使用 pH 敏感荧光脂质类似物 ND6 测量膜脂质周转率

摘要

该协议提出了一种荧光成像方法，该方法使用一类pH敏感的脂质荧光团来监测细胞胞吐作用和内吞循环期间的脂质膜运输。

摘要

外吞/内吞作用是介导细胞与其环境之间以及不同细胞之间生物分子交换的常见过程。特化细胞使用这个过程来执行重要的身体功能，例如β细胞分泌胰岛素和化学突触释放神经递质。由于其生理学意义，外吞/内吞作用一直是细胞生物学中研究最多的课题之一。已经开发了许多工具来在基因和蛋白质水平上研究这一过程，因此对参与这一过程的蛋白质机制了解很多。然而，很少有方法被开发出来测量膜脂质周转，这是外吞/内吞作用的物理基础。

本文介绍了一类具有pH依赖性荧光的新型荧光脂质类似物，并展示了它们在质膜和分泌囊泡之间追踪脂质循环的用途。在简单的pH操作的帮助下，这些类似物还可以定量整个表面和细胞内膜室的脂质分布，以及测量胞外/内吞过程中的脂质周转率。这些新型脂质报告基因将对细胞生物学和神经科学等各种生物学研究领域产生浓厚的兴趣。

引言

脂质双层是最常见的生物分子组装体之一，对所有细胞都是必不可少的。在细胞外，它形成质膜，连接细胞及其环境;在细胞内，它将专门用于指定功能的各种细胞器隔开。脂质膜是动态的，而不是静止的，它不断经历融合和裂变，介导生物材料运输、细胞器重组、形态变化和细胞通讯。毫无疑问，脂质膜是几乎所有细胞过程的物理基础，其功能障碍在从癌症¹ 到阿尔茨海默病² 的各种疾病中起着至关重要的作用。尽管脂质分子的多样性远不如蛋白质，但迄今为止的膜研究主要以蛋白质为中心。例如，对蛋白质机制的了解比对胞吐作用中的脂质的了解要多^{得多 3,4,5}。此外，与膜蛋白相比，脂质在表面和细胞内膜上的组织、分布、动力学和稳态在很大程度上仍未得到^探索6。

这并不奇怪，因为现代分子生物学技术，如诱变，为研究蛋白质而不是脂质提供了方法学优势。例如，将pH敏感的绿色荧光蛋白（又名pHluorin）转基因标记到囊泡蛋白上，有助于定量测量胞外/内吞作用期间囊泡蛋白周转的数量和速率^7,8,9。然而，在体内对膜脂质进行基因修饰几乎是不可能的。此外，蛋白质数量和分布的定性甚至定量操作比脂质¹⁰ 更可行。然而，已经分离和开发了天然和合成荧光脂质，以模拟体外和体内的内源性膜脂质¹¹。一组广泛使用的荧光脂质是苯乙烯基染料，例如 FM1-43，它们表现出膜增强荧光，是研究神经元中突触囊泡 （SV） 释放的有力工具¹²。最近，环境敏感脂质染料被发明并广泛用作研究各种细胞膜特性的新型报告基因，包括膜电位¹¹、相序¹³和分泌¹⁴。

开发了一类新的脂质模拟物，其荧光对pH敏感（例如，pHluorin）和对膜敏感（例如，FM1-43），用于直接测量质膜和内体/溶酶体中的脂质分布以及外吞/内吞过程中的脂质运输。为此，选择了众所周知的溶剂变色荧光团，这些荧光团由于分子内电荷转移而表现出推拉特性。在现有的溶剂变色荧光团中，1,8-萘二甲酰亚胺（ND）支架相对容易修饰，可用于标记，并且在光物理学^{中是独一无二的15}，因此已被用于DNA插层器、有机发光二极管和生物分子传感器16,17,18。

将供电子基团连接到ND支架的C4位置会产生推拉结构，通过在激发态^19,20中重新分配电子密度，从而增加偶极矩。这种分子内电荷转移产生大的量子产率和斯托克斯位移，从而产生明亮而稳定的荧光²¹。该小组最近开发了一系列基于ND支架的溶剂变色脂质类似物，并获得了具有良好合成产率²⁰的溶剂变色脂质类似物。

