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Method Article
이 프로토콜은 세포 엑소사이토시스(exocytosis) 및 세포내이입(endocytosis) 주기 동안 지질 막 이동을 모니터링하기 위해 pH에 민감한 지질 형광단 클래스를 사용하는 형광 이미징 방법을 제시합니다.
엑소/엔도사이토시스(exo-/endocytosis)는 세포와 환경 사이 및 서로 다른 세포 간의 생체 분자 교환을 매개하는 일반적인 과정입니다. 특수 세포는 이 과정을 사용하여 β 세포에서 인슐린 분비 및 화학 시냅스에서 신경 전달 물질 방출과 같은 중요한 신체 기능을 수행합니다. 생리학적 중요성으로 인해 외포/세포내이입은 세포 생물학에서 가장 많이 연구되는 주제 중 하나입니다. 유전자 및 단백질 수준에서 이 과정을 연구하기 위해 많은 도구가 개발되었으며, 그 때문에 이 과정에 참여하는 단백질 기계에 대해 많이 알려져 있습니다. 그러나 세포막의 지질 회전율을 측정하기 위한 방법은 거의 개발되지 않았으며, 이는 엑소/내포작용의 물리적 기초입니다.
이 논문은 pH 의존성 형광을 나타내는 새로운 형광 지질 유사체 클래스를 소개하고 원형질막과 분비 소포 사이의 지질 재활용을 추적하는 데 사용하는 방법을 보여줍니다. 간단한 pH 조작을 통해 이러한 유사체는 표면과 세포내 막 구획에 걸친 지질 분포를 정량화할 수 있을 뿐만 아니라 엑소/내포작용 중 지질 회전율을 측정할 수 있습니다. 이 새로운 지질 리포터는 세포 생물학 및 신경 과학과 같은 다양한 생물학 연구 분야에 큰 관심을 가질 것입니다.
지질 이중층은 가장 일반적인 생체 분자 어셈블리 중 하나이며 모든 세포에 없어서는 안될 필수 요소입니다. 세포 외부에서는 세포와 그 환경을 연결하는 원형질막을 형성합니다. 세포 내부에서는 지정된 기능에 특화된 다양한 세포 기관을 구획화합니다. 지질막은 정지된 상태라기보다는 역동적인 융합과 핵분열을 지속적으로 경험하며, 이는 생체 물질 수송, 세포 기관 개혁, 형태 변화 및 세포 통신을 매개합니다. 의심할 여지 없이, 지질막은 거의 모든 세포 과정의 물리적 토대이며, 지질막의 기능 장애는 암1에서 알츠하이머병2에 이르는 다양한 질환에서 중요한 역할을 한다. 지질 분자는 단백질보다 훨씬 덜 다양하지만, 지금까지의 막 연구는 주로 단백질 중심이었습니다. 예를 들어, 엑소사이토시스(exocytosis) 3,4,5에서 지질에 대해 알려진 것보다 단백질 기계에 대해 훨씬 더 많이 알려져 있습니다. 더욱이, 표면 및 세포내 막에 걸친 지질의 조직, 분포, 역학 및 항상성은 막 단백질에 비해 대부분 미연구로 남아 있습니다6.
돌연변이 유발과 같은 현대 분자 생물학 기술이 지질이 아닌 단백질을 연구하기 위한 방법론적 이점을 제공하기 때문에 이는 놀라운 일이 아닙니다. 예를 들어, 소포성 단백질에 대한 pH 민감성 녹색 형광 단백질(일명 pHluorin)의 형질전환 태깅은 엑소/세포내이입 중 소포성 단백질 회전율의 양과 속도의 정량적 측정을 용이하게 합니다 7,8,9. 그러나 생체 내에서 막 지질을 유전적으로 변형하는 것은 거의 불가능합니다. 더욱이, 단백질의 양과 분포에 대한 정성적 및 정량적 조작은 지질의 그것보다 훨씬 더 실현 가능하다10. 그럼에도 불구하고, native 및 synthetic fluorescent lipids는 in vitro 및 in vivo11에서 내인성 막 지질을 시뮬레이션하기 위해 분리되고 개발되었다. 널리 사용되는 형광 지질의 한 그룹은 스티릴 염료(예: FM1-43)로, 이는 막-강화 형광을 나타내며 뉴런의 시냅스 소포(SV) 방출을 연구하는 데 강력한 도구이다12. 최근에는 환경에 민감한 지질 염료가 발명되어 막 전위(membrane potential)11, 위상 순서(phase order) 13, 분비(secretion) 14 등 다양한 세포막 특성을 연구하는 새로운 부류의 리포터로 널리 사용되고 있습니다.
