JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوثق هذا العمل طريقة بسيطة لإنشاء ضوابط مستضدات اصطناعية للكيمياء النسيجية المناعية. هذه التقنية قابلة للتكيف مع مجموعة متنوعة من المستضدات في مجموعة واسعة من التركيزات. وتوفر العينات مرجعا لتقييم الأداء وقابلية التكرار داخل وبين المقايسة.

Abstract

توفر اختبارات الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) رؤى قيمة حول أنماط التعبير عن البروتين ، والتي يتطلب تفسيرها الموثوق به عينات تحكم إيجابية وسلبية مميزة بشكل جيد. نظرا لأن عناصر التحكم المناسبة في الأنسجة أو خطوط الخلايا ليست متوفرة دائما، فقد تكون هناك طريقة بسيطة لإنشاء عناصر تحكم اصطناعية في المدينة العالمية للخدمات الإنسانية مفيدة. يتم وصف هذه الطريقة هنا. وهو قابل للتكيف مع أنواع المستضدات المختلفة ، بما في ذلك البروتينات أو الببتيدات أو oligonucleotides ، في مجموعة واسعة من التركيزات. يشرح هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لإنشاء ضوابط مستضدات اصطناعية ، باستخدام كمثال على ذلك الببتيد من المجال الورمي البشري B2 (ERBB2 / HER2) داخل الخلايا (ICD) المعترف به من قبل مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة ذات الصلة تشخيصيا. يتم خلط التخفيفات التسلسلية لببتيد HER2 ICD في محلول ألبومين مصل البقر (BSA) مع الفورمالديهايد وتسخينه لمدة 10 دقائق عند 85 درجة مئوية لتصلب وربط خليط الببتيد / BSA. يمكن معالجة الجل الناتج وتقسيمه وتلوينه مثل الأنسجة ، مما ينتج عنه سلسلة من العينات من تركيزات المستضدات المعروفة التي تغطي مجموعة واسعة من شدة التلطيخ.

يتوافق هذا البروتوكول البسيط مع إجراءات مختبر الأنسجة الروتينية. تتطلب الطريقة فقط أن يكون لدى المستخدم كمية كافية من المستضد المطلوب. يمكن تصنيع البروتينات المؤتلفة أو مجالات البروتين أو الببتيدات الخطية التي تشفر الظواهر ذات الصلة محليا أو تجاريا. يمكن للمختبرات التي تولد أجساما مضادة داخلية أن تحتفظ بحصص من مستضد التحصين كهدف للتحكم الاصطناعي. تتيح فرصة إنشاء ضوابط إيجابية محددة جيدا عبر مجموعة واسعة من التركيزات للمستخدمين تقييم أداء الفحص داخل المختبر وفيما بينه ، واكتساب نظرة ثاقبة على النطاق الديناميكي والخطية لمقايساتهم ، وتحسين ظروف الفحص لأهدافهم التجريبية الخاصة.

Introduction

تسمح الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) بالكشف الحساس والمحدد والدقيق مكانيا عن المستضدات المستهدفة في أقسام الأنسجة الثابتة بالفورمالين والبارافين (FFPE). ومع ذلك ، قد تتأثر نتائج تلطيخ IHC بمتغيرات متعددة ، بما في ذلك وقت نقص التروية الدافئ والبارد ، وتثبيت الأنسجة ، والمعالجة المسبقة للأنسجة ، وتفاعل الأجسام المضادة وتركيزها ، وكيمياء الكشف عن المقايسة ، وأوقات التفاعل1. وبناء على ذلك، يتطلب الأداء والتفسير القابلان للتكرار لتفاعلات المدينة العالمية للخدمات الإنسانية رقابة صارمة على هذه المتغيرات واستخدام عينات تحكم إيجابية وسلبية مميزة بشكل جيد. تشمل عناصر التحكم المستخدمة بشكل متكرر الأنسجة المضمنة في البارافين أو خطوط الخلايا المستزرعة المعروفة من التحليلات المستقلة للتعبير عن المستضد المثير للاهتمام ، ولكن هذه العينات ليست متاحة دائما1. علاوة على ذلك ، فإن مستويات التعبير عن المستضدات المستهدفة في الأنسجة وضوابط خط الخلية مفهومة بشكل عام نوعيا فقط وقد تكون متغيرة. يمكن أن تساعد الضوابط التي تحتوي على تركيزات قابلة للتكرار ومعروفة بدقة من المستضد المستهدف في تحسين ظروف تفاعل المدينة العالمية للخدمات الإنسانية. وقد وصف المؤلفون2 طريقة عامة قابلة للتكيف مع مجموعة متنوعة من أنواع المستضدات في مجموعة من التركيزات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية لإنشاء عينات تحكم اصطناعية من المدينة العالمية للخدمات الإنسانية. يتم توفير بروتوكول مفصل هنا لإنشاء واستخدام هذا النوع من المعايير.

