μM 농도로 희석하십시오. 원액을 어두운 곳에서 실온에 보관하십시오.
3. 엔도솜(endosome)과 시냅스 소포(synaptic vesicles)의 표지
   1. 엔도솜과 같은 세포내이입된 막 구획을 유비쿼터스 라벨링하려면 ND6 원액(예: DMSO의 1mM)을 최종 농도 1μM의 배양 배지에 추가하고 5%_CO2, 100% 습도 및 37°C에서 30분 동안 배양합니다. SV 표지의 범위를 줄이려면 약리학적으로 자발적인 신경 활동을 억제합니다. 예를 들어, 테트로도톡신을 사용하여 활동 전위를 차단하거나 2,3-디옥소-6-니트로-1,2,3,4-테트라하이드로벤조[f]퀴녹살린-7-술폰아미드(NBQX) 및 D-(-)-2-아미노-5-포스포노펜탄산(D-AP5)을 사용하여 흥분성 전달을 억제한다²³.
   2. SV를 선택적으로 라벨링하려면 짧지만 강한 자극을 사용하여 시냅스전 엑소/내포작용을 유발합니다. 먼저, 배양 커버슬립을 실온에서 2mL의 일반 Tyrode 용액이 들어 있는 35mm 페트리 접시에 옮깁니다. 둘째, ND6 원액을 high-K⁺ Tyrode 용액(90mM KCl)에 최종 농도 1μM로 희석합니다. 셋째, 페트리 접시에 담긴 일반 티로이드 용액을 ND6 함유 high-K⁺ 티로이드 용액으로 교체하고 실온에서 2분 동안 배양합니다.
4. ND6 표지된 세포 배양을 10μM NBQX 및 10μM D-AP5가 포함된 예열된 일반 Tyrode 용액으로 채워진 이미징 챔버로 옮깁니다.
5. 관류 속도를 ~0.2mL/s(즉, 초당 1방울)로 조정하고 배양액에서 과도한 ND6를 제거하기 위해 NBQX 및 D-AP5가 포함된 예열된 일반 Tyrode 용액의 관류를 시작합니다.
6. 초점을 조정하고 연결된 신경돌기를 포함하는 건강하고 잘 퍼진 뉴런이 포함된 적절한 시야를 찾습니다. 분리되지 않은 염료 콜로이드가 있는 영역을 피하십시오.
7. 노출 시간이 다른 ND6 로딩 세포를 이미징하여 최상의 이미징 설정을 식별해 보십시오.
   참고: 최상의 노출 시간을 위해 결과 이미지에서 가장 높은 픽셀 형광 강도는 비트 범위의 약 절반(예: 16비트 이미지의 경우 비트 범위는 0에서 65,535까지)이며, 이는 산성 수조 용액을 적용할 때 형광을 더 증가시킬 수 있습니다. 선택한 노출 시간은 모든 ND6 이미징에 사용해야 합니다.
8. 자극 및 관류 프로토콜, 프레임 간격 및 총 지속 시간을 설정합니다. 예를 들어, 다음 프로토콜에서는 30초 기준선, 10초 30Hz 전기장 자극, 50초 회복, 120초 90mM K⁺, 60초 회복, 50mM NH_4Cl이 포함된 60초 Tyrode 용액, pH 5.5에서 60초 Tyrode 용액 및 3초의 프레임 간격을 사용합니다.
9. 동기화된 자극 및 관류와 함께 이미지 획득을 시작합니다. 이미징 중 시뮬레이션 및 솔루션 교환을 모니터링합니다.
10. 이미징이 끝난 후 관류를 중지하고 커버슬립을 제거한 다음 다음 시험을 위해 이미징 챔버를 청소합니다.