光谱表征表明，在这些产物中，ND6具有最佳的荧光特性（图1）²⁰。首先，与常用荧光素异硫氰酸荧光素、罗丹明或GFP相比，它具有分离良好的激发峰和发射峰（即图2A，B中分别为~400nm和~520nm），使其在光谱上可与它们分离，因此可用于多色成像。其次，在胶束存在下，ND6荧光的荧光增加了八倍以上（图2C），表明其具有很强的膜依赖性。先前对不同类型细胞的活细胞荧光成像研究表明，ND6²⁰ 具有出色的膜染色效果。第三，当溶液的pH值从7.5（常见于细胞外或胞质环境中）降低到5.5（常见于内体和溶酶体中）时，ND6的荧光增加约两倍（图2D），显示出其pH敏感性。此外，分子动力学模拟表明，ND6 很容易整合到脂质双层中，其 ND 支架朝外，哌嗪残基与磷脂头部基团表现出强烈的相互作用（图 3）。总而言之，这些特性使ND6成为理想的荧光脂质类似物，用于可视化和测量胞吐/内吞过程中的膜脂质周转。

本文介绍了一种使用培养的小鼠海马神经元研究SV脂质的周转率和动力学的方法。通过用高 K⁺ 酪氨酸溶液刺激神经元，SV 和质膜负载了 ND6（图 4A、B）。随后，用不同的刺激重新刺激神经元，然后用含 NH₄Cl 和 pH 5.5 Tyrode 溶液（图 4D）。该方案有助于定量测量不同情况下组装的胞吐作用和内吞作用速率（图4C）。

研究方案

以下协议包括（1）基于完善的协议²²建立小鼠海马体和皮质培养物的简化程序，（2）对活神经元的落射荧光显微镜设置的简要介绍，（3）小鼠神经元中ND6的加载和成像的详细描述，（4）关于ND6信号膜运输量化的讨论。所有程序均遵循佛罗里达大西洋大学的生物安全和 IACUC 指南。ND6 的合成之前已经描述过²⁰.

1.小鼠海马和皮质培养物的制备

注意:如果没有另行说明，所有步骤都必须在生物安全 2 级层流罩中执行。对所有工具和材料进行消毒。

1. 使用 5 号镊子将玻璃盖玻片放入多孔培养板中。
   注意:例如，24 孔板是 12 mm 盖玻片的理想选择。
2. 加入适当体积的细胞外基质以覆盖细胞培养表面（例如，每 12 mm 盖玻片 75 μL 基底膜基质溶液;参见 材料表）
3. 将制备的板置于组织培养箱（5%CO 2,100%湿度和37°C）中1-4小时，以允许基底膜基质交联。
4. 处死动物，打开头骨，将整个大脑转移到含有 3 mL 含有 20% 胎牛血清 （H+20） 的 3 mL Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 的 3 mm 培养皿中。沿中线切开大脑，并在层流解剖罩中分离皮质和海马体，以减少污染。
5. 使用显微剪刀将组织切成小块（~1 mm³）。将这些组织转移到含有 5 mL H+20 的 15 mL 锥形管中。
6. 用 5 mL H+20 洗涤组织 3 次，用 5 mL HBSS 洗涤组织 3 次。
7. 加入 1.5 mL 1% 胰蛋白酶与乙二胺四乙酸，并在 37 °C 下孵育 10 分钟进行酶消化。
8. 重复步骤 1.6 并最终使用真空吸出 HBSS。
9. 使用火抛光玻璃移液管在含有 2.95 g/L MgSO₄•7H₂O 的 1 mL HBSS 中机械解离组织。
10. 将细胞悬液在400× g，4°C离心5分钟。
11. 吸出上清液并将细胞重悬于适当体积的培养基中，以获得~10,000,000个细胞/ ml的浓度。
12. 将细胞以~1,000,000个细胞/^{cm 2}铺板，并将培养物置于培养箱（5%CO 2,100%湿度和37°C）中1-4小时，以促进细胞附着到玻璃盖玻片上。
13. 加入适量的培养基（例如，24 孔板每孔 1 mL）。1周后加入相同体积的培养基。2周后，每周用新鲜培养基替换现有培养基的一半。