الضوابط المناسبة ضرورية للتفسير الصحيح لمقايسات المدينة العالمية للخدمات الإنسانية1،3،4. تم استخدام الأنسجة والخلايا المستزرعة والركائز المغلفة بالببتيد كضوابط تابعة للمدينة العالمية للخدمات الإنسانية وفقا للاحتياجات المحددة للمحققين. وقد نوقشت على نطاق واسع المزايا والقيود الكامنة في استخدام الأنسجة كضوابط المدينة العالمية للخدمات الإنسانية 1,4. بالنسبة للعديد من الأجسام المضادة، يمكن اختيار الضوابط المناسبة من أنسجة طبيعية مختارة تحتوي على مجموعات خلايا تعبر عن المستضد المستهدف على نطاق ديناميكي واسع. تكون ضوابط الأنسجة أقل ملاءمة عندما لا يكون المستضد المستهدف مميزا بشكل جيد فيما يتعلق بموقع التعبير أو وفرته ، أو عندما يتم التعبير عن المستضدات التي يحتمل أن تكون متقاطعة التفاعل في نفس الخلايا أو مواقع الأنسجة. في هذه السياقات ، يمكن أن تكون كتل خطوط الخلايا المستزرعة التي تعبر عن مستضد الاهتمام مفيدة. لتوفير مزيد من الأدلة على خصوصية الهدف ، يمكن تصميم خطوط الخلايا على مستضدات الهدف الزائدة أو الناقصة. على سبيل المثال ، تم استخدام هذا النهج مؤخرا لتقييم مجموعة متنوعة من الفحوصات المضادة ل PD-L1 باستخدام مصفوفة دقيقة من الأنسجة من خطوط الخلايا متساوية المنشأ التي تعبر عن مجموعة من مستضد PD-L15. تشمل القيود العملية على الاستخدام الروتيني لكتل خطوط الخلايا التكلفة والوقت اللازمين لإنتاج أعداد كافية من الخلايا وحقيقة أن التعبير عن بعض المستضدات قد لا يكون متسقا بشكل موثوق ، حتى داخل خطوط الخلايا النسيلة6. الببتيدات الاصطناعية هي خيار ثالث لضوابط IHC للأجسام المضادة التي تتعرف على الظواهر الخطية القصيرة. نشر ستيفن بوجين وزملاؤه على نطاق واسع حول استخدام الببتيدات إلى جانب سطح الشرائح الزجاجية 7,8 والخرز الزجاجي9. أظهرت إحدى الدراسات التي أجرتها هذه المجموعة أن التحليل الكمي لضوابط المدينة العالمية للخدمات الإنسانية القائمة على الببتيد يمكن أن يكشف عن تباين عملية التلطيخ الذي غاب عنه التقييم النوعي لضوابط الأنسجة التي تم تحليلها بالتوازيمع 10. في حين أن المعايير التي تستخدم المستضدات القائمة على الخرز يمكن أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع ، فإن العديد من التفاصيل مملوكة للمؤلفين ، مما يحد من التبني على نطاق واسع.

