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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo presenta un metodo di imaging a fluorescenza che utilizza una classe di fluorofori lipidici sensibili al pH per monitorare il traffico della membrana lipidica durante l'esocitosi cellulare e il ciclo di endocitosi.

Abstract

L'eso-/endocitosi è un processo comune che media lo scambio di biomolecole tra le cellule e il loro ambiente e tra cellule diverse. Le cellule specializzate utilizzano questo processo per eseguire funzioni vitali del corpo come la secrezione di insulina dalle cellule β e il rilascio di neurotrasmettitori dalle sinapsi chimiche. A causa del suo significato fisiologico, l'eso-/endocitosi è stato uno degli argomenti più studiati in biologia cellulare. Sono stati sviluppati molti strumenti per studiare questo processo a livello genico e proteico, grazie ai quali si sa molto sul macchinario proteico che partecipa a questo processo. Tuttavia, sono stati sviluppati pochissimi metodi per misurare il turnover lipidico di membrana, che è la base fisica dell'eso-/endocitosi.

Questo articolo introduce una classe di nuovi analoghi lipidici fluorescenti che presentano fluorescenza pH-dipendente e dimostra il loro uso per tracciare il riciclaggio dei lipidi tra la membrana plasmatica e le vescicole secretorie. Aiutati da semplici manipolazioni del pH, questi analoghi consentono anche la quantificazione della distribuzione dei lipidi attraverso la superficie e i compartimenti intracellulari della membrana, nonché la misurazione del tasso di turnover lipidico durante l'eso-/endocitosi. Questi nuovi reporter lipidici saranno di grande interesse per vari campi di ricerca biologica come la biologia cellulare e le neuroscienze.

Introduzione

Il doppio strato lipidico è uno degli assemblaggi di biomolecole più comuni ed è indispensabile per tutte le cellule. All'esterno delle cellule, forma la membrana plasmatica che interfaccia le cellule e il loro ambiente; All'interno delle cellule, compartimenta vari organelli specializzati per le funzionalità designate. Piuttosto dinamiche che ferme, le membrane lipidiche sperimentano costantemente la fusione e la fissione, che media il trasporto di biomateriali, la riforma degli organelli, il cambiamento morfologico e la comunicazione cellulare. Indubbiamente, la membrana lipidica è la base fisica di quasi tutti i processi cellulari e la sua disfunzione svolge un ruolo cruciale in vari disturbi che vanno dal cancro1 al morbo di Alzheimer2. Sebbene le molecole lipidiche siano molto meno diversificate delle proteine, la ricerca sulle membrane finora è stata principalmente incentrata sulle proteine. Ad esempio, si sa molto di più sul macchinario proteico che sui lipidi nell'esocitosi 3,4,5. Inoltre, l'organizzazione, la distribuzione, la dinamica e l'omeostasi dei lipidi attraverso le membrane superficiali e intracellulari rimangono in gran parte inesplorate rispetto alle proteine di membrana6.

Ciò non sorprende in quanto le moderne tecniche di biologia molecolare, come la mutagenesi, forniscono un vantaggio metodologico per lo studio delle proteine piuttosto che dei lipidi. Ad esempio, la marcatura transgenica della proteina fluorescente verde sensibile al pH (nota anche come pHluorin) alle proteine vescicolari facilita la misurazione quantitativa della quantità e del tasso di turnover delle proteine vescicolari durante l'eso-/endocitosi 7,8,9. Tuttavia, è quasi impossibile modificare geneticamente i lipidi di membrana in vivo. Inoltre, le manipolazioni qualitative e persino quantitative delle quantità e delle distribuzioni delle proteine sono molto più fattibili di quelle dei lipidi10. Ciononostante, lipidi fluorescenti nativi e sintetici sono stati isolati e sviluppati per simulare lipidi endogeni di membrana in vitro e in vivo11. Un gruppo di lipidi fluorescenti ampiamente utilizzati sono i coloranti stirilici, ad esempio FM1-43, che mostrano una fluorescenza potenziata dalla membrana e sono un potente strumento nello studio del rilascio di vescicole sinaptiche (SV) nei neuroni12. Ultimamente, i coloranti lipidici sensibili all'ambiente sono stati inventati e ampiamente utilizzati come una nuova classe di reporter per studiare varie proprietà della membrana cellulare, tra cui il potenziale di membrana11, l'ordine di fase13 e la secrezione14.

