면역조직화학을 위한 합성 항원 대조군

요약

이 작업은 면역 조직 화학을위한 합성 항원 대조군을 만드는 간단한 방법을 문서화합니다. 이 기술은 광범위한 농도에서 다양한 항원에 적응할 수 있다. 샘플은 인트라 및 인터-어세이 성능 및 재현성을 평가하기 위한 참조를 제공한다.

초록

면역조직화학(IHC) 분석은 단백질 발현 패턴에 대한 귀중한 통찰력을 제공하며, 이에 대한 신뢰할 수 있는 해석은 잘 특성화된 양성 및 음성 대조군 샘플을 필요로 합니다. 적절한 조직 또는 세포주 조절이 항상 이용 가능한 것은 아니기 때문에, 합성 IHC 대조군을 생성하는 간단한 방법이 유익할 수 있다. 이러한 방법은 여기에 설명되어 있습니다. 단백질, 펩티드 또는 올리고뉴클레오티드를 포함한 다양한 항원 유형에 광범위한 농도로 적응할 수 있다. 이 프로토콜은 다양한 진단적 관련 항체에 의해 인식되는 인간 적혈구 종양유전자 B2 (ERBB2/HER2) 세포내 도메인 (ICD)으로부터의 펩티드를 예로서 사용하여 합성 항원 조절을 생성하는 데 필요한 단계를 설명한다. 소 혈청 알부민 (BSA) 용액에서 HER2 ICD 펩티드의 연속 희석물을 포름알데히드와 혼합하고 85°C에서 10분 동안 가열하여 펩티드/BSA 혼합물을 응고시키고 가교시킨다. 생성된 겔은 조직처럼 처리, 절편화 및 염색될 수 있고, 광범위한 염색 강도에 걸쳐 공지된 항원 농도의 일련의 샘플을 산출한다.

이 간단한 프로토콜은 일상적인 조직학 실험실 절차와 일치합니다. 상기 방법은 단지 사용자가 원하는 항원의 충분한 양을 가질 것을 요구한다. 관련 에피토프를 인코딩하는 재조합 단백질, 단백질 도메인, 또는 선형 펩티드는 국부적으로 또는 상업적으로 합성될 수 있다. 사내 항체를 생성하는 실험실은 합성 대조군 표적으로서 면역화 항원의 분취량을 예비할 수 있다. 광범위한 농도에 걸쳐 잘 정의된 양성 대조군을 만들 수 있는 기회를 통해 사용자는 실험실 내 및 실험실 간 분석 성능을 평가하고, 분석의 동적 범위와 선형성에 대한 통찰력을 얻고, 특정 실험 목표에 맞게 분석 조건을 최적화할 수 있습니다.

서문

면역조직화학(IHC)은 포르말린-고정, 파라핀 포매(FFPE) 조직 절편에서 표적 항원의 민감하고 특이적이며 공간적으로 정밀한 검출을 가능하게 한다. 그러나, IHC 염색 결과는 온온 및 냉 허혈 시간, 조직 고정, 조직 전처리, 항체 반응성 및 농도, 분석 검출 화학, 및 반응 시간¹을 포함하는 다수의 변수에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, IHC 반응의 재현 가능한 성능 및 해석은 이들 변수의 엄격한 제어와 잘 특성화된 양성 및 음성 대조군 샘플의 사용을 필요로 한다. 자주 사용되는 대조군에는 관심 항원을 발현하는 독립적인 분석으로부터 공지된 파라핀 포매된 조직 또는 배양된 세포주가 포함되지만, 이러한 샘플이 항상 이용가능한 것은 아니다¹. 더욱이, 조직 및 세포주 조절에서 표적 항원의 발현 수준은 일반적으로 단지 정성적으로만 이해되고 가변적일 수 있다. 재현 가능하고 정확하게 알려진 표적 항원 농도를 함유하는 대조군은 IHC 반응 조건의 최적화를 보조할 수 있다. 합성 IHC 대조군 샘플을 생성하기 위해 생리학적으로 관련된 농도 범위에서 다양한 항원 유형에 적응할 수 있는 일반적인 방법이 저자²에 의해 기술되었다. 이러한 유형의 표준을 만들고 사용하기 위....