وهناك نهج آخر لمعايير المدينة العالمية للخدمات الإنسانية يدمج المستضدات المستهدفة في المواد الهلامية البروتينية المصطنعة. تم إثبات هذا المفهوم لأول مرة من قبل بير براندتزايج في عام 1972 في دراسة تم فيها بلمرة مصل الأرانب الطبيعي باستخدام الجلوتارالدهيد11. ثم تم نقع كتل صغيرة من الجل الناتج لمدة 1-4 أسابيع في محاليل تحتوي على مستضدات الغلوبولين المناعي ذات الأهمية بتركيزات مختلفة. بعد تثبيت الكحول وتضمين البارافين ، تبين أن أجزاء من عناصر التحكم الناتجة تلطخ بكثافة تتوافق مع لوغاريتم محاليل المستضدات التي تم نقعها فيها. في وقت لاحق ، أعد الباحثون اقترانات glutaraldehyde من الأحماض الأمينية المحددة في المحاليل المخففة BSA أو متجانسة الدماغ كضوابط إيجابية في دراسات المجهر الإلكتروني المناعي12,13. بحث عمل أحدث في استخدام المواد الهلامية المصنوعة من محاليل البروتين الثابتة الفورمالديهايد كبدائل لأنسجة FFPE في تحليل الطيف الكتلي14. بحث عمل حديث آخر في بنية وخصائص المواد الهلامية التي تشكلت عن طريق تسخين محاليل ألبومين مصل الإنسان أو البقر بتركيزات مختلفة ودرجة الحموضة15. وجد هؤلاء المؤلفون أن ألبومين المصل يشكل ثلاثة أنواع من المواد الهلامية تختلف في المرونة الميكانيكية ، والحفاظ على البنية الثانوية ، والقدرة على ربط الأحماض الدهنية اعتمادا على الظروف التجريبية. وتبين هذه الورقات مجتمعة الجدوى العامة للنهج المستخدم هنا. تخلق محاليل البروتين ذات التركيب المحدد مواد هلامية تشبه الأنسجة يمكن معالجتها وتقسيمها وتلوينها باستخدام الطرق النسيجية الروتينية.

يصف هذا البروتوكول تشكيل عنصر تحكم اصطناعي في المدينة العالمية للخدمات الإنسانية مصنوع من ألبومين مصل البقر (BSA) المبلمر بالحرارة والفورمالديهايد. يمكن أن تتضمن المواد الهلامية مجموعة واسعة من المستضدات ، بما في ذلك البروتينات كاملة الطول ، ومجالات البروتين ، والببتيدات الخطية ، بالإضافة إلى المستضدات غير البروتينية بما في ذلك oligonucleotides2. يستخدم هذا العرض التوضيحي مثالا على مستضد الببتيد الخطي الذي يشفر الأحماض الأمينية C-terminal 16 لبروتين ERBB2 البشري (HER2 / neu) TPTAENPEYLGLDVPVV-COOH (انظر جدول المواد). يتضمن هذا التسلسل الظواهر التي تم التعرف عليها من قبل ثلاثة أجسام مضادة متاحة تجاريا وذات صلة تشخيصية بما في ذلك كاشف Herceptest متعدد النسيلة (ENPEYLGLDVP) والأجسام المضادة وحيدة النسيلة CB11 (AENPEYL) و 4B5 (TAENPEYLGL) (انظر جدول المواد)16.

تستخدم الطريقة الموضحة هنا كواشف متاحة بسهولة باستخدام عمليات وتقنيات مألوفة لأي مختبر ممارس لعلم الأنسجة. ويتمثل أهم قيد في الحاجة إلى تحديد المستضدات المستهدفة وشرائها، وهو ما يمكن تحقيقه في كثير من الحالات بتكلفة متواضعة نسبيا. نظرا لأن هذه الضوابط الاصطناعية ذات تركيبة محددة بالكامل ومصنوعة بطرق بسيطة ، يمكن تنفيذها في العديد من المختبرات بنتائج قابلة للتكرار. وقد يسهل استخدامها التقييم الموضوعي القابل للقياس الكمي لنتائج تلطيخ المدينة العالمية للخدمات الإنسانية ويسمح بمزيد من التكرار داخل المختبرات وفيما بينها.

