Medición del recambio de lípidos de membrana con el análogo lipídico fluorescente sensible al pH ND6

Resumen

Este protocolo presenta un método de imagen de fluorescencia que utiliza una clase de fluoróforos lipídicos sensibles al pH para monitorear el tráfico de membranas lipídicas durante la exocitosis celular y el ciclo de endocitosis.

Resumen

La exo-/endocitosis es un proceso común que media el intercambio de biomoléculas entre las células y su entorno y entre diferentes células. Las células especializadas utilizan este proceso para ejecutar funciones vitales del cuerpo, como la secreción de insulina de las células β y la liberación de neurotransmisores de las sinapsis químicas. Debido a su importancia fisiológica, la exo-/endocitosis ha sido uno de los temas más estudiados en biología celular. Se han desarrollado muchas herramientas para estudiar este proceso a nivel de genes y proteínas, por lo que se sabe mucho sobre la maquinaria proteica que participa en este proceso. Sin embargo, se han desarrollado muy pocos métodos para medir el recambio lipídico de la membrana, que es la base física de la exocitosis.

Este artículo presenta una clase de nuevos análogos de lípidos fluorescentes que exhiben fluorescencia dependiente del pH y demuestra su uso para rastrear el reciclaje de lípidos entre la membrana plasmática y las vesículas secretoras. Con la ayuda de manipulaciones simples del pH, estos análogos también permiten la cuantificación de la distribución de lípidos a través de la superficie y los compartimentos de la membrana intracelular, así como la medición de la tasa de renovación de lípidos durante la exocitosis/endocitosis. Estos nuevos reporteros lipídicos serán de gran interés para diversos campos de investigación biológica, como la biología celular y la neurociencia.

Introducción

La bicapa lipídica es uno de los ensamblajes de biomoléculas más comunes y es indispensable para todas las células. Fuera de las células, forma la membrana plasmática que interconecta las células y su entorno; Dentro de las células, compartimenta varios orgánulos especializados para funcionalidades designadas. Más dinámicas que quietas, las membranas lipídicas experimentan constantemente fusión y fisión, lo que media el transporte de biomateriales, la reforma de orgánulos, el cambio morfológico y la comunicación celular. Sin duda, la membrana lipídica es la base física de casi todos los procesos celulares, y su disfunción juega un papel crucial en diversos trastornos que van desde el cáncer¹ hasta la enfermedad de Alzheimer². Aunque las moléculas lipídicas son mucho menos diversas que las proteínas, la investigación de membranas hasta ahora se ha centrado principalmente en las proteínas. Por ejemplo, se sabe mucho más sobre la maquinaria proteica que sobre los lípidos en la exocitosis ^3,4,5. Además, la organización, distribución, dinámica y homeostasis de los lípidos a través de las membranas superficiales e intracelulares permanecen en gran medida inexploradas en comparación con las proteínas de membrana⁶.

Esto no es sorprendente, ya que las técnicas modernas de biología molecular, como la mutagénesis, proporcionan una ventaja metodológica para estudiar proteínas en lugar de lípidos. Por ejemplo, el marcaje transgénico de la proteína verde fluorescente sensible al pH (también conocida como pHluorina) a las proteínas vesiculares facilita la medición cuantitativa de la cantidad y la tasa de recambio de proteínas vesiculares durante la exocitosis/endocitosis ^7,8,9. Sin embargo, es casi imposible modificar genéticamente los lípidos de membrana in vivo. Además, las manipulaciones cualitativas e incluso cuantitativas de las cantidades y distribuciones de proteínas son mucho más factibles que las de los lípidos¹⁰. Sin embargo, se han aislado y desarrollado lípidos fluorescentes nativos y sintéticos para simular lípidos de membrana endógena in vitro e in vivo¹¹. Un grupo de lípidos fluorescentes ampliamente utilizados son los colorantes de estirilo, por ejemplo, FM1-43, que exhiben fluorescencia mejorada por membrana y son una herramienta poderosa en el estudio de la liberación de vesículas sinápticas (SV) en las neuronas¹². Últimamente, los colorantes lipídicos sensibles al medio ambiente se han inventado y se han utilizado ampliamente como una nueva clase de reporteros para estudiar varias propiedades de la membrana celular, incluido el potencial de membrana¹¹, el orden de fase¹³ y la secreción¹⁴.

