pH 感受性蛍光脂質アナログ ND6 による膜脂質代謝回転の測定(英語)

要約

このプロトコルは細胞のエキソサイトーシスおよびendocytosis周期の間に脂質の膜の交通を監視するのにpH敏感な脂質のfluorohoresのクラスを使用する蛍光性イメージ投射方法を示す。

要約

エキソ/エンドサイトーシスは、細胞とその環境間、および異なる細胞間での生体分子の交換を媒介する一般的なプロセスです。特殊な細胞は、このプロセスを使用して、β細胞からのインスリン分泌や化学シナプスからの神経伝達物質の放出などの重要な身体機能を実行します。その生理学的重要性から、エキソ/エンドサイトーシスは細胞生物学において最も研究されているトピックの1つです。このプロセスを遺伝子およびタンパク質レベルで研究するために多くのツールが開発されているため、このプロセスに関与するタンパク質機構について多くのことが知られています。しかし、エキソ/エンドサイトーシスの物理的基盤である膜脂質代謝回転を測定する方法はほとんど開発されていません。

この論文では、pH依存性蛍光を示す新しい蛍光脂質類似体を紹介し、原形質膜と分泌小胞の間の脂質リサイクルを追跡するためのそれらの使用を実証します。これらの類似体は、単純なpH操作により、表面および細胞内膜コンパートメント全体の脂質分布の定量化や、エキソ/エンドサイトーシス中の脂質代謝回転率の測定も可能にします。これらの新しい脂質レポーターは、細胞生物学や神経科学などのさまざまな生物学研究分野にとって大きな関心事です。

概要

脂質二重層は、最も一般的な生体分子集合体の1つであり、すべての細胞に不可欠です。細胞の外では、細胞とその環境を接する原形質膜を形成します。細胞内では、指定された機能に特化したさまざまな細胞小器官を区画化します。脂質膜は、静止しているというよりはむしろ動的であり、常に融合と分裂を経験し、生体材料の輸送、オルガネラの改革、形態の変化、および細胞間コミュニケーションを媒介します。脂質膜は、ほとんどすべての細胞プロセスの物理的基盤であり、その機能不全は、がん¹からアルツハイマー病²に至るまでのさまざまな疾患において重要な役割を果たしています。脂質分子はタンパク質に比べて多様性がはるかに低いですが、これまでの膜研究は主にタンパク質中心でした。例えば、エキソサイトーシスにおける脂質よりもタンパク質機構について多くのことが知られている^3,4,5。さらに、表面および細胞内膜における脂質の組織化、分布、動態、および恒常性は、膜タンパク質と比較してほとんど未解明のままです⁶。

突然変異誘発などの最新の分子生物学技術は、脂質ではなくタンパク質を研究するための方法論的利点を提供するため、これは驚くべきことではありません。例えば、pH感受性緑色蛍光タンパク質(別名pHluorin)を小胞タンパク質にトランスジェニックタグ付けすると、エキソ/エンドサイトーシス中の小胞タンパク質の代謝回転量と速度の定量的測定が容易になります^7,8,9。しかし、生体内で膜脂質を遺伝子改変することはほとんど不可能です。さらに、タンパク質の量と分布の定性的および定量的操作は、脂質の操作よりもはるかに実行可能です¹⁰。それにもかかわらず、天然および合成の蛍光脂質が単離され、in vitroおよびin vivoで内因性膜脂質をシミュレートするために開発されています¹¹。広く使用されている蛍光脂質の1つのグループは、膜増強蛍光を示し、ニューロンにおけるシナプス小胞(SV)放出を研究するための強力なツールであるFM1-43などのスチリル色素です¹²。近年、環境感受性脂質色素が発明され、膜電位¹¹、相順序¹³、分泌¹⁴など、さまざまな細胞膜特性を研究するための新しいクラスのレポーターとして広く使用されています。

蛍光がpH感受性(例:pHluorin)と膜感受性(例:FM1-43)の両方を持つ新しいクラスの脂質模倣物が開発され、細胞膜およびエンドソーム/リソソーム内の脂質分布と、エキソ/エンドサイトーシス中の脂質交通を直接測定しました。この目的のために、分子内電荷移動によるプッシュプル特性を示すよく知られたソルバトクロミック蛍光色素を選択しました。既存のソルバトクロミック蛍光色素の中で、1,8-ナフタルイミド(ND)スキャフォールドは比較的簡単に改変でき、タグ付けに汎用性があり、光物理学ではユニークであり¹⁵、したがってDNAインターカレーター、有機発光ダイオード、および生体分子^{センサー16,17,18}に使用されています。