Protocol

1. إعداد حلول وأدوات المخزون

  1. تحضير 20 مل من محلول BSA 25٪ w / v عن طريق خلط 5 غرام من مسحوق BSA في 14 مل من PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.2 في أنبوب مخروطي 50 مل حتى يتم تشتيته بالتساوي. دوامة حسب الضرورة لتفريق مسحوق BSA.
    1. حافظ على المحلول بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية للسماح بالذوبان الكامل. اضبط الحجم النهائي إلى 20 مل باستخدام PBS لإنشاء حل مخزون w/v بنسبة 25٪.
  2. تحضير 20 مل من محلول BSA 31.3٪ w / v عن طريق خلط 6.26 غرام من مسحوق BSA في 13 مل من PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.2 في أنبوب مخروطي 50 مل حتى يتم تشتيته بالتساوي. حافظ على المحلول بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية للسماح بالذوبان الكامل. اضبط الحجم النهائي إلى 20 مل باستخدام PBS لإنشاء حل مخزون w/v بنسبة 31.3٪.
  3. سخني كتلة الحرارة إلى 85 درجة مئوية.
    ملاحظة: ينشئ البروتوكول أدناه مواد هلامية من الببتيد / BSA بأحجام تتراوح بين 1.26 و 1.4 مل تتشكل في أنابيب أجهزة طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل. لاستخدام كميات أصغر ، على سبيل المثال ، عندما تكون مخزونات المستضدات محدودة ، قم بإعداد المواد الهلامية في أنابيب PCR واستخدم جهاز تدوير حراري مضبوط على 85 درجة مئوية ككتلة حرارية.
  4. اختبر أن خليط BSA / الفورمالديهايد يشكل هلام كما هو متوقع عن طريق خلط 700 ميكرولتر من محلول BSA 25٪ مع 700 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 37٪. تخلط جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5 مرات في غضون 5-10 ثوان. تجنب خلق فقاعات الهواء.
    تحذير: الفورمالديهايد المركز سام. استخدام مع احتياطات السلامة المناسبة.
  5. مباشرة بعد خلط محاليل BSA والفورمالديهايد ، ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق المغلق في كتلة حرارية عند 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة الأنبوب من كتلة الحرارة واتركه ليبرد. تأكد من أن الجل قد تشكل كما هو متوقع.