Se desarrolló una nueva clase de miméticos lipídicos cuya fluorescencia es sensible al pH (p. ej., pHluorin) y a la membrana (p. ej., FM1-43) para medir directamente la distribución de lípidos en la membrana plasmática y los endosomas/lisosomas y el tráfico de lípidos durante la exocitosis/endocitosis. Para ello, se seleccionaron los conocidos fluoróforos solvatocrómicos que presentan características push-pull debido a la transferencia de carga intramolecular. Entre los fluoróforos solvatocrómicos existentes, el andamio de 1,8-naftalimida (ND) es relativamente fácil de modificar, versátil para el etiquetado y es único en fotofísica¹⁵ y, por lo tanto, se ha utilizado en intercaladores de ADN, diodos emisores de luz orgánicos y sensores de biomoléculas 16,17,18.

La unión de un grupo donante de electrones a la posición C4 del andamio ND genera una estructura push-pull, que conduce a un aumento del momento dipolar mediante la redistribución de la densidad de electrones en el estado excitado^19,20. Tal transferencia de carga intramolecular produce grandes rendimientos cuánticos y desplazamientos de Stokes, lo que resulta en una fluorescencia brillante y estable²¹. Este grupo ha desarrollado recientemente una serie de análogos lipídicos solvatocrómicos basados en el andamio ND y los ha obtenido con buenos rendimientos sintéticos²⁰.

La caracterización espectroscópica muestra que, entre esos productos, el ND6 posee las mejores propiedades de fluorescencia (Figura 1)²⁰. En primer lugar, tiene picos de excitación y emisión bien separados (es decir, ~400 nm y ~520 nm, respectivamente, en la Figura 2A, B) en comparación con los fluoróforos populares como el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina o la GFP, lo que lo hace espectralmente separable de ellos y, por lo tanto, útil para la obtención de imágenes multicolor. En segundo lugar, la fluorescencia de ND6 exhibe un aumento de más de ocho veces en su fluorescencia en presencia de micelas (Figura 2C), lo que sugiere una fuerte dependencia de la membrana. Estudios previos de imágenes de fluorescencia de células vivas con diferentes tipos de células mostraron una excelente tinción de membrana por ND6²⁰. En tercer lugar, cuando el pH de la solución disminuye de 7,5 (que se encuentra comúnmente en ambientes extracelulares o citosólicos) a 5,5 (que se encuentra comúnmente en endosomas y lisosomas), ND6 muestra un aumento de aproximadamente el doble en la fluorescencia (Figura 2D), lo que muestra su sensibilidad al pH. Además, la simulación de dinámica molecular indica que ND6 se integra fácilmente en la bicapa lipídica con su andamio ND hacia afuera de la membrana y el residuo de piperazina muestra fuertes interacciones con los grupos principales de fosfolípidos (Figura 3). En conjunto, estas características hacen de ND6 un análogo lipídico fluorescente ideal para visualizar y medir el recambio lipídico de la membrana durante la exocitosis/endocitosis.

En este artículo se presenta un método para estudiar la tasa de recambio y la dinámica de los lípidos SV utilizando neuronas del hipocampo de ratón cultivadas. Al estimular las neuronas con soluciones de Tyrode con alto contenido de K⁺ , los SV y la membrana plasmática se cargaron con ND6 (Figura 4A, B). Posteriormente, las neuronas fueron reestimuladas con diferentes estímulos seguidos de soluciones de Tyrode que contienen NH₄Cl y pH 5,5 (Figura 4D). Este protocolo facilita la medición cuantitativa de las tasas de exocitosis y endocitosis ensambladas en diferentes circunstancias (Figura 4C).

Protocolo

El siguiente protocolo incluye (1) un procedimiento simplificado para establecer cultivos corticales y de hipocampo de ratón basado en un protocolo bien establecido²², (2) una breve introducción a una configuración de microscopio de epifluorescencia para neuronas vivas, (3) una descripción detallada de la carga y la obtención de imágenes de ND6 en neuronas de ratón, (4) una discusión sobre la cuantificación del tráfico de membrana por la señal ND6. Todos los procedimientos siguen las pautas de bioseguridad e IACUC en la Universidad Atlántica de Florida. La síntesis de ND6 ha sido descrita previamente²⁰.

1. Preparación de cultivos corticales e hipocampales de ratón

NOTA: Si no se especifica lo contrario, todos los pasos deben realizarse en una campana de flujo laminar de nivel 2 de bioseguridad. Esterilice todas las herramientas y materiales.