ND足場のC4位に電子供与基を付着させると、プッシュプル構造が生成され、励起状態での電子密度が再分配されることで双極子モーメントが増加する^19,20。このような分子内電荷移動は、大きな量子収率とストークスシフトを生成し、明るく安定した蛍光をもたらす²¹。このグループは最近、ND足場に基づく一連のソルバトクロミック脂質類似体を開発し、良好な合成収率でそれらを得ました²⁰。

分光特性評価により、これらの生成物の中でND6は最高の蛍光特性を有することが示されています(図1)²⁰。まず、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、GFPなどの一般的な蛍光色素と比較して、励起ピークと発光ピークが十分に分離されているため( 図2A、Bではそれぞれ~400 nmと~520 nm)、スペクトル的に分離できるため、マルチカラーイメージングに有用です。第二に、ND6蛍光はミセル存在下で8倍以上の蛍光を示し(図2C)、強い膜依存性を示唆しています。異なる種類の細胞を用いた以前の生細胞蛍光イメージング研究では、ND6²⁰による優れた膜染色が示されました。第3に、溶液のpHを7.5(細胞外または細胞質環境で一般的に見られる)から5.5(エンドソームおよびリソソームで一般的に見られる)に下げると、ND6の蛍光が約2倍に増加し(図2D)、pH感受性を示します。さらに、分子動力学シミュレーションでは、ND6は脂質二重層に容易に組み込まれ、ND足場は膜の外側を向いており、ピペラジン残基はリン脂質ヘッド基と強い相互作用を示しています(図3)。これらの特徴により、ND6は、エキソ/エンドサイトーシス中の膜脂質代謝回転を可視化および測定するための理想的な蛍光脂質類似体となっています。

この論文では、培養マウス海馬ニューロンを用いてSV脂質の代謝回転速度と動態を研究する方法を紹介します。高K⁺ チロード溶液でニューロンを刺激することにより、SVと原形質膜にND6をロードしました(図4A、B)。続いて、ニューロンを異なる刺激で再刺激し、NH₄Cl含有とpH 5.5のTyrode溶液で再刺激しました(図4D)。このプロトコルは、さまざまな状況下で組み立てられたエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシス率の定量的測定を容易にします(図4C)。

プロトコル

以下のプロトコルには、(1)確立されたプロトコル²²に基づいてマウス海馬および皮質培養を確立するための簡略化された手順、(2)生きたニューロン用の落射蛍光顕微鏡のセットアップの簡単な紹介、(3)マウスニューロンにおけるND6のロードとイメージングの詳細な説明、(4)ND6シグナルによる膜輸送の定量化に関する議論が含まれます。すべての手順は、フロリダアトランティック大学のバイオセーフティとIACUCのガイドラインに従います。ND6の合成は、^以前に20に記載されている。

1. マウス海馬および皮質培養の調製

注意: 特に指定がない限り、すべてのステップはバイオセーフティレベル2の層流フードで実行する必要があります。すべてのツールと材料を滅菌します。

1. サイズ5の鉗子を使用して、ガラスカバーガラスをマルチウェル培養プレートに入れます。
   注:たとえば、24ウェルプレートは12 mm のカバーガラスに最適です。
2. 細胞培養表面をコーティングするために、適切な量の細胞外マトリックスを添加します(例:カバーガラス12 mm あたり75 μLの基底膜マトリックス溶液、 材料表を参照)
3. 調製したプレートを組織培養インキュベーター(5%_CO2、湿度100%、37°C)に1〜4時間入れて、基底膜マトリックスの架橋を可能にします。
4. 動物を生贄に捧げ、頭蓋骨を開き、20%のウシ胎児血清(H + 20)を含む3mLのハンク平衡塩溶液(HBSS)を含む35mmのシャーレに脳全体を移します。正中線に沿って脳を切断し、層流解剖フードで皮質と海馬を分離して汚染を減らします。
5. マイクロハサミを使用して、組織を小片(~1 mm³)に切ります。これらの組織を、5 mLのH+20を含む15 mLのコニカルチューブに移します。
6. 組織を5 mLのH+20で3回、5 mLのHBSSで3回洗浄します。
7. 1.5 mLの1%トリプシンとエチレンジアミン四酢酸を加え、37°Cで10分間インキュベートして酵素消化します。
8. 手順1.6を繰り返し、最後に真空を使用してHBSSを吸引します。
9. 2.95 g/L MgSO₄•7H₂Oを含む1 mLのHBSS中で、ファイヤーポリッシュガラスピペットを使用して組織を機械的に解離します。
10. 細胞懸濁液を400 × g、4°Cで5分間遠心分離します。
11. 上清を吸引し、細胞を適切な量の培地に再懸濁して、~10,000,000細胞/mlの濃度を得ます。
12. 細胞を~1,000,000細胞/cm² で播種し、培養液をインキュベーター(5%_CO2、湿度100%、37°C)に1〜4時間入れて、細胞をガラスカバーガラスに付着させやすくします。
13. 適切な量の培地を添加します(例:24ウェルプレートの場合はウェルあたり1 mL)。1週間後に同量の培地を添加します。2週間後、毎週既存の培地の半分を新鮮な培地に交換します。