2. إعداد وتخفيف الببتيدات

  1. الحصول على 5-20 ملغ من الببتيد المجفف بالتجميد من التسلسل المطلوب.
    ملاحظة: الأحماض الأمينية C-terminal 16 للمجال البشري ERBB2 داخل الخلايا المعترف بها بواسطة 4B5 هي TPTAENPEYLGLDVPV-COOH.
    1. أضف 4 أحماض أمينية إلى N-terminus و acetyl-YGSG و C-terminus و GSGC-amide لتسهيل الربط المتبادل للببتيد ب BSA وتوفير التباعد بين جزيء BSA وظهارة الببتيد.
      ملاحظة: التسلسل الكامل هو: أسيتيل-YGSGTPTAENPEYLGLDVPVGSGC-amide.
    2. إذا رغبت في ذلك ، استخدم تسلسلات الأحماض الأمينية الطرفية N و C الأخرى لتوسيع ظهارة الببتيد الأساسية.
      ملاحظة: يختلف تأثير التسلسلات المختلفة باختلاف مجموعات الأجسام المضادة/الظهارة. إضافة الببتيد الطرفي C يقلل من ارتباط بعض الأجسام المضادة بالظواهر الطرفية C. في مثل هذه الحالات ، احذف هذا التسلسل.
    3. تأكد من أن الببتيدات من المصادر التجارية يتم توفيرها بنقاء >95٪ ، ويتم تأكيد تكوينه من خلال تحليل HPLC وقياس الطيف الكتلي.
  2. احسب الأحجام اللازمة لحلول مخزون الببتيد 5x (1.25 E-2 M). بالإشارة إلى الجدول 1 ، الأعمدة C-E ، أدخل قيما للوزن الجزيئي للمستضد (g / mole) ، والنسبة المئوية لنقاء المستضد (0-100) ، وكتلة المستضد (mg).
    ملاحظة: حجم المذيب (بالميكرولتر) لإعادة تعليق العينة لتحقيق محلول مخزون 1.25 E-2 M هو 800 × الوزن الجزيئي للمستضد × النسبة المئوية لنقاء المستضد / كتلة المستضد.
    1. قم بإعداد ثمانية أنابيب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ولصقها بوضوح.
      ملاحظة: ستحتوي الأنابيب على 5 أضعاف مخزون الببتيد في مذيب ، و 1 × مخزون الببتيد في المذيب ، وخمسة تخفيفات تسلسلية 10 أضعاف من 2.5 E-4 M إلى 2.5 E-8 M الببتيد / BSA / الفورمالديهايد هلام ، وهلام التحكم السلبي الذي يحتوي على BSA / الفورمالديهايد يفتقر إلى مستضد إضافي. جميع عينات الجل تبدو متطابقة. عند إعداد مجموعات متعددة من تخفيفات الببتيد في وقت واحد ، احرص على تسمية وتحديد جميع الأنابيب ومعالجة الكاسيت بشكل صحيح. استخدم أنابيب الطرد المركزي الدقيق المرمزة بالألوان وأشرطة المعالجة حيثما أمكن لتقليل سوء التعريف.
  3. قم بإعداد محلول مخزون الببتيد 5x عند 1.25 E-2 M عن طريق تعليق الكتلة الكاملة من الببتيد المجفف بالتجميد (20 ملغ لببتيدات ERBB2) في 60 ميكرولتر من المذيب المناسب.
    ملاحظة: في هذا المثال، تمت إضافة ثنائي ميثيل فورماميد (DMF) مباشرة إلى حاوية المورد.
    1. افحص المحلول للتأكد من أن الببتيد يذوب تماما. إذا لزم الأمر ، أضف مذيبا إضافيا و / أو سونيك العينة حتى يذوب الببتيد تماما ، مع الحرص على عدم تجاوز الحجم المحسوب في الجدول 1 لمخزون الببتيد 5x.
      تحذير: DMF سامة. استخدام مع الاحتياطات المناسبة.
      ملاحظة: اعتمادا على تسلسل الأحماض الأمينية ، وكره الماء والشحنة المقابلة ، قد تكون الببتيدات قابلة للذوبان في DMF أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) أو الماء النقي أو المحاليل المخففة لحمض الخليك أو حمض الفورميك أو بيكربونات الأمونيوم. يمكن حساب خصائص الببتيد باستخدام مجموعة متنوعة من الأدوات عبر الإنترنت17. قد يقترح بعض بائعي الببتيد مذيبات مناسبة لتسلسلات محددة.
    2. أضف المذيب حسب الضرورة لجلب حجم مخزون الببتيد 5x إلى الحجم النهائي المحسوب في الجدول 1. دوامة لمدة 5 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة عند 5000 × غرام لمدة 5 ثوان. يمكن تخزين حلول مخزون الببتيد عند -80 درجة مئوية.
  4. بالإشارة إلى الجدول 2 ، العمود C ، قم بإعداد 150 ميكرولتر من محلول مخزون الببتيد 1x (2.5 E-3 M) عن طريق تخفيف 30 ميكرولتر من مخزون الببتيد 5x إلى 120 ميكرولتر من المذيبات (DMF هذا المثال). دوامة لمدة 5 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة عند 5000 × غرام لمدة 5 ثوان.
  5. بالإشارة إلى الجدول 2، العمود دال، قم بإعداد 700 ميكرولتر من محلول الببتيد E-4 M/BSA 5 (التخفيف 1) عن طريق تخفيف 140 ميكرولتر من مخزون الببتيد 1x إلى 560 ميكرولتر من 31.3٪ BSA/PBS، الرقم الهيدروجيني 7.2. دوامة لمدة 5 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة عند 5000 × غرام لمدة 5 ثوان.
    ملاحظة: تركيز BSA النهائي لهذا المحلول هو 25٪ (ث / v).
  6. بالإشارة إلى الجدول 2، الأعمدة E-H، تعد أربعة تخفيفات تسلسلية متتالية بمعدل 10 أضعاف لمخزون الببتيد E-4 M/BSA 5 بإضافة 70 ميكرولتر من محلول الببتيد/BSA إلى 630 ميكرولتر بنسبة 25 في المائة BSA/PBS، درجة الحموضة 7.2. دوامة لمدة 5 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة عند 5000 × غرام لمدة 5 ثوان.
    ملاحظة: بعد هذه الخطوة ، سيكون هناك خمسة تخفيفات تسلسلية 10 أضعاف من الببتيد (5 E-4 M إلى 5 E-8 M) في 25٪ BSA / PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.2. ستحتوي العينات الأربع الأولى على 630 ميكرولتر. ستحتوي العينة الأخيرة على 700 ميكرولتر.
  7. بالرجوع إلى الجدول 2، العمود الأول، قم بإعداد عينة BSA ذات تحكم سلبي تحتوي على 700 ميكرولتر بنسبة 25٪ BSA/PBS، الرقم الهيدروجيني 7.2 (الشكل 1A).