1. Use pinzas de tamaño 5 para colocar cubreobjetos de vidrio en placas de cultivo de pocillos múltiples.
   NOTA: Por ejemplo, una placa de 24 pocillos es ideal para cubreobjetos de 12 mm .
2. Añadir el volumen adecuado de matrices extracelulares para recubrir la superficie del cultivo celular (p. ej., 75 μL de solución de matriz de membrana basal por cubreobjetos de 12 mm ; véase la Tabla de Materiales)
3. Coloque las placas preparadas en la incubadora de cultivo de tejidos (5% CO₂, 100% de humedad y 37 °C) durante 1-4 h para permitir la reticulación de la matriz de la membrana basal.
4. Sacrificar a los animales, abrir el cráneo y transferir todo el cerebro a una placa de Petri de 35 mm con 3 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene un 20% de suero fetal bovino (H+20). Corte el cerebro a lo largo de la línea media y separe las cortezas y el hipocampo en una campana de disección de flujo laminar para reducir la contaminación.
5. Use microtijeras para cortar los pañuelos en trozos pequeños (~ 1 mm³). Transfiera esos tejidos a un tubo cónico de 15 mL que contenga 5 mL de H+20.
6. Lavar los tejidos tres veces con 5 mL de H+20 y tres veces con 5 mL de HBSS.
7. Añadir 1,5 mL de tripsina al 1% con ácido etilendiaminotetraacético e incubar a 37 °C durante 10 min para la digestión enzimática.
8. Repita el paso 1.6 y utilice el vacío para aspirar HBSS al final.
9. Disociar los tejidos mecánicamente en 1 mL de HBSS que contenga 2,95 g/L de MgSO₄•7H₂O utilizando una pipeta de vidrio pulido al fuego.
10. Centrifugar la suspensión celular a 400 × g, 4 °C durante 5 min.
11. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en un volumen adecuado de medios de cultivo para obtener una concentración de ~10.000.000 de células/ml.
12. Coloque las células en placas a ~1.000.000 de células/^cm2 y coloque el cultivo en la incubadora (5% de CO₂, 100% de humedad y 37 °C) durante 1-4 h para facilitar la fijación de las células a los cubreobjetos de vidrio.
13. Agregue un volumen apropiado de medio de cultivo (p. ej., 1 ml por pocillo para una placa de 24 pocillos). Añadir el mismo volumen de medio de cultivo después de 1 semana. Después de 2 semanas, reemplace la mitad del medio de cultivo existente con medios nuevos cada semana.

2. Configuración del microscopio para la obtención de imágenes de fluorescencia de células vivas

NOTA: Una configuración de imagen ejemplar (Figura 5) incluye al menos un microscopio de fluorescencia invertida (consulte la Tabla de Materiales), una fuente de luz de fluorescencia con obturador automático, juegos de filtros de fluorescencia (por ejemplo, para obtener imágenes de ND6, use 405/10 BP para la excitación, 495 LP para dicroica y 510/20 BP para la emisión) y una cámara de alta sensibilidad (Tabla de Materiales), todos los cuales están controlados por un software de adquisición de imágenes (Tabla de Materiales).

1. Prepare una cámara de imágenes que permita el control de la temperatura y la entrada/salida de la solución para la obtención de imágenes de fluorescencia de células vivas.
   NOTA: Por ejemplo, en este protocolo se utilizó una cámara de imágenes de baño abierto modificada fijada en una plataforma de calentamiento (Figura 6).
2. Configure un dispositivo programable para cambiar las soluciones de perfusión y administrar el estímulo eléctrico en puntos de tiempo definidos durante la obtención de imágenes.
   NOTA: La sincronización de hardware y software es necesaria para los análisis cuantitativos (Figura 7). Por ejemplo, en este protocolo, se utilizó una salida de disparo de la cámara de imágenes para iniciar un programa informático que controla un dispositivo de conmutación automática, que controla un sistema de perfusión multicanal y un estimulador de pulso cuadrado.
3. Para obtener imágenes conjuntas de dos o más reporteros fluorescentes, realice imágenes de fluorescencia multicanal, ya sea cambiando secuencialmente los conjuntos de filtros o dividiendo simultáneamente diferentes emisiones de fluorescencia y proyectándolas en la misma cámara.