형광이 pH에 민감한(예: pHluorin) 및 막에 민감한(예: FM1-43) 새로운 종류의 지질 모방체가 개발되어 원형질막과 엔도솜/리소좀의 지질 분포와 엑소/엔도사이토시스 중 지질 트래픽을 직접 측정할 수 있습니다. 이를 위해 분자 내 전하 전달로 인해 푸시-풀 특성을 나타내는 잘 알려진 solvatochromic fluorophore가 선택되었습니다. 현존하는 solvatochromic fluorophores 중에서, 1,8-naphthalimide (ND) 스캐폴드는 비교적 수정하기 쉽고, 태깅에 다재다능하며, 광물리학15에서 유일하며, 따라서 DNA intercalator, 유기 발광 다이오드 및 생체 분자 센서(16,17,18)에 사용되어 왔다.
전자 공여기를 ND 스캐폴드의 C4 위치에 부착하면 푸시-풀 구조가 생성되며, 이는 여기 상태19,20에서 전자 밀도를 재분배하여 쌍극자 모멘트를 증가시킵니다. 이러한 분자 내 전하 전달은 큰 양자 수율과 스톡스 이동을 생성하여 밝고 안정적인 형광21을 생성합니다. 이 그룹은 최근 ND 스캐폴드를 기반으로 한 일련의 solvatochromic 지질 유사체를 개발하여 우수한 합성 수율20으로 얻었습니다.
분광 특성 분석은 이러한 제품 중에서 ND6가 최고의 형광 특성을 가지고 있음을 보여줍니다(그림 1)20. 첫째, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 GFP와 같은 인기 있는 형광단에 비해 잘 분리된 여기 및 방출 피크(즉, 그림 2A,B에서 각각 ~400nm 및 ~520nm)를 가지므로 스펙트럼으로 분리할 수 있어 다색 이미징에 유용합니다. 둘째, ND6 형광은 미셀이 있을 때 형광이 8배 이상 증가하며(그림 2C), 이는 강력한 막 의존성을 시사합니다. 다양한 유형의 세포를 사용한 이전의 살아있는 세포 형광 이미징 연구는 ND620에 의한 우수한 막 염색을 보여주었습니다. 셋째, 용액의 pH가 7.5(세포외 또는 세포질 환경에서 일반적으로 발견됨)에서 5.5(엔도솜 및 리소좀에서 일반적으로 발견됨)로 감소하면 ND6는 형광이 약 2배 증가하여 pH 민감도를 나타냅니다(그림 2D). 또한 분자 역학 시뮬레이션에 따르면 ND6는 ND 스캐폴드가 멤브레인 바깥쪽을 향하고 피페라진 잔류물이 인지질 헤드 그룹과 강한 상호 작용을 보이는 지질 이중층에 쉽게 통합됩니다(그림 3). 이러한 특징들로 인해 ND6는 엑소/내포작용 중 막 지질 회전율을 시각화하고 측정하는 데 이상적인 형광 지질 유사체입니다.
이 논문은 배양된 쥐 해마 뉴런을 사용하여 SV 지질의 회전율과 역학을 연구하는 방법을 제시합니다. 높은 K+ Tyrode의 용액으로 뉴런을 자극함으로써 SV와 원형질막에 ND6가 로드되었습니다(그림 4A,B). 그 후, 뉴런을 다른 자극으로 다시 자극한 후 NH4Cl 함유 및 pH 5.5 Tyrode 용액을 투여했습니다(그림 4D). 이 프로토콜은 다양한 상황에서 조립된 엑소사이토시스(exocytosis) 및 엔도사이토시스(endocytosis) 속도의 정량적 측정을 용이하게 합니다(그림 4C).