2. 生細胞蛍光イメージングのための顕微鏡セットアップ

注:例示的なイメージングセットアップ(図5)は、少なくとも倒立蛍光顕微鏡( 材料表を参照)、自動シャッター付き蛍光光源、蛍光フィルターセット(例えば、ND6のイメージングには、励起に405/10BP、ダイクロイックに495LP、および発光に510/20BPを使用)、および高感度カメラ(材料表)を含み、これらはすべて画像取得ソフトウェア(材料表)によって制御される。

1. 生細胞蛍光イメージングのための温度制御と溶液の入出力が可能なイメージングチャンバーを準備します。
   注:例えば、このプロトコルでは、加熱プラットフォームに固定された改造されたオープンバスイメージングチャンバーを使用しました(図6)。
2. プログラム可能なデバイスをセットアップして、灌流溶液を切り替え、イメージング中に定義された時点で電気刺激を送達します。
   メモ:定量分析には、ハードウェアとソフトウェアの同期が必要です(図7)。例えば、このプロトコルでは、イメージングカメラからのトリガ出力を使用して、マルチチャンネル灌流システムおよび矩形パルス刺激器を制御する自動スイッチデバイスを制御するコンピュータプログラムを起動した。
3. 2つ以上の蛍光レポーターを共イメージングするには、フィルターセットを順次切り替えるか、異なる蛍光発光を同時に分割して同じカメラに投影することにより、マルチチャンネル蛍光イメージングを実行します。

3. 神経細胞培養におけるND6のローディングとイメージング

1. 適量のND6を秤量し、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、室温で可溶化させます。短時間(例:3分)超音波処理する。0.22 μmフィルターを使用して粗原液をろ過し、大きな色素凝集体を除去します。濾過後、ε = 10,700 ^{M-1 cm-1} を使用した従来のまたは微量分光光度計を使用して、405 nm の吸収分光法により色素濃度を決定します。
2. 塗布する前に、浴液を使用して原液を1μMの濃度に希釈します。原液は室温で暗所に保管してください。
3. エンドソームおよびシナプス小胞の標識
   1. エンドソームなどのエンドサイトーシスされたメンブレンコンパートメントをユビキタスに標識するには、ND6ストック溶液(例:DMSO中の1 mM)を最終濃度1 μMの培地に添加し、5%_CO2、100%湿度、37°Cで30分間インキュベートします。SV標識の程度を小さくするには、薬理学的に自発的なニューロン活動を抑制します。例えば、活動電位を遮断するためにテトロドトキシンを使用したり、興奮性伝達を阻害するために2,3-ジオキソ-6-ニトロ-1,2,3,4-テトラヒドロベンゾ[f]キノキサリン-7-スルホンアミド(NBQX)およびD-(-)-2-アミノ-5-ホスホノペンタン酸(D-AP5)を使用したりします²³。
   2. SVを選択的に標識するには、短時間だが強い刺激を用いて、シナプス前部のエキソ/エンドサイトーシスを誘発する。まず、培養カバーガラスを、室温で2 mLの通常のTyrode溶液を含む35 mm シャーレに移します。次に、ND6 ストック溶液を high-K⁺ Tyrode 溶液(90 mM KCl)で最終濃度 1 μM に希釈します。第三に、ペトリ皿内の通常のTyrode溶液をND6含有high-K⁺ Tyrode溶液と交換し、室温で2分間インキュベートします。
4. ND6標識細胞培養液を、10 μM NBQXおよび10 μM D-AP5を含む予熱した通常のTyrode溶液で満たされたイメージングチャンバーに移します。
5. 灌流速度を~0.2 mL/s(すなわち、1秒間に1滴)に調整し、NBQXとD-AP5を含む予熱した通常のチロード溶液の灌流を開始して、培養中の過剰なND6を除去します。
6. 焦点を調整し、接続された神経突起を持つ健康でよく広がるニューロンを含む適切な視野を見つけます。未解決の染料コロイドを含む領域は避けてください。
7. ND6負荷細胞を異なる露光時間でイメージングしてみて、最適なイメージング設定を特定してください。
   注:最適な露光時間を得るには、結果として得られる画像の最高ピクセル蛍光強度はビット範囲の約半分であり(たとえば、16ビット画像の場合、ビット範囲は0〜65,535です)、酸性浴溶液を塗布すると蛍光がさらに増加します。選択した露光時間は、すべてのND6イメージングに使用する必要があります。
8. 刺激と灌流のプロトコル、フレーム間隔、および合計時間を設定します。例えば、以下のプロトコルでは、30 秒のベースライン、10 秒の 30 Hz 電界刺激、50 秒の回復、120 秒の 90 mM K⁺、60 秒の回復、60 秒の NH₄Cl による 60 秒のチロード溶液、pH 5.5 での 60 秒のチロード溶液、フレーム間隔 3 秒を使用します。
9. 同期した刺激と灌流を伴う画像取得を開始します。イメージング中のシミュレーションと溶液交換を監視します。
10. イメージング終了後に灌流を停止し、カバーガラスを取り外し、次の試行のためにイメージングチャンバーを清掃します。

