Contrôles d’antigènes synthétiques pour l’immunohistochimie

Résumé

Ce travail documente une méthode simple pour créer des contrôles d’antigènes synthétiques pour l’immunohistochimie. La technique est adaptable à une variété d’antigènes dans une large gamme de concentrations. Les échantillons fournissent une référence pour évaluer la performance et la reproductibilité intra et inter-essais.

Résumé

Les tests d’immunohistochimie (IHC) fournissent des informations précieuses sur les modèles d’expression des protéines, dont l’interprétation fiable nécessite des échantillons témoins positifs et négatifs bien caractérisés. Étant donné que les contrôles appropriés des tissus ou des lignées cellulaires ne sont pas toujours disponibles, une méthode simple pour créer des contrôles IHC synthétiques peut être bénéfique. Une telle méthode est décrite ici. Il est adaptable à divers types d’antigènes, y compris les protéines, les peptides ou les oligonucléotides, dans une large gamme de concentrations. Ce protocole explique les étapes nécessaires à la création de contrôles d’antigènes synthétiques, en utilisant comme exemple un peptide de l’oncogène érythroblastique humain B2 (ERBB2/HER2) domaine intracellulaire (DCI) reconnu par une variété d’anticorps pertinents sur le plan diagnostique. Les dilutions en série du peptide HER2 ICD dans une solution d’albumine sérique bovine (BSA) sont mélangées avec du formaldéhyde et chauffées pendant 10 min à 85 °C pour solidifier et réticuler le mélange peptide/BSA. Le gel résultant peut être traité, sectionné et coloré comme un tissu, produisant une série d’échantillons de concentrations d’antigènes connues couvrant un large éventail d’intensités de coloration.

Ce protocole simple est conforme aux procédures de laboratoire d’histologie de routine. La méthode exige seulement que l’utilisateur ait une quantité suffisante de l’antigène souhaité. Les protéines recombinantes, les domaines protéiques ou les peptides linéaires qui codent des épitopes pertinents peuvent être synthétisés localement ou commercialement. Les laboratoires générant des anticorps internes peuvent réserver des aliquotes de l’antigène immunisant comme cible de contrôle synthétique. La possibilité de créer des témoins positifs bien définis sur un large éventail de concentrations permet aux utilisateurs d’évaluer les performances des essais intra et interlaboratoires, de mieux comprendre la plage dynamique et la linéarité de leurs essais et d’optimiser les conditions d’essai pour leurs objectifs expérimentaux particuliers.

Introduction

L’immunohistochimie (IHC) permet la détection sensible et spécifique, spatialement précise, des antigènes cibles dans les coupes de tissus fixées au formol et incorporées à la paraffine (FFPE). Cependant, les résultats de la coloration IHC peuvent être affectés par de multiples variables, y compris le temps d’ischémie chaude et froide, la fixation des tissus, le prétraitement des tissus, la réactivité et la concentration d’anticorps, la chimie de détection des tests et les temps de réaction¹. Par conséquent, la performance reproductible et l’interprétation des réactions IHC nécessitent un contrôle rigoureux de ces variables et l’utilisation d’échantillons témoins positifs et négatifs bien caractérisés. Les témoins fréquemment utilisés comprennent des tissus incorporés dans la paraffine ou des lignées cellulaires cultivées connues à partir d’analyses indépendantes pour exprimer l’antigène d’intérêt, mais de tels échantillons ne sont pas toujours disponibles¹. De plus, les niveaux d’expression des antigènes cibles dans les tissus et les contrôles de lignées cellulaires ne sont généralement compris que qualitativement et peuvent être variables. Les témoins contenant des concentrations reproductibles et connues avec précision de l’antigène cible peuvent aider à optimiser les conditions de réaction de l’IHC. Une méthode générale, adaptable à une variété de types d’antigènes dans une gamme de concentrations physiologiquement pertinentes pour créer des échantillons synthétiques de contrôle IHC, a été décrite par les auteurs². Un protocole détaillé est fourni ici pour la création et l’utilisation de ce type de norme.