È stata sviluppata una nuova classe di mimetici lipidici la cui fluorescenza è sia sensibile al pH (ad esempio, pHluorin) che sensibile alla membrana (ad esempio, FM1-43) per misurare direttamente la distribuzione dei lipidi nella membrana plasmatica e negli endosomi/lisosomi e il traffico lipidico durante l'eso-/endocitosi. A questo scopo sono stati selezionati i ben noti fluorofori solvatocromici che presentano caratteristiche push-pull dovute al trasferimento di carica intramolecolare. Tra i fluorofori solvatocromici esistenti, lo scaffold di 1,8-naftalimmide (ND) è relativamente facile da modificare, versatile per la marcatura ed è unico in fotofisica15 ed è stato quindi utilizzato in intercalatori di DNA, diodi organici emettitori di luce e sensori di biomolecole 16,17,18.

Il collegamento di un gruppo donatore di elettroni alla posizione C4 dello scaffold ND genera una struttura push-pull, che porta ad un aumento del momento di dipolo ridistribuendo la densità elettronica nello stato eccitato19,20. Un tale trasferimento di carica intramolecolare produce grandi rese quantistiche e spostamenti di Stokes, con conseguente fluorescenzaluminosa e stabile 21. Questo gruppo ha recentemente sviluppato una serie di analoghi lipidici solvatocromici basati sullo scaffold ND e li ha ottenuti con buone rese sintetiche20.

La caratterizzazione spettroscopica mostra che, tra questi prodotti, ND6 possiede le migliori proprietà di fluorescenza (Figura 1)20. In primo luogo, ha picchi di eccitazione ed emissione ben separati (cioè, ~ 400 nm e ~ 520 nm, rispettivamente, nella Figura 2A, B) rispetto ai fluorofori popolari come l'isotiocianato di fluoresceina, la rodamina o la GFP, rendendolo spettralmente separabile da loro e quindi utile per l'imaging multicolore. In secondo luogo, la fluorescenza ND6 mostra un aumento di oltre otto volte della sua fluorescenza in presenza di micelle (Figura 2C), suggerendo una forte dipendenza dalla membrana. Precedenti studi di imaging a fluorescenza su cellule vive con diversi tipi di cellule hanno mostrato un'eccellente colorazione della membrana con ND620. In terzo luogo, quando il pH della soluzione è diminuito da 7,5 (che si trova comunemente in ambienti extracellulari o citosolici) a 5,5 (che si trova comunemente negli endosomi e nei lisosomi), ND6 mostra un aumento di circa due volte della fluorescenza (Figura 2D), mostrando la sua sensibilità al pH. Inoltre, la simulazione della dinamica molecolare indica che ND6 si integra prontamente nel doppio strato lipidico con la sua impalcatura ND rivolta verso l'esterno della membrana e il residuo di piperazina che mostra forti interazioni con i gruppi di testa dei fosfolipidi (Figura 3). Nel complesso, queste caratteristiche rendono ND6 un analogo lipidico fluorescente ideale per visualizzare e misurare il turnover lipidico di membrana durante l'eso-/endocitosi.

Questo articolo presenta un metodo per studiare il tasso di turnover e la dinamica dei lipidi SV utilizzando neuroni ippocampali di topo in coltura. Stimolando i neuroni con soluzioni di tirodo ad alto K+, le SV e la membrana plasmatica sono state caricate con ND6 (Figura 4A,B). Successivamente, i neuroni sono stati ristimolati con diversi stimoli seguiti da soluzioni contenenti NH4Cl e pH 5,5 di Tyrode (Figura 4D). Questo protocollo facilita la misurazione quantitativa dei tassi di esocitosi ed endocitosi assemblati in diverse circostanze (Figura 4C).

Protocollo

Il seguente protocollo include (1) una procedura semplificata per stabilire colture ippocampali e corticali di topo basate su un protocolloconsolidato 22, (2) una breve introduzione a una configurazione di microscopio a epifluorescenza per neuroni vivi, (3) una descrizione dettagliata del carico e dell'imaging di ND6 nei neuroni di topo, (4) una discussione sulla quantificazione del traffico di membrana da parte del segnale ND6. Tutte le procedure seguono le linee guida sulla biosicurezza e IACUC della Florida Atlantic University. La sintesi di ND6 è stata descritta in precedenza20.

1. Preparazione di colture ippocampali e corticali di topo

NOTA: Se non diversamente specificato, tutti i passaggi devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare di livello 2 di biosicurezza. Sterilizzare tutti gli strumenti e i materiali.