3. Carga e imagen de ND6 en cultivos neuronales

1. Pesar una cantidad adecuada de ND6, disolverlo en dimetilsulfóxido (DMSO) y dejar que se solubilice a temperatura ambiente; Sonicate brevemente (p. ej., 3 min). Filtre la solución madre cruda con un filtro de 0,22 μm para eliminar los agregados de colorante grandes. Después de la filtración, determine la concentración de colorante mediante espectroscopia de absorción a 405 nm utilizando un espectrofotómetro convencional o de microvolumen utilizando ε = 10.700 ^{M-1 cm-1}.
2. Antes de la aplicación, diluir la solución madre a una concentración de 1 μM utilizando la solución de baño. Mantenga la solución madre a temperatura ambiente en la oscuridad.
3. Marcaje de endosomas y vesículas sinápticas
   1. Para etiquetar de forma ubicua compartimentos de membrana endocitados, como endosomas, añadir solución madre de ND6 (p. ej., 1 mM en DMSO) al medio de cultivo a la concentración final de 1 μM e incubar al 5 % de CO₂, 100 % de humedad y 37 °C durante 30 min. Para reducir el alcance del marcaje SV, suprimir farmacológicamente la actividad neuronal espontánea. Por ejemplo, utilizar la tetrodotoxina para bloquear los potenciales de acción o el ácido 2,3-dioxo-6-nitro-1,2,3,4-tetrahidrobenzo[f]quinoxalina-7-sulfonamida (NBQX) y el ácido D-(-)-2-amino-5-fosfonopentanoico (D-AP5) para inhibir la transmisión excitatoria²³.
   2. Para etiquetar selectivamente los SV, utilice una estimulación breve pero fuerte para evocar la exo/endocitosis presináptica. En primer lugar, transfiera la(s) cubreobjeto(s) de cultivo a una placa de Petri de 35 mm que contenga 2 ml de solución normal de Tyrode a temperatura ambiente. En segundo lugar, diluir la solución madre de ND6 en una solución de Tyrode con alto contenido de K⁺ (90 mM de KCl) a la concentración final de 1 μM. En tercer lugar, reemplace la solución normal de Tyrode en la placa de Petri con una solución de Tyrode con alto contenido de K⁺ que contenga ND6 e incube a temperatura ambiente durante 2 minutos.
4. Transfiera el cultivo celular marcado con ND6 a la cámara de imágenes llena de solución de Tyrode normal precalentada que contiene 10 μM de NBQX y 10 μM de D-AP5.
5. Ajuste la velocidad de perfusión a ~0,2 mL/s (es decir, 1 gota por segundo) e inicie la perfusión de la solución normal precalentada de Tyrode que contiene NBQX y D-AP5 para eliminar el exceso de ND6 en el cultivo.
6. Ajuste el enfoque y localice el campo de visión apropiado que contenga neuronas sanas y bien distribuidas que lleven neuritas conectadas. Evite las áreas que contengan coloides de colorante no resueltos.
7. Pruebe la obtención de imágenes de células cargadas de ND6 con diferentes tiempos de exposición para identificar los mejores ajustes de imagen.
   NOTA: Para obtener el mejor tiempo de exposición, la intensidad de fluorescencia de píxeles más alta en la imagen resultante es aproximadamente la mitad del rango de bits (por ejemplo, para una imagen de 16 bits, el rango de bits es de 0 a 65,535), lo que permitirá un aumento adicional de la fluorescencia cuando se aplique la solución de baño ácido. El tiempo de exposición seleccionado debe utilizarse para todas las imágenes ND6.
8. Establezca el protocolo de estimulación y perfusión, el intervalo de fotogramas y la duración total. Por ejemplo, en el siguiente protocolo, utilice una línea de base de 30 s, una estimulación de campo eléctrico de 10 s a 30 Hz, una recuperación de 50 s, 120 s 90 mM K⁺, una recuperación de 60 s, una solución de Tyrode de 60 s con 50 mM de_{NH 4}Cl, una solución de Tyrode de 60 s a pH 5,5 y un intervalo de fotogramas de 3 s.
9. Iniciar la adquisición de imágenes acompañada de la estimulación y perfusión sincronizadas. Supervise la simulación y el intercambio de soluciones durante la obtención de imágenes.
10. Detenga la perfusión después de que finalicen las imágenes, retire el cubreobjetos y limpie la cámara de imágenes para el siguiente ensayo.