Des contrôles appropriés sont essentiels pour l’interprétation valide des tests IHC ^1,3,4. Des tissus, des cellules cultivées et des substrats enrobés de peptides ont été utilisés comme témoins IHC en fonction des besoins spécifiques des chercheurs. Les avantages et les limites inhérents à l’utilisation de tissus comme témoins IHC ont été largement discutés ^1,4. Pour de nombreux anticorps, des témoins appropriés peuvent être choisis parmi des tissus normaux sélectionnés contenant des populations cellulaires exprimant l’antigène cible sur une large plage dynamique. Les témoins tissulaires sont moins appropriés lorsque l’antigène cible n’est pas bien caractérisé en ce qui concerne le site d’expression ou l’abondance, ou lorsque des antigènes à réaction croisée potentielle sont co-exprimés dans les mêmes cellules ou sites tissulaires. Dans ces contextes, des blocs de lignées cellulaires cultivées exprimant l’antigène d’intérêt peuvent être utiles. Pour fournir des preuves supplémentaires de la spécificité de la cible, les lignées cellulaires peuvent être conçues pour surexprimer ou sous-exprimer les antigènes cibles. Par exemple, une telle approche a récemment été utilisée pour évaluer une variété de tests anti--L1 à l’aide d’un microréseau tissulaire de lignées cellulaires isogéniques exprimant une gamme d’antigène-L1⁵. Les limites pratiques à l’utilisation systématique des blocs de lignées cellulaires comprennent le coût et le temps nécessaires pour produire un nombre suffisant de cellules et le fait que l’expression de certains antigènes peut ne pas être cohérente de manière fiable, même au sein des lignées cellulaires clonales⁶. Les peptides synthétiques sont une troisième option pour les contrôles IHC pour les anticorps qui reconnaissent les épitopes linéaires courts. Steven Bogen et ses collègues ont publié de nombreux articles sur l’utilisation de peptides couplés à la surface des lames de verre ^7,8 et des perles de verre⁹. Une étude de ce groupe a démontré que l’analyse quantitative des contrôles IHC à base de peptides pouvait détecter la variation du processus de coloration manquée par l’évaluation qualitative des contrôles tissulaires analysés en parallèle¹⁰. Bien que les normes utilisant des antigènes à base de billes puissent être largement applicables, de nombreux détails sont la propriété des auteurs, ce qui limite l’adoption généralisée.

Une autre approche des normes IHC incorpore des antigènes cibles dans des gels protéiques créés artificiellement. Ce concept a été démontré pour la première fois par Per Brandtzaeg en 1972 dans une étude dans laquelle le sérum de lapin normal a été polymérisé à l’aide de glutaraldéhyde¹¹. De petits blocs du gel résultant ont ensuite été trempés pendant 1 à 4 semaines dans des solutions contenant les antigènes d’immunoglobulines d’intérêt à différentes concentrations. Après fixation de l’alcool et incorporation de paraffine, il a été démontré que des sections des témoins résultants se coloraient avec des intensités correspondant au logarithme des solutions antigéniques dans lesquelles elles avaient été trempées. Plus tard, les chercheurs ont préparé des conjugués de glutaraldéhyde d’acides aminés spécifiques dans des solutions diluées de BSA ou d’homogénat du cerveau comme témoins positifs dans des études de microscopie immuno-électronique^12,13. Des travaux plus récents ont étudié l’utilisation de gels fabriqués à partir de solutions protéiques fixées au formaldéhyde comme substituts pour les tissus FFPE dans l’analyse par spectrométrie de masse¹⁴. Un autre travail récent a étudié la structure et les propriétés des gels formés en chauffant des solutions d’albumine sérique humaine ou bovine à diverses concentrations et pH¹⁵. Ces auteurs ont constaté que l’albumine sérique forme trois types de gels différant par leur élasticité mécanique, leur préservation de la structure secondaire et leur capacité de liaison aux acides gras en fonction des conditions expérimentales. Ensemble, ces documents démontrent la faisabilité générale de l’approche employée ici. Les solutions protéiques de composition définie créent des gels tissulaires qui peuvent être traités, sectionnés et colorés à l’aide de méthodes histologiques de routine.