  1. Utilizzare una pinza di misura 5 per posizionare i vetrini coprioggetti in piastre di coltura a più pozzetti.
    NOTA: Ad esempio, una piastra a 24 pozzetti è ideale per vetrini coprioggetti da 12 mm figure-protocol-1176 .
  2. Aggiungere il volume appropriato di matrici extracellulari per rivestire la superficie della coltura cellulare (ad esempio, 75 μL di soluzione di matrice di membrana basale per vetrino coprioggetto da 12 mm figure-protocol-1464 ; vedere la tabella dei materiali)
  3. Posizionare le piastre preparate nell'incubatore per colture tissutali (5% di CO2, 100% di umidità e 37 °C) per 1-4 ore per consentire la reticolazione della matrice della membrana basale.
  4. Sacrificare gli animali, aprire il cranio e trasferire l'intero cervello in una capsula di Petri da 35 mm con 3 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente il 20% di siero fetale bovino (H+20). Taglia il cervello lungo la linea mediana e separa le cortecce e gli ippocampi in una cappa di dissezione a flusso laminare per ridurre la contaminazione.
  5. Utilizzare le microforbici per tagliare i fazzoletti in piccoli pezzi (~1 mm3). Trasferire questi tessuti in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di H+20.
  6. Lavare i fazzoletti tre volte con 5 mL di H+20 e tre volte con 5 mL di HBSS.
  7. Aggiungere 1,5 mL di tripsina all'1% con acido etilendiammina tetraacetico e incubare a 37 °C per 10 minuti per la digestione enzimatica.
  8. Ripetere il passaggio 1.6 e utilizzare il vuoto per aspirare HBSS alla fine.
  9. Dissociare meccanicamente i tessuti in 1 mL di HBSS contenente 2,95 g/L MgSO4•7H2O utilizzando una pipetta di vetro lucidato a fuoco.
  10. Centrifugare la sospensione cellulare a 400 × g, 4 °C per 5 min.
  11. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in un volume appropriato di terreno di coltura per ottenere una concentrazione di ~10.000.000 di cellule/ml.
  12. Placcare le cellule a ~1.000.000 di cellule/cm2 e posizionare la coltura nell'incubatore (5% di CO2, 100% di umidità e 37 °C) per 1-4 ore per facilitare l'attacco delle cellule ai vetrini coprioggetti.
  13. Aggiungere un volume appropriato di terreno di coltura (ad es. 1 mL per pozzetto per una piastra da 24 pozzetti). Aggiungere lo stesso volume di terreno di coltura dopo 1 settimana. Dopo 2 settimane, sostituire metà del terreno di coltura esistente con terreno fresco ogni settimana.

2. Configurazione del microscopio per l'imaging a fluorescenza di cellule vive

NOTA: Una configurazione di imaging esemplare (Figura 5) include almeno un microscopio a fluorescenza invertito (vedere la Tabella dei materiali), una sorgente di luce a fluorescenza con otturatore automatico, set di filtri a fluorescenza (ad esempio, per l'imaging ND6, utilizzare 405/10 BP per l'eccitazione, 495 LP per la dicroica e 510/20 BP per l'emissione) e una fotocamera ad alta sensibilità (Tabella dei materiali), tutti controllati da un software di acquisizione delle immagini (Tabella dei materiali).

  1. Preparare una camera di imaging che consenta il controllo della temperatura e l'ingresso/uscita della soluzione per l'imaging a fluorescenza di cellule vive.
    NOTA: Ad esempio, in questo protocollo è stata utilizzata una camera di imaging a bagno aperto modificata fissata su una piattaforma di riscaldamento (Figura 6).
  2. Impostare un dispositivo programmabile per commutare le soluzioni di perfusione e fornire lo stimolo elettrico in punti temporali definiti durante l'imaging.
    NOTA: La sincronizzazione hardware e software è necessaria per le analisi quantitative (Figura 7). Ad esempio, in questo protocollo, un'uscita trigger dalla fotocamera per immagini è stata utilizzata per avviare un programma per computer che controlla un dispositivo di commutazione automatica, che controlla un sistema di perfusione multicanale e uno stimolatore a impulsi quadrati.
  3. Per co-immagine di due o più reporter fluorescenti, eseguire l'imaging a fluorescenza multicanale commutando in sequenza i set di filtri o suddividendo simultaneamente diverse emissioni di fluorescenza e proiettando sulla stessa telecamera.