2. 用于活细胞荧光成像的显微镜设置

注意:示例性成像装置（图5）至少包括倒置荧光显微镜（参见 材料表），具有自动快门的荧光光源，荧光滤光片组（例如，用于成像ND6，使用405/10 BP进行激发，495 LP用于二向色，510/20 BP用于发射）和高灵敏度相机（材料表），所有这些都由图像采集软件（材料表）控制。

1. 准备一个成像室，允许温度控制和溶液输入/输出，用于活细胞荧光成像。
   注意:例如，在该协议中使用了固定在加热平台上的改进的开放式浴成像室（图6）。
2. 设置一个可编程设备来切换灌注溶液，并在成像期间的指定时间点提供电刺激。
   注:定量分析需要硬件和软件同步（图7）。例如，在该协议中，来自成像相机的触发输出用于启动控制自动开关设备的计算机程序，该设备控制多通道灌注系统和方脉冲刺激器。
3. 要对两个或多个荧光报告基因进行同步成像，请通过顺序切换滤光片组或同时分离不同的荧光发射并投影到同一相机来执行多通道荧光成像。

3. 神经元培养物中ND6的加载和成像

1. 称取ND6适量，溶于二甲基亚砜（DMSO）中，常温溶解;短暂超声处理（例如，3 分钟）。使用0.22μm过滤器过滤粗储备溶液以除去大染料聚集体。过滤后，使用常规或微量分光光度计在405nm处使用ε= 10,700 ^{M-1 cm-1}的吸收光谱法测定染料浓度。
2. 施用前，使用浴液将储备溶液稀释至1μM的浓度。将储备溶液保持在室温下，在黑暗中保存。
3. 内体和突触囊泡的标记
   1. 为了普遍标记内吞膜室（如内体），将ND6储备溶液（例如，1mM的DMSO溶液）以1μM的终浓度加入培养基中，并在5%CO 2,100%湿度和37°C下孵育30分钟。为了减少SV标记的程度，在药理学上抑制自发神经元活动。例如，使用河豚毒素阻断动作电位或使用2,3-二氧代-6-硝基-1,2,3,4-四氢苯并[f]喹喔啉-7-磺酰胺（NBQX）和D-（-）-2-氨基-5-膦酰戊酸（D-AP5）抑制兴奋性传递²³。
   2. 要选择性标记 SV，请使用短暂但强烈的刺激来唤起突触前外吞/内吞作用。首先，将培养盖玻片转移到含有 2 mL 室温正常酪氨酸溶液的 35 mm 培养皿中。其次，在高K ⁺ Tyrode溶液（90mM KCl）中以1μM的终浓度稀释ND 6储备溶液。第三，用含有ND6的高K ⁺ 酪氨酸溶液代替培养皿中的正常酪氨酸溶液，并在室温下孵育2分钟。
4. 将ND6标记的细胞培养物转移到装有含有10μM NBQX和10μM D-AP5的预热正常Tyrode溶液的成像室中。
5. 将灌注速度调整至 ~0.2 mL/s（即每秒 1 滴），并开始灌注含有 NBQX 和 D-AP5 的预热正常 Tyrode 溶液以除去培养物中过量的 ND6。
6. 调整焦点并找到适当的视野，其中包含携带连接神经突的健康且分布良好的神经元。避免含有未分辨染料胶体的区域。
7. 尝试使用不同的曝光时间对负载 ND6 的细胞进行成像，以确定最佳成像设置。
   注意:为了获得最佳曝光时间，所得图像中的最高像素荧光强度约为位范围的一半（例如，对于 16 位图像，位范围为 0 到 65,535），这将允许在应用酸性浴溶液时进一步增加荧光。所选的曝光时间应用于所有 ND6 成像。
8. 设置刺激和灌注方案、帧间隔和总持续时间。例如，在以下协议中，使用 30 秒基线、10 秒 30 Hz 电场刺激、50 秒恢复、120 秒 90 mM K⁺、60 秒恢复、60 秒 Tyrode 溶液与 50 mM NH₄Cl、60 秒 Tyrode 溶液在 pH 5.5 下，帧间隔为 3 秒。
9. 开始图像采集，同时进行同步刺激和灌注。在成像过程中监控仿真和解决方案交换。
10. 成像结束后停止灌注，取出盖玻片，清洁成像室以进行下一次试验。