4. ND6蛍光の変化による膜輸送の定量化

1. すべての画像ファイルをバックアップまたは電子コピーします。
2. データ抽出用の解析プログラム(ImageJ²⁴ や FIJI²⁵ などのオープンソースの画像解析ソフトウェアなど)を選択します。
3. 画像スタックを開くか、解析プログラムにインポートします。
4. 最初の画像を基準として設定し、 Rigid Registration²⁶などの関数/プラグインを使用して残りをそれに揃えると、xyドリフトによるアーティファクトが軽減されます。画像の例については、 図 8 を参照してください。
5. 30秒のベースライン前で取得したすべての画像を平均して、参照画像を生成します。後で参照できるように、この画像のコピーを保存します。
6. 強度のしきい値を設定して、ベースライン平均化されたイメージからバイナリ イメージを生成します。
7. ImageJ の Watershed または別のプログラムの同様の関数を使用して、接続している神経突起または細胞を分離します。
8. 適切な領域サイズと真円度で 粒子分析 機能を使用して、細胞膜、エンドソーム、リソソーム、またはシナプスブートンに対応する関心領域(ROI)を求めます。選択したすべての ROI を保存します。
9. 視野内の無細胞領域にある 4 つの背景 ROI を選択します。
10. 画像スタックの各フレームで各 ROI の平均ピクセル強度を測定し、統計分析のために結果をエクスポートします。
11. バックグラウンド ROI の平均強度をベースライン ノイズとして計算し、各 ROI の平均ピクセル強度から差し引きます。
12. pH 5.5 Tyrodeの溶液を塗布した際に、選択した各ROIの3つの最も高い平均強度を平均して、正規化のために100%と定義される最大蛍光強度を求めます。
13. 50 mM NH₄Cl の適用中に、選択したすべての ROI について最も低い 3 つの平均強度を平均し、最小蛍光強度(正規化では 0% と定義)を設定します。
14. 各ROIの相対的な蛍光変化を、それ自身の0%および100%の強度に基づいて計算します。個々のROIデータから、平均蛍光変化、変化速度論、その他の値/プロットを導き出します。

結果

SVは、誘発されたエキソ/エンドサイトーシスを介した神経伝達物質の放出に特化しています²⁷。SVは内腔が酸性度が高く(pH 5.5)、ND6に最適です。ND6がSVにアクセスできるようにするために、SVエキソ/エンドサイトーシスを誘発するために高K⁺ 刺激を使用しました。予想通り、負荷後には神経突起に沿った明るい緑色の蛍光点状が現れた(図9A)。

ディスカッション

1,1′-ジオクタデシル-3,3,3′,3′-テトラメチルインドカルボシアニン(DiI)や3,3′-ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩(DiO)などの脂質系色素は、細胞形態の解明や、ニューロンの軸索突起などの細胞プロセスの追跡に長い間使用されてきました。FM1-43などのスチリル色素は、エキソサイトーシスの研究のために発明され、成功裏に使用されている³⁴。膜親和性が低?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digidata 1440A Data Acquistion System	Molecular Devices	Digidata 1440A	For synchronized stimulation and solution exchange
Dual Channel Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B	For live-cell imaging
Fetal Bovine Serum	OMEGA Scientific	FB-01	For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera	Hamamatsu Inc.	C13440-20CU	high-sensitivity camera
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma	H6648	For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Heated Platform	Warner Instruments	PH-1	For live-cell imaging
Matrigel	BD Biosciences	354234	For tissue culture
Micro-G Vibration Isolation Table	TMC	63-564	For live-cell imaging
Micro-manager	https://micro-manager.org/	NA	For image acquisition control
Multi-Line In-Line Solution Heater	Warner Instruments	SHM-6	For live-cell imaging
Neurobasal Plus Medium	THermoFisher Scientific	A3582901	For tissue culture
Nikon Ti-E Inverted Microscope	Nikon	Ti-E/B	For live-cell imaging
ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera	Hamamatsu	C1340-20CU	For live-cell imaging
Perfusion Chamber	Warner Instruments	RC-26G	For live-cell imaging
Six-Channel Valve Control Perfusion System	Warner Instruments	VC-6	For solution exchange
Square Pulse Stimulator	Grass Instrument	SD9	For electric field stimulation