Ce protocole décrit la formation d’un contrôle IHC synthétique fabriqué à partir d’albumine sérique bovine (BSA) polymérisée avec de la chaleur et du formaldéhyde. Les gels peuvent incorporer une grande variété d’antigènes, y compris des protéines pleine longueur, des domaines protéiques et des peptides linéaires, ainsi que des antigènes non protéiques, y compris des oligonucléotides². Cette démonstration utilise un exemple d’antigène, un peptide linéaire codant pour les acides aminés C-terminal 16 de la protéine humaine ERBB2 (HER2/neu) TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (voir Tableau des matériaux). Cette séquence comprend les épitopes reconnus par trois anticorps disponibles dans le commerce et pertinents sur le plan diagnostique, y compris le réactif polyclonal Herceptest (ENPEYLGLDVP) et les anticorps monoclonaux CB11 (AENPEYL) et 4B5 (TAENPEYLGL) (voir tableau des matériaux)¹⁶.

La méthode démontrée ici utilise des réactifs facilement disponibles en utilisant des processus et des techniques familiers à tout laboratoire d’histologie en exercice. La limitation la plus importante est la nécessité d’identifier et d’acheter les antigènes cibles, ce qui peut être accompli dans de nombreux cas à un coût relativement modeste. Parce que ces contrôles synthétiques sont de composition entièrement définie et fabriqués avec des méthodes simples, ils peuvent être mis en œuvre dans de nombreux laboratoires avec des résultats reproductibles. Leur utilisation peut faciliter l’évaluation objective et quantifiable des résultats de coloration IHC et permettre une plus grande reproductibilité intra- et inter-laboratoires.

Protocole

1. Préparation de la solution de stock et des outils

1. Préparer 20 mL d’une solution de BSA à 25 % p/v en mélangeant 5 g de poudre de BSA dans 14 mL de PBS, pH 7,2 dans un tube conique de 50 mL jusqu’à dispersion uniforme. Vortex si nécessaire pour disperser la poudre de BSA.
   1. Conserver la solution toute la nuit à 4 °C pour permettre une dissolution complète. Réglez le volume final à 20 mL avec PBS pour obtenir une solution mère de 25 % p/v.
2. Préparer 20 mL d’une solution de BSA à 31,3 % p/v en mélangeant 6,26 g de poudre de BSA dans 13 mL de PBS, pH 7,2 dans un tube conique de 50 mL jusqu’à dispersion uniforme. Conserver la solution toute la nuit à 4 °C pour permettre une dissolution complète. Réglez le volume final à 20 mL avec PBS pour obtenir une solution mère de 31,3 % p/v.
3. Préchauffer un bloc chauffant à 85 °C.
   REMARQUE: Le protocole ci-dessous crée des gels peptidiques / BSA avec des volumes de 1,26 à 1,4 mL formés dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL. Pour utiliser de plus petits volumes, par exemple, lorsque les stocks d’antigènes sont limités, préparez les gels dans des tubes PCR et utilisez un thermocycleur réglé à 85 ° C comme bloc thermique.
4. Vérifier que le mélange BSA/formaldéhyde forme un gel comme prévu en mélangeant 700 μL de solution de BSA à 25 % avec 700 μL de formaldéhyde à 37 %. Bien mélanger en pipetant de haut en bas 5 fois en 5-10 s. Évitez de créer des bulles d’air.
   ATTENTION : Le formaldéhyde concentré est toxique; à utiliser avec les précautions de sécurité appropriées.
5. Immédiatement après avoir mélangé les solutions de BSA et de formaldéhyde, placer le tube de microcentrifugation fermé dans un bloc thermique à 85 °C pendant 10 min. Retirez le tube du bloc chauffant et laissez-le refroidir. Confirmez que le gel s’est formé comme prévu.

2. Préparation et dilution des peptides

1. Obtenir 5-20 mg de peptide lyophilisé de la séquence souhaitée.
   REMARQUE: Les acides aminés C-terminal 16 du domaine intracellulaire humain ERBB2 reconnu par 4B5 est TPTAENPEYLGLDVPV-COOH.
   1. Ajouter 4 acides aminés au N-terminus, acétyl-YGSG, et au C-terminus, GSGC-amide pour faciliter la réticulation du peptide à BSA et fournir un espacement entre la molécule BSA et l’épitope peptidique.
      REMARQUE: La séquence complète est: acétyl-YGSGTPTAENPEYLGLDVPVGSGC-amide.