4. 通过ND6荧光的变化来定量膜运输

1. 备份和/或制作所有图像文件的电子副本。
2. 选择用于数据提取的分析程序，例如，开源图像分析软件，如 ImageJ²⁴ 和/或 FIJI²⁵。
3. 打开图像堆栈或将图像堆栈导入分析程序。
4. 将第一个图像设置为参考，并使用函数/插件（如 Rigid Registration²⁶）将其余图像与它对齐，这将减少由于 xy 漂移而导致的伪影。有关示例图像，请参阅 图 8 。
5. 对 30 秒前基线期间采集的所有图像进行平均，以生成参考图像。保存此映像的副本以备将来参考。
6. 设置强度阈值以从基线平均图像生成二进制图像。
7. 使用 ImageJ 中的 Watershed 或另一个程序中的类似函数来分离连接的神经突或细胞。
8. 使用具有适当面积大小和圆度的 分析颗粒 功能来征集与细胞膜、内体、溶酶体或突触布顿相对应的感兴趣区域 （ROI）。保存所有选定的 ROI。
9. 在视野内的无细胞区域中选择四个背景 ROI。
10. 测量图像堆栈中每一帧中每个 ROI 的平均像素强度，并导出结果进行统计分析。
11. 将背景 ROI 的平均强度计算为基线噪声，该噪声将从每个 ROI 的平均像素强度中减去。
12. 在应用pH 5.5 Tyrode溶液期间，对每个选定的ROI的三个最高平均强度进行平均，以获得最大荧光强度，该强度定义为100%进行归一化。
13. 在应用 50 mM NH₄Cl 期间，对每个选定的 ROI 的三个最低平均强度进行平均，以设置最小荧光强度，标准化定义为 0%。
14. 根据每个ROI自身的0%和100%强度计算相对荧光变化。从单个 ROI 数据中推导出平均荧光变化、变化动力学和其他值/图。

结果

SV 专门用于通过诱发外吞/内吞作用释放神经递质²⁷。SV 具有高酸性管腔（即 pH 5.5），非常适合 ND6。我们使用高 K⁺ 刺激来诱发 SV 外吞/内吞作用，以使 ND6 能够进入 SV。预计在加载后，沿神经元过程出现亮绿色荧光点（图9A）。 图4B 所示的线剖面显示ND6（绿色曲线）和FM4-64点（红色曲线）之间有很强的重叠。ND6 和 FM4-64 荧光强度之间的?...

讨论

脂质基染料，如1,1′-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚羰花青（DiI）和3,3′-二十八烷基氧杂羰花青高氯酸盐（DiO），长期以来一直用于说明细胞形态和跟踪细胞过程，如神经元的轴突投射。苯乙烯基染料，如FM1-43，已被发明并成功用于胞吐作用^的研究34。由于它们的膜亲和力低，它们选择性地标记内吞囊泡被捕获的地方，而残留在质膜上的染料则通过持续灌注洗掉。因此，苯?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digidata 1440A Data Acquistion System	Molecular Devices	Digidata 1440A	For synchronized stimulation and solution exchange
Dual Channel Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B	For live-cell imaging
Fetal Bovine Serum	OMEGA Scientific	FB-01	For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera	Hamamatsu Inc.	C13440-20CU	high-sensitivity camera
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma	H6648	For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Heated Platform	Warner Instruments	PH-1	For live-cell imaging
Matrigel	BD Biosciences	354234	For tissue culture
Micro-G Vibration Isolation Table	TMC	63-564	For live-cell imaging
Micro-manager	https://micro-manager.org/	NA	For image acquisition control
Multi-Line In-Line Solution Heater	Warner Instruments	SHM-6	For live-cell imaging
Neurobasal Plus Medium	THermoFisher Scientific	A3582901	For tissue culture
Nikon Ti-E Inverted Microscope	Nikon	Ti-E/B	For live-cell imaging
ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera	Hamamatsu	C1340-20CU	For live-cell imaging
Perfusion Chamber	Warner Instruments	RC-26G	For live-cell imaging
Six-Channel Valve Control Perfusion System	Warner Instruments	VC-6	For solution exchange
Square Pulse Stimulator	Grass Instrument	SD9	For electric field stimulation