3. إعداد المواد الهلامية BSA-الببتيد

  1. تأكد من أن كتلة الحرارة أو التدوير الحراري مستقرة عند 85 درجة مئوية.
  2. راجع الجدول 3، الأعمدة من باء إلى هاء. العمل عينة واحدة في كل مرة، إضافة إلى أول 25٪ BSA / الببتيد عينة (تخفيف 1) 630 ميكرولتر من 37٪ الفورمالديهايد. تخلط جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5 مرات في غضون 5-10 ثوان. تجنب خلق فقاعات الهواء.
    تحذير: الفورمالديهايد المركز سام. استخدام مع احتياطات السلامة المناسبة.
    1. بعد خلط محاليل الببتيد / BSA والفورمالديهايد ، ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق المغلق في كتلة حرارية عند 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: امزج محلول الببتيد BSA والفورمالديهايد جيدا ، ولكن لا تنفق أكثر من 10 ثوان في سحب الخليط قبل وضع العينة على النار. نظرا لأن ربط الفورمالديهايد يبدأ على الفور ، فقد يتشكل الجل بشكل مختلف إذا كان الإجراء مختلفا لعينات مختلفة. تركيز BSA النهائي في هذه المواد الهلامية هو 12.5٪ (ث / v). تركيزات BSA النهائية أقل من 10٪ قد تنتج المواد الهلامية التي لا تتصلب. تركيزات BSA النهائية أكبر من 16٪ قد تنتج المواد الهلامية أكثر هشاشة ويصعب تقسيمها بعد المعالجة.
    2. كرر الخطوتين 3.2 و3.2.1 لكل من التخفيفات 2-4.
    3. كرر الخطوتين 3.2 و 3.2.1 للتخفيف 5 ، ولكن أضف 700 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 37٪ ، وهو حجم يساوي 700 ميكرولتر من محلول مستضد BSA.
    4. ارجع إلى عمود الجدول 3 العمود زاي؛ كرر الخطوتين 3.2 و 3.2.1 لعينة التحكم السالبة ، مع إضافة 700 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 37٪ ، وهو حجم يساوي 700 ميكرولتر من محلول BSA للتحكم السلبي.
  3. قم بإزالة الأنابيب من كتلة الحرارة بعد 10-12 دقيقة. يجب أن يكون وقت التسخين متسقا قدر الإمكان لكل عينة. اترك المواد الهلامية تبرد على سطح الطاولة لمدة 5-10 دقائق (الشكل 1B).
  4. باستخدام ملعقة مختبرية نظيفة ومرنة يمكن التخلص منها ، قم بإزالة عينة الجل في قطعة واحدة من أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، وضعها في حاوية مغلقة تحتوي على ما لا يقل عن 15 مل من الفورمالين المحايد المخزن مؤقتا (NBF) ، باستخدام حاوية منفصلة من NBF لكل عينة.
    1. بدلا من ذلك ، اقطع الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق بشفرة حلاقة جديدة أحادية الحافة ، وادفع الجل من الأسفل بالهواء أو مسبار مناسب (الشكل 1C-G).
      ملاحظة: يمكن أن تبقى المواد الهلامية المتصلب من الفورمالديهايد / BSA في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 24 ساعة. يمكن أن يؤدي ترك المواد الهلامية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق لأكثر من 24 ساعة إلى أن تصبح هشة وأكثر صعوبة في المعالجة والتقسيم.

4. تشذيب ومعالجة وتضمين المواد الهلامية BSA

  1. قم بقص مخروط الجل إلى أقراص أسطوانية بسماكة 5 مم تقريبا باستخدام ماكينة حلاقة نظيفة أحادية الحافة (الشكل 1H ، I). قم بلف الأقراص في غلاف خزعة ، ووضع قرص هلام أكبر في كاسيت واحد (لاستخدامه في الدراسة التجريبية في الخطوة 5) ، وأقراص الجل المتبقية معا في كاسيت ثان (الشكل 2A ، E) للاستخدام في بناء microarray الأنسجة (TMA) في الخطوة 6. ضع أقراص الجل الملفوفة في أشرطة معالجة الأنسجة ذات العلامات الواضحة.
    1. ضع المواد الهلامية المحشوة بالكاسيت في 15 مل على الأقل من 10٪ NBF لكل عينة هلام قبل المعالجة ، باستخدام حاوية منفصلة من NBF لكل عينة. يمكن أن تبقى المواد الهلامية في 10٪ NBF لمدة 6-48 ساعة.
  2. قم بمعالجة المواد الهلامية في معالج الأنسجة الآلي ، باتباع جدول زمني كبير للأنسجة مع الضغط والفراغ. تستغرق كل خطوة 1 ساعة: 10٪ NBF ، 70٪ إيثانول ، 95٪ إيثانول (كرر مرتين) ، 100٪ إيثانول (كرر مرتين) ، زيلين (كرر ثلاث مرات) ، بارافين عند 60 درجة مئوية (كرر ثلاث مرات).
    ملاحظة: بالنسبة للمحققين الذين يختارون معالجة العينات يدويا، اتبع نفس تسلسل الكواشف والأوقات.
  3. عند اكتمال معالجة العينة، قم بإزالة الكاسيت من معالج الأنسجة وانقلها إلى مركز تضمين البارافين.
  4. قم بفك المواد الهلامية من غلاف الخزعة وتضمين المواد الهلامية في البارافين. لكل عينة، قم بتضمين قرص واحد من الجل في قالب صغير بحجم 15 مم × 15 مم (الشكل 2B-D)، وأقراص الجل المتبقية معا في قالب ثان أكبر (الشكل 2F-H). سيتم استخدام الكتلة الأولى مع عينة واحدة لاختبار هلام الببتيد في دراسة تجريبية. يمكن استخدام الكتلة الثانية لبناء TMA.