프로토콜

1. 원액 및 도구의 준비

1. 50 mL 원뿔형 튜브에서 5 mL의 PBS, pH 7.2의 5 mL BSA 분말을 혼합하여 25% w/v BSA 용액 20 mL를 고르게 분산시킬 때까지 준비한다. BSA 분말을 분산시키기 위해 필요에 따라 소용돌이.
   1. 완전한 용해를 허용하도록 용액을 4°C에서 하룻밤 동안 유지한다. PBS로 최종 부피를 20 mL로 조정하여 25% w/v 원액을 만든다.
2. 6.26 g BSA 분말을 PBS 13 mL에 혼합하고, pH 7.2를 50 mL 원뿔형 튜브에 혼합하여 31.3% w/v BSA 용액 20 mL를 고르게 분산시킬 때까지 준비한다. 완전한 용해를 허용하도록 용액을 4°C에서 하룻밤 동안 유지한다. PBS로 최종 부피를 20 mL로 조정하여 31.3% w/v 원액을 만든다.
3. 열 블록을 85°C로 예열합니다.
   참고: 아래 프로토콜은 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 형성된 1.26-1.4mL의 부피를 가진 펩티드/BSA 젤을 생성합니다. 더 작은 부피를 사용하기 위해, 예를 들어, 항원 재고가 제한될 때, PCR 튜브에서 겔을 제조하고 열 블록으로서 85°C로 설정된 열사이클러를 사용한다.
4. BSA/포름알데히드 혼합물이 25% BSA 용액 700μL와 37....

결과

펩티드는 실온에서 적절한 용매에 전적으로 용해되어 광학적으로 투명한 용액을 형성해야 한다. 가시적 미립자 물질이 30-60분 후에도 여전히 존재하는 경우, 표 1에서 계산된 5x 펩티드 원액의 의도된 부피를 초과하지 않는 원래의 용매 또는 대체 용매의 추가 부피를 첨가하는 것이 도움이 될 수 있다. 마찬가지로 결합된 펩티드/BSA 용액은 반투명하게 유지되어야 합니다(

토론

이 방법을 통해 사용자는 대부분의 조직학 실험실에 익숙한 재료 및 기술을 사용하여 IHC 반응의 표준으로 알려진 조성 및 항원 농도의 균일 한 샘플을 만들 수 있습니다. 가장 중요한 단계는 관심있는 항체가 결합하는 에피토프를 확인하는 것이다. 이 프로토콜은 ERBB2/HER2 ICD로부터의 선형 펩티드 항원을 사용하는 것을 기술한다. 동일한 프로토콜이 올리고뉴클레오티드, 형광 표지, 단백질 도메인,.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-HER2/neu clone 4B5	Ventana	5278368001
Biopsy Wraps	Leica	3801090
Bovine Serum Albumin, ultra pure	Cell Signaling Technology	BSA #9998
50 mL Conical Tube	Corning	352070
Disposable base mold (15 mm x 15 mm)	Fisher	22-363-553
Disposable base mold (24 mm x 24 mm)	Fisher	22-363-554
Disposable spatula	VWR	80081-188
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	22331
37% Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15686
ERBB2 / HER2 peptide			UniProt P04626-1; a.a. 1240-55
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010
Magnetic Stir Bar
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager	Hamamatsu
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128
Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL
Paraplast paraffin	Leica	39601006
Peptide parameter calculator	Pep-Calc17	https://www.pep-calc.com/
Peptide suppliers	ABclonal Science		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	Anaspec Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	CPC Scientific		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	New England Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
Phosphate Buffered Saline pH 7.2
Reagent Alcohol	Thermo Scientific	9111
Single Edge Razor	VWR	55411-050
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214
TMA Tissue Grand Master	3DHISTECH
Xylenes	VWR	89370-088