3. Caricamento e imaging di ND6 in colture neuronali

  1. Pesare una quantità adeguata di ND6, scioglierlo in dimetilsolfossido (DMSO) e lasciarlo solubilizzare a temperatura ambiente; sonicare brevemente (ad es. 3 min). Filtrare la soluzione madre grezza utilizzando un filtro da 0,22 μm per rimuovere gli aggregati coloranti di grandi dimensioni. Dopo la filtrazione, determinare la concentrazione del colorante mediante spettroscopia di assorbimento a 405 nm utilizzando uno spettrofotometro convenzionale o a microvolumi utilizzando ε = 10.700 M-1 cm-1.
  2. Prima dell'applicazione, diluire la soluzione madre a una concentrazione di 1 μM utilizzando la soluzione del bagno. Conservare la soluzione madre a temperatura ambiente al buio.
  3. Marcatura di endosomi e vescicole sinaptiche
    1. Per marcare ubiquitariamente i compartimenti della membrana endocitosa come gli endosomi, aggiungere la soluzione madre ND6 (ad esempio, 1 mM in DMSO) al terreno di coltura alla concentrazione finale di 1 μM e incubare al 5% di CO2, al 100% di umidità e a 37 °C per 30 minuti. Per ridurre l'estensione della marcatura SV, sopprimere farmacologicamente l'attività neuronale spontanea. Ad esempio, utilizzare la tetrodotossina per bloccare i potenziali d'azione o l'acido 2,3-diosso-6-nitro-1,2,3,4-tetraidrobenzo[f]chinossalina-7-sulfonamide (NBQX) e l'acido D-(-)-2-ammino-5-fosfopentanoico (D-AP5) per inibire la trasmissione eccitatoria23.
    2. Per etichettare selettivamente le SV, utilizzare una stimolazione breve ma forte per evocare l'eso-/endocitosi presinaptica. Innanzitutto, trasferire il/i vetrino/i coprioggetti per coltura in una capsula di Petri da 35 mm figure-protocol-7338 contenente 2 mL di soluzione di Tyrode normale a temperatura ambiente. In secondo luogo, diluire la soluzione madre ND6 nella soluzione di tinodo ad alto K+ (90 mM KCl) alla concentrazione finale di 1 μM. In terzo luogo, sostituire la normale soluzione di Tyrode nella capsula di Petri con la soluzione di Tyrode ad alto contenuto di ND6 K+ e incubare a temperatura ambiente per 2 min.
  4. Trasferire la coltura cellulare marcata con ND6 nella camera di imaging riempita con una soluzione di Tyrode normale preriscaldata contenente 10 μM NBQX e 10 μM D-AP5.
  5. Regolare la velocità di perfusione a ~0,2 mL/s (cioè 1 goccia al secondo) e avviare la perfusione della soluzione di Tyrode normale preriscaldata contenente NBQX e D-AP5 per rimuovere l'ND6 in eccesso nella coltura.
  6. Regola la messa a fuoco e individua il campo visivo appropriato contenente neuroni sani e ben distribuiti che portano neuriti collegati. Evitare le aree contenenti colloidi coloranti non risolti.
  7. Prova a eseguire l'imaging di cellule caricate con ND6 con tempi di esposizione diversi per identificare le migliori impostazioni di imaging.
    NOTA: Per ottenere il miglior tempo di esposizione, l'intensità di fluorescenza dei pixel più elevata nell'immagine risultante è circa la metà dell'intervallo di bit (ad esempio, per un'immagine a 16 bit, l'intervallo di bit è compreso tra 0 e 65.535), il che consentirà un ulteriore aumento della fluorescenza quando viene applicata la soluzione del bagno acido. Il tempo di esposizione selezionato deve essere utilizzato per tutte le immagini ND6.
  8. Impostare il protocollo di stimolazione e perfusione, l'intervallo di frame e la durata totale. Ad esempio, nel seguente protocollo, utilizzare una linea di base di 30 s, una stimolazione del campo elettrico di 10 s a 30 Hz, un recupero di 50 s, un recupero di 120 s 90 mM K+, un recupero di 60 s, una soluzione di Tyrode di 60 s con 50 mM di NH4Cl, una soluzione di Tyrode di 60 s a pH 5,5 e un intervallo di frame di 3 s.
  9. Avviare l'acquisizione dell'immagine accompagnata dalla stimolazione e dalla perfusione sincronizzate. Monitora la simulazione e lo scambio di soluzioni durante l'imaging.
  10. Interrompere la perfusione al termine dell'imaging, rimuovere il vetrino coprioggetti e pulire la camera di imaging per la prova successiva.