다음 프로토콜에는 (1) 잘 확립된 프로토콜22에 기초하여 마우스 해마 및 피질 배양을 확립하기 위한 간소화된 절차, (2) 살아있는 뉴런에 대한 epifluorescence 현미경 설정에 대한 간략한 소개, (3) 마우스 뉴런에서 ND6 로딩 및 이미징에 대한 자세한 설명, (4) ND6 신호에 의한 막 이동의 정량화에 대한 논의가 포함됩니다. 모든 절차는 플로리다 애틀랜틱 대학교의 생물 안전 및 IACUC 지침을 따릅니다. ND6의 합성은 앞서20에서 설명하였다.
1. 쥐의 해마 및 피질 배양의 준비
알림: 달리 지정하지 않으면 모든 단계는 생물 안전 레벨 2 층류 후드에서 수행해야 합니다. 모든 도구와 재료를 소독하십시오.
2. 살아있는 세포 형광 이미징을 위한 현미경 설정
참고: 예시적인 이미징 설정(그림 5)에는 적어도 도립 형광 현미경( 재료 표 참조), 자동 셔터가 있는 형광 광원, 형광 필터 세트(예: ND6 이미징의 경우 여기의 경우 405/10 BP, 이색성의 경우 495 LP, 방출의 경우 510/20 BP 사용) 및 고감도 카메라(재료 표)가 포함되며, 이 모든 것은 이미지 획득 소프트웨어(재료 표)에 의해 제어됩니다.
3. 신경 세포 배양에서 ND6 로딩 및 이미징
4. ND6 형광의 변화에 의한 막 이동의 정량화
SV는 유발된 외세포/세포내이입(endocytosis)을 통한 신경전달물질 방출에 특화되어있다 27. SV는 ND6에 이상적인 고산성 루멘(즉, pH 5.5)을 가지고 있습니다. 우리는 ND6가 SV에 접근할 수 있도록 SV exo-/endocytosis를 유발하기 위해 높은 K+ 자극을 사용했습니다. 예상대로, 뉴런 과정을 따라 밝은 녹색 형광 반점이 로딩 후에 나타났습니다(그림 9A). 그림 4B...
1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine(DiI) 및 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate(DiO)와 같은 지질 기반 염료는 세포 형태를 설명하고 뉴런의 축삭 돌출과 같은 세포 과정을 추적하는 데 오랫동안 사용되어 왔습니다. FM1-43과 같은 스티릴 염료는 exocytosis34 연구를 위해 발명되어 성공적으로 사용되었습니다. 막 친화도가 낮기 때문에 세포내이입된 소포가 갇혀 있는 곳에 선택...
저자는 재정적 이익이 상충되지 않는다고 선언합니다.
이 연구는 플로리다 애틀랜틱 대학교 학부 연구 및 조사 사무국(M.J.S.), 플로리다 보건부 에드 및 에델 무어 파일럿 보조금 20A17(Q.Z.), 알츠하이머 협회 보조금 AARG-NTF-19-618710(Q.Z.) 및 NIA R21 보조금 AG061656-01A1(Q.Z.)의 지원을 받았습니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Digidata 1440A Data Acquistion System | Molecular Devices | Digidata 1440A | For synchronized stimulation and solution exchange |
Dual Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | For live-cell imaging |
Fetal Bovine Serum | OMEGA Scientific | FB-01 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera | Hamamatsu Inc. | C13440-20CU | high-sensitivity camera |
Hank's Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
Heated Platform | Warner Instruments | PH-1 | For live-cell imaging |
Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For tissue culture |
Micro-G Vibration Isolation Table | TMC | 63-564 | For live-cell imaging |
Micro-manager | https://micro-manager.org/ | NA | For image acquisition control |
Multi-Line In-Line Solution Heater | Warner Instruments | SHM-6 | For live-cell imaging |
Neurobasal Plus Medium | THermoFisher Scientific | A3582901 | For tissue culture |
Nikon Ti-E Inverted Microscope | Nikon | Ti-E/B | For live-cell imaging |
ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C1340-20CU | For live-cell imaging |
Perfusion Chamber | Warner Instruments | RC-26G | For live-cell imaging |
Six-Channel Valve Control Perfusion System | Warner Instruments | VC-6 | For solution exchange |
Square Pulse Stimulator | Grass Instrument | SD9 | For electric field stimulation |
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