5. التقييم التجريبي لسلسلة تخفيف الببتيد

  1. لكل سلسلة تخفيف الببتيد ، خطط لإنشاء شريحتين زجاجيتين تحتويان على ما مجموعه 6 أقسام منفصلة: قسم واحد من كل عينة من عينات سلسلة التخفيف الخمسة ، بالإضافة إلى قسم واحد من عينة التحكم السلبي BSA فقط.
    1. على الشريحة الزجاجية الأولى ، قم بقطع مقطع واحد بسماكة 4 ميكرومتر من كل كتلة من الكتل الأصغر التي تحتوي على قرص هلام واحد مع أعلى ثلاثة تركيزات للببتيد (2.5 E-4 M إلى 2.5 E-6 M).
    2. على شريحة ثانية ، قم بقطع مقطع واحد بسماكة 4 ميكرومتر من كل كتلة بأدنى تركيزين للببتيد (2.5 E-7 M و 2.5 E-8 M) وقسم واحد من كتلة التحكم BSA فقط. سجل ترتيب العينات على الشرائح.
      ملاحظة: توقع أن تقطع المواد الهلامية المدمجة في البارافين بسلاسة ، مما ينتج مقاطع موحدة دون تجزئة أو تمزيق أو ثرثرة. إذا كان من الصعب تقسيم عينات معينة من الجل المدمج في البارافين ، فقم بنقع وجه الكتلة لفترة وجيزة في الماء المقطر البارد المثلج قبل التقسيم. إذا لزم الأمر ، جرب أوقات نقع مختلفة أو مع حلول مختلفة (على سبيل المثال ، ماء الأمونيا).
    3. بعد التقسيم ، جفف الشرائح في درجة حرارة الغرفة (حوالي 23 درجة مئوية) لمدة 24 ساعة تليها 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. قم بتلطيخ الشريحتين المحضرتين لكل ببتيد بالجسم المضاد المطلوب وفقا لبروتوكولات المدينة العالمية للخدمات الإنسانية القياسية.
    ملاحظة: كان تركيز الأجسام المضادة الأولية على الشريحة المستخدمة للأرانب وحيدة النسيلة 4B5 في هذا العرض التوضيحي 1.5 ميكروغرام/مل.
    1. توقع أن ترى إشارة موحدة نسبيا داخل كل قسم هلام ، حيث تظهر عينات الجل المختلفة مجموعة من شدة الإشارة المقابلة لتخفيفات الببتيد.
  3. إذا كانت نتائج الدراسة التجريبية مرضية ، فقم ببناء TMA من كتل مانحة الجل التي تحتوي على تركيزات مختلفة من مستضد الببتيد ، كما هو موضح في الخطوات التالية من البروتوكول.

6. BSA هلام TMA البناء

  1. قم ببناء مصفوفة دقيقة للأنسجة تحتوي على نوى مكررة قطرها 1 مم من كتل مانحة تحتوي على هلام BSA وحده وهلام BSA يحتوي على جميع التخفيفات الخمسة لببتيد ERBB2.
    ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، قم بتضمين المواد الهلامية BSA التي تحتوي على نفس التخفيفات الخمسة للببتيد غير المستهدف كضوابط سلبية إضافية. إذا رغبت في ذلك ، قم بتضمين نوى خطوط الخلايا التمثيلية التي تعبر عن ERBB2 كعناصر تحكم إيجابية.
  2. قطع 4 ميكرومتر من TMA ووصمة عار مع 1.5 ميكروغرام / مل من anti-ERBB2 / HER2 / neu أرنب وحيد النسيلة 4B5 (انظر جدول المواد) وفقا للبروتوكولات القياسية المختبرية.
  3. تقييم شدة البقع الناتجة نوعيا عن طريق الفحص أو كميا عن طريق المسح الضوئي والتحليل الرقمي للصور (الشكل 3A ، B).
    ملاحظة: نظرا لأن تحليل الصور الرقمية ليس محور هذا البروتوكول ، يتم ترك هذه الخطوات للقارئ لتنفيذها وفقا لتفضيلاته.