4. Quantificazione del traffico di membrana mediante una variazione della fluorescenza ND6

  1. Eseguire il backup e/o una copia elettronica di tutti i file immagine.
  2. Scegli un programma di analisi per l'estrazione dei dati, ad esempio un software di analisi delle immagini open source come ImageJ24 e/o FIJI25.
  3. Aprire o importare una pila di immagini nel programma di analisi.
  4. Imposta la prima immagine come riferimento e allinea il resto ad essa utilizzando funzioni/plugin come Rigid Registration26, che mitigherà gli artefatti dovuti alla deriva xy. Fare riferimento alla Figura 8 per immagini di esempio.
  5. Calcola la media di tutte le immagini acquisite durante i 30 secondi prima del basale per produrre un'immagine di riferimento. Salvare una copia di questa immagine per riferimento futuro.
  6. Impostare la soglia di intensità per generare un'immagine binaria dall'immagine mediata di base.
  7. Usa Watershed in ImageJ o funzioni simili in un altro programma per separare neuriti o cellule in connessione.
  8. Utilizzare la funzione Analizza particella con dimensioni dell'area e circolarità appropriate per sollecitare le regioni di interesse (ROI) corrispondenti a membrane cellulari, endosomi, lisosomi o boutoni sinaptici. Salva tutte le ROI selezionate.
  9. Selezionare quattro ROI in background nelle aree prive di celle all'interno del campo visivo.
  10. Misura l'intensità media dei pixel per ogni ROI in ogni fotogramma della pila di immagini ed esporta i risultati per l'analisi statistica.
  11. Calcola l'intensità media delle ROI di fondo come rumore di base, che verrà sottratto dalle intensità medie dei pixel per ogni ROI.
  12. Calcolare la media delle tre intensità medie più alte per ogni ROI selezionato durante l'applicazione della soluzione di pH 5,5 Tyrode per ottenere l'intensità massima di fluorescenza, definita come 100% per la normalizzazione.
  13. Calcolare la media delle tre intensità medie più basse per ogni ROI selezionato durante l'applicazione di 50 mM NH4Cl per impostare l'intensità minima di fluorescenza, definita come 0% per la normalizzazione.
  14. Calcola le variazioni relative della fluorescenza per ogni ROI in base alle sue intensità 0% e 100%. Ricava le variazioni medie della fluorescenza, la cinetica delle variazioni e altri valori/grafici dai singoli dati ROI.

Risultati

Le SV sono specializzate per il rilascio di neurotrasmettitori tramite eso-/endocitosi evocata27. Le SV hanno un lume altamente acido (cioè pH 5,5), che è l'ideale per ND6. Abbiamo usato un'elevata stimolazione K+ per evocare l'eso-/endocitosi SV al fine di consentire a ND6 di accedere a SV. Com'era prevedibile, dopo il carico sono comparsi punti fluorescenti di colore verde brillante lungo i processi neuronali (Figura 9A). Il profilo della linea mostrato...

Discussione

I coloranti a base lipidica, come l'1,1′-diottadecil-3,3,3′,3′-tetrametilidautocarbocianina (DiI) e il perclorato di 3,3′-diottideciloxacarbocianina (DiO), sono stati a lungo utilizzati per illustrare la morfologia cellulare e tracciare i processi cellulari come le proiezioni assonali dei neuroni. I coloranti stirilici, come FM1-43, sono stati inventati e utilizzati con successo per lo studio dell'esocitosi34. A causa della loro bassa affinità di membrana, marcano selettivamente le vescic...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Florida Atlantic University Office of Undergraduate Research and Inquiry grant (M.J.S.), Florida Department of Health Ed and Ethel Moore Pilot Grant 20A17 (Q.Z.), Alzheimer's Association grant AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) e NIA R21 grant AG061656-01A1 (Q.Z.).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Digidata 1440A Data Acquistion SystemMolecular DevicesDigidata 1440AFor synchronized stimulation and solution exchange
Dual Channel Temperature ControllerWarner InstrumentsTC-344BFor live-cell imaging
Fetal Bovine SerumOMEGA ScientificFB-01For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Hamamatsu Flash4.0 sCOMS cameraHamamatsu Inc.C13440-20CUhigh-sensitivity camera
Hank's Balanced Salt SolutionSigmaH6648For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Heated PlatformWarner InstrumentsPH-1For live-cell imaging
MatrigelBD Biosciences354234For tissue culture
Micro-G Vibration Isolation TableTMC63-564For live-cell imaging
Micro-managerhttps://micro-manager.org/NAFor image acquisition control
Multi-Line In-Line Solution HeaterWarner InstrumentsSHM-6For live-cell imaging
Neurobasal Plus MediumTHermoFisher ScientificA3582901For tissue culture
Nikon Ti-E Inverted MicroscopeNikonTi-E/BFor live-cell imaging
ORCA-Flash4.0 Digital CMOS cameraHamamatsuC1340-20CUFor live-cell imaging
Perfusion ChamberWarner InstrumentsRC-26GFor live-cell imaging
Six-Channel Valve Control Perfusion SystemWarner InstrumentsVC-6For solution exchange
Square Pulse StimulatorGrass InstrumentSD9For electric field stimulation

Riferimenti

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