4. ND6 형광의 변화에 의한 막 이동의 정량화

1. 모든 이미지 파일의 백업 및/또는 전자 사본을 만듭니다.
2. 데이터 추출을 위한 분석 프로그램(예: ImageJ²⁴ 및/또는 FIJI²⁵와 같은 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어)을 선택합니다.
3. 이미지 스택을 열거나 분석 프로그램으로 가져옵니다.
4. 첫 번째 이미지를 참조로 설정하고 나머지는 Rigid Registration²⁶과 같은 기능/플러그인을 사용하여 정렬하면 xy 드리프트로 인한 아티팩트를 완화할 수 있습니다. 그림 8 참조 예시 이미지.
5. 30초 사전 기준선 동안 획득한 모든 이미지의 평균을 구하여 참조 이미지를 생성합니다. 나중에 참조할 수 있도록 이 이미지의 복사본을 저장합니다.
6. 명암 임계값을 설정하여 기준선 평균 영상에서 이진 영상을 생성합니다.
7. ImageJ의 Watershed 또는 다른 프로그램의 유사한 기능을 사용하여 연결된 신경돌기 또는 세포를 분리합니다.
8. 적절한 면적 크기 및 원형도를 가진 입자 분석 기능을 사용하여 세포막, 엔도솜, 리소좀 또는 시냅스 부톤에 해당하는 관심 영역(ROI)을 요청합니다. 선택한 모든 ROI를 저장합니다.
9. 시야 내의 cell-free 영역에서 4개의 배경 ROI를 선택합니다.
10. 영상 스택의 모든 프레임에서 각 ROI에 대한 평균 픽셀 강도를 측정하고 통계 분석을 위해 결과를 내보냅니다.
11. 배경 ROI의 평균 강도를 기준 잡음으로 계산하고, 이 값은 각 ROI의 평균 픽셀 농도에서 뺍니다.
12. 정규화를 위해 100%로 정의되는 최대 형광 강도를 얻기 위해 pH 5.5 Tyrode 용액을 적용하는 동안 선택한 모든 ROI에 대해 가장 높은 3개의 평균 강도를 평균화합니다.
13. 50mM NH₄Cl을 적용하는 동안 선택한 모든 ROI에 대해 가장 낮은 평균 강도 3개를 평균하여 최소 형광 강도를 설정하며, 이는 정규화의 경우 0%로 정의됩니다.
14. 자체 0% 및 100% 농도를 기준으로 모든 ROI에 대한 상대적 형광 변화를 계산합니다. 개별 ROI 데이터에서 평균 형광 변화, 반응 역학 변화 및 기타 값/플롯을 도출할 수 있습니다.

결과

SV는 유발된 외세포/세포내이입(endocytosis)을 통한 신경전달물질 방출에 특화되어^{있다 27}. SV는 ND6에 이상적인 고산성 루멘(즉, pH 5.5)을 가지고 있습니다. 우리는 ND6가 SV에 접근할 수 있도록 SV exo-/endocytosis를 유발하기 위해 높은 K⁺ 자극을 사용했습니다. 예상대로, 뉴런 과정을 따라 밝은 녹색 형광 반점이 로딩 후에 나타났습니다(그림 9A). 그림 4B...

토론

1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine(DiI) 및 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate(DiO)와 같은 지질 기반 염료는 세포 형태를 설명하고 뉴런의 축삭 돌출과 같은 세포 과정을 추적하는 데 오랫동안 사용되어 왔습니다. FM1-43과 같은 스티릴 염료는 exocytosis³⁴ 연구를 위해 발명되어 성공적으로 사용되었습니다. 막 친화도가 낮기 때문에 세포내이입된 소포가 갇혀 있는 곳에 선택...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digidata 1440A Data Acquistion System	Molecular Devices	Digidata 1440A	For synchronized stimulation and solution exchange
Dual Channel Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B	For live-cell imaging
Fetal Bovine Serum	OMEGA Scientific	FB-01	For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera	Hamamatsu Inc.	C13440-20CU	high-sensitivity camera
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma	H6648	For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Heated Platform	Warner Instruments	PH-1	For live-cell imaging
Matrigel	BD Biosciences	354234	For tissue culture
Micro-G Vibration Isolation Table	TMC	63-564	For live-cell imaging
Micro-manager	https://micro-manager.org/	NA	For image acquisition control
Multi-Line In-Line Solution Heater	Warner Instruments	SHM-6	For live-cell imaging
Neurobasal Plus Medium	THermoFisher Scientific	A3582901	For tissue culture
Nikon Ti-E Inverted Microscope	Nikon	Ti-E/B	For live-cell imaging
ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera	Hamamatsu	C1340-20CU	For live-cell imaging
Perfusion Chamber	Warner Instruments	RC-26G	For live-cell imaging
Six-Channel Valve Control Perfusion System	Warner Instruments	VC-6	For solution exchange
Square Pulse Stimulator	Grass Instrument	SD9	For electric field stimulation