النتائج

يجب أن تذوب الببتيدات بالكامل في مذيب مناسب في درجة حرارة الغرفة لتشكيل محلول واضح بصريا. إذا كانت مادة الجسيمات المرئية لا تزال موجودة بعد 30-60 دقيقة ، فقد يكون من المفيد إضافة كميات إضافية من المذيب الأصلي أو مذيب بديل لا يتجاوز الحجم المقصود لمحلول مخزون الببتيد 5x المحسوب في الجدول 1<...

Discussion

تسمح هذه الطريقة للمستخدم بإنشاء عينات موحدة من التركيب المعروف وتركيز المستضد كمعايير في تفاعلات المدينة العالمية للخدمات الإنسانية ، باستخدام مواد وتقنيات مألوفة لمعظم مختبرات الأنسجة. الخطوة الأكثر أهمية هي تحديد الظهارة التي يرتبط بها الجسم المضاد للاهتمام. يصف هذا البروتوكول استخ...

Disclosures

تشارلز أ. هافنار، كاثي ج. هوتزل، تشارلز أ. جونز، كارمينا م. إسبيريتو، ليندا ك. رانجل، وفرانكلين ف. بيل هم موظفون ومساهمون في جينينتيك وروش. تنتج الشركات التابعة لها كواشف وأدوات مستخدمة في هذه الدراسة.

Acknowledgements

يعترف المؤلفون بامتنان بزملائهم جيفري توم وأيمن سونغ لتوليف الببتيد ، و Nianfeng Ge لبناء TMA ، و Shari Lau لتلطيخ IHC ، وميليسا إيديك للمسح المجهري الرقمي ، و Hai Ngu لقياس كمية الصور الرقمية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-HER2/neu clone 4B5Ventana5278368001
Biopsy WrapsLeica3801090
Bovine Serum Albumin, ultra pureCell Signaling TechnologyBSA #9998
50 mL Conical TubeCorning352070
Disposable base mold (15 mm x 15 mm)Fisher22-363-553
Disposable base mold
(24 mm x 24 mm)		Fisher22-363-554
Disposable spatulaVWR80081-188
Eppendorf ThermomixerEppendorf22331
37% FormaldehydeElectron Microscopy Sciences15686
ERBB2 / HER2 peptideUniProt P04626-1; a.a. 1240-55
Leica Autostainer XLLeicaST5010
Magnetic Stir Bar
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imagerHamamatsu
10% Neutral Buffered FormalinVWR16004-128
Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL
Paraplast paraffinLeica39601006
Peptide parameter calculatorPep-Calc17https://www.pep-calc.com/
Peptide suppliersABclonal ScienceUsers should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
Anaspec PeptideUsers should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
CPC ScientificUsers should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
New England PeptideUsers should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
Phosphate Buffered Saline pH 7.2
Reagent AlcoholThermo Scientific9111
Single Edge RazorVWR55411-050
Superfrost Plus positively charged microscope slidesThermo Scientific6776214
TMA Tissue Grand Master3DHISTECH
XylenesVWR89370-088

References

  1. Torlakovic, E. E., et al. Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).
  2. Hötzel, K. J., et al. Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).
  3. Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
  4. Torlakovic, E. E., et al. Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).
  5. Martinez-Morilla, S., et al. Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray. Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).
  6. Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
  7. Sompuram, S. R., et al. Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets. Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).
  8. Sompuram, S. R., et al. A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).
  9. Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).
  10. Vani, K., et al. Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).
  11. Brandtzaeg, P. Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity. Immunology. 22, 177-183 (1972).
  12. Matute, C., Streit, P. Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity. Histochemistry. 86, 147-157 (1986).
  13. Ottersen, O. P. Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing. Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).
  14. Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. 'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).
  15. Arabi, S. H., et al. Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties. Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).
  16. Schrohl, A. -. S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Brünner, N. Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies. Histopathology. 59, 975-983 (2011).
  17. Lear, S., Cobb, S. L. Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).
  18. Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays. Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).
  19. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  20. Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
  21. Forsström, B., et al. Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).
  22. Forsström, B., et al. Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes. PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).
  23. Prasad, B., et al. Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174 ERBB2 HER2 neu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved