pH 感受性蛍光脂質アナログ ND6 による膜脂質代謝回転の測定(英語)

要約

このプロトコルは細胞のエキソサイトーシスおよびendocytosis周期の間に脂質の膜の交通を監視するのにpH敏感な脂質のfluorohoresのクラスを使用する蛍光性イメージ投射方法を示す。

要約

エキソ/エンドサイトーシスは、細胞とその環境間、および異なる細胞間での生体分子の交換を媒介する一般的なプロセスです。特殊な細胞は、このプロセスを使用して、β細胞からのインスリン分泌や化学シナプスからの神経伝達物質の放出などの重要な身体機能を実行します。その生理学的重要性から、エキソ/エンドサイトーシスは細胞生物学において最も研究されているトピックの1つです。このプロセスを遺伝子およびタンパク質レベルで研究するために多くのツールが開発されているため、このプロセスに関与するタンパク質機構について多くのことが知られています。しかし、エキソ/エンドサイトーシスの物理的基盤である膜脂質代謝回転を測定する方法はほとんど開発されていません。

この論文では、pH依存性蛍光を示す新しい蛍光脂質類似体を紹介し、原形質膜と分泌小胞の間の脂質リサイクルを追跡するためのそれらの使用を実証します。これらの類似体は、単純なpH操作により、表面および細胞内膜コンパートメント全体の脂質分布の定量化や、エキソ/エンドサイトーシス中の脂質代謝回転率の測定も可能にします。これらの新しい脂質レポーターは、細胞生物学や神経科学などのさまざまな生物学研究分野にとって大きな関心事です。

概要

脂質二重層は、最も一般的な生体分子集合体の1つであり、すべての細胞に不可欠です。細胞の外では、細胞とその環境を接する原形質膜を形成します。細胞内では、指定された機能に特化したさまざまな細胞小器官を区画化します。脂質膜は、静止しているというよりはむしろ動的であり、常に融合と分裂を経験し、生体材料の輸送、オルガネラの改革、形態の変化、および細胞間コミュニケーションを媒介します。脂質膜は、ほとんどすべての細胞プロセスの物理的基盤であり、その機能不全は、がん¹からアルツハイマー病²に至るまでのさまざまな疾患において重要な役割を果たしています。脂質分子はタンパク質に比べて多様性がはるかに低いですが、これまでの膜研究は主にタンパク質中心でした。例えば、エキソサイトーシスにおける脂質よりもタンパク質機構について多くのことが知られている^3,4,5。さらに、表面および細胞内膜における脂質の組織化、分布、動態、および恒常性は、膜タンパク質と比較してほとんど未解明のままです⁶。

突然変異誘発などの最新の分子生物学技術は、脂質ではなくタンパク質を研究するための方法論的利点を....

プロトコル

以下のプロトコルには、(1)確立されたプロトコル²²に基づいてマウス海馬および皮質培養を確立するための簡略化された手順、(2)生きたニューロン用の落射蛍光顕微鏡のセットアップの簡単な紹介、(3)マウスニューロンにおけるND6のロードとイメージングの詳細な説明、(4)ND6シグナルによる膜輸送の定量化に関する議論が含まれます。すべての手順は、フロリダアトランティック大学のバイオセーフティとIACUCのガイドラインに従います。ND6の合成は、^以前に20に記載されている。

1. マウス海馬および皮質培養の調製

注意: 特に指定がない限り、すべてのステップはバイオセーフティレベル2の層流フードで実行する必要があります。すべてのツールと材料を滅菌します。

1. サイズ5の鉗子を使用して、ガラスカバーガラスをマルチウェル培養プレートに入れます。
   注:たとえば、24ウェルプレートは12 mm のカバーガラスに最適です。
2. 細胞培養表面をコーティングするために、適切な量の細胞外マトリックスを添加し....

結果

SVは、誘発されたエキソ/エンドサイトーシスを介した神経伝達物質の放出に特化しています²⁷。SVは内腔が酸性度が高く(pH 5.5)、ND6に最適です。ND6がSVにアクセスできるようにするために、SVエキソ/エンドサイトーシスを誘発するために高K⁺ 刺激を使用しました。予想通り、負荷後には神経突起に沿った明るい緑色の蛍光点状が現れた(図9A)。

ディスカッション

1,1′-ジオクタデシル-3,3,3′,3′-テトラメチルインドカルボシアニン(DiI)や3,3′-ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩(DiO)などの脂質系色素は、細胞形態の解明や、ニューロンの軸索突起などの細胞プロセスの追跡に長い間使用されてきました。FM1-43などのスチリル色素は、エキソサイトーシスの研究のために発明され、成功裏に使用されている³⁴。膜親和性が低?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digidata 1440A Data Acquistion System	Molecular Devices	Digidata 1440A	For synchronized stimulation and solution exchange
Dual Channel Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B	For live-cell imaging
Fetal Bovine Serum	OMEGA Scientific	FB-01	For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera	Hamamatsu Inc.	C13440-20CU	high-sensitivity camera
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma	H6648	For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Heated Platform	Warner Instruments	PH-1	For live-cell imaging
Matrigel	BD Biosciences	354234	For tissue culture
Micro-G Vibration Isolation Table	TMC	63-564	For live-cell imaging
Micro-manager	https://micro-manager.org/	NA	For image acquisition control
Multi-Line In-Line Solution Heater	Warner Instruments	SHM-6	For live-cell imaging
Neurobasal Plus Medium	THermoFisher Scientific	A3582901	For tissue culture
Nikon Ti-E Inverted Microscope	Nikon	Ti-E/B	For live-cell imaging
ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera	Hamamatsu	C1340-20CU	For live-cell imaging
Perfusion Chamber	Warner Instruments	RC-26G	For live-cell imaging
Six-Channel Valve Control Perfusion System	Warner Instruments	VC-6	For solution exchange
Square Pulse Stimulator	Grass Instrument	SD9	For electric field stimulation