4. Cuantificación del tráfico de membranas mediante un cambio en la fluorescencia de ND6

1. Realice una copia de seguridad y/o haga una copia electrónica de todos los archivos de imagen.
2. Elija un programa de análisis para la extracción de datos, por ejemplo, un software de análisis de imágenes de código abierto como ImageJ²⁴ y/o FIJI²⁵.
3. Abra o importe una pila de imágenes en el programa de análisis.
4. Establezca la primera imagen como referencia y alinee el resto con ella utilizando funciones/complementos como Rigid Registration²⁶, que mitigará los artefactos debidos a la deriva xy. Consulte la Figura 8 para ver imágenes de ejemplo.
5. Promedie todas las imágenes adquiridas durante los 30 s previos a la línea de base para producir una imagen de referencia. Guarde una copia de esta imagen para futuras consultas.
6. Establezca el umbral de intensidad para generar una imagen binaria a partir de la imagen promediada de línea base.
7. Utilice Watershed en ImageJ o funciones similares en otro programa para separar las neuritas o células conectadas.
8. Utilice la función Analizar partícula con el tamaño de área y la circularidad adecuados para solicitar regiones de interés (ROI) correspondientes a membranas celulares, endosomas, lisosomas o botones sinápticos. Guarde todos los ROI seleccionados.
9. Seleccione cuatro ROI de fondo en regiones sin celdas dentro del campo de visión.
10. Mida las intensidades medias de píxeles de cada ROI en cada fotograma de la pila de imágenes y exporte los resultados para su análisis estadístico.
11. Calcule la intensidad media de las ROI de fondo como el ruido de referencia, que se restará de las intensidades de píxel promedio para cada ROI.
12. Promedie las tres intensidades medias más altas para cada ROI seleccionado durante la aplicación de la solución de Tyrode pH 5.5 para obtener la intensidad de fluorescencia máxima, que se define como 100% para la normalización.
13. Promedie las tres intensidades medias más bajas para cada ROI seleccionado durante la aplicación de 50 mM NH₄Cl para establecer la intensidad de fluorescencia mínima, que se define como 0% para la normalización.
14. Calcule los cambios de fluorescencia relativos para cada ROI en función de sus propias intensidades de 0% y 100%. Derive los cambios medios de fluorescencia, la cinética de los cambios y otros valores/gráficos a partir de los datos individuales de ROI.

Resultados

Los SV están especializados para la liberación de neurotransmisores a través de exocitosis evocada²⁷. Los SV tienen un lumen muy ácido (es decir, pH 5,5), que es ideal para el ND6. Utilizamos estimulación alta de K⁺ para evocar exo-/endocitosis SV con el fin de permitir que ND6 accediera a SV. Como era de esperar, aparecieron puntos fluorescentes de color verde brillante a lo largo de los procesos neuronales después de la carga (Figura 9A). El perfil ...

Discusión

Los colorantes a base de lípidos, como el 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina (DiI) y el perclorato de 3,3′-dioctadeciloxacarbocianina (DiO), se han utilizado durante mucho tiempo para ilustrar la morfología celular y rastrear procesos celulares como las proyecciones axónicas de las neuronas. Los colorantes de estirilo, como el FM1-43, se han inventado y utilizado con éxito para el estudio de la exocitosis³⁴. Debido a su baja afinidad con la membrana, etiquetan select...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digidata 1440A Data Acquistion System	Molecular Devices	Digidata 1440A	For synchronized stimulation and solution exchange
Dual Channel Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B	For live-cell imaging
Fetal Bovine Serum	OMEGA Scientific	FB-01	For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera	Hamamatsu Inc.	C13440-20CU	high-sensitivity camera
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma	H6648	For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Heated Platform	Warner Instruments	PH-1	For live-cell imaging
Matrigel	BD Biosciences	354234	For tissue culture
Micro-G Vibration Isolation Table	TMC	63-564	For live-cell imaging
Micro-manager	https://micro-manager.org/	NA	For image acquisition control
Multi-Line In-Line Solution Heater	Warner Instruments	SHM-6	For live-cell imaging
Neurobasal Plus Medium	THermoFisher Scientific	A3582901	For tissue culture
Nikon Ti-E Inverted Microscope	Nikon	Ti-E/B	For live-cell imaging
ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera	Hamamatsu	C1340-20CU	For live-cell imaging
Perfusion Chamber	Warner Instruments	RC-26G	For live-cell imaging
Six-Channel Valve Control Perfusion System	Warner Instruments	VC-6	For solution exchange
Square Pulse Stimulator	Grass Instrument	SD9	For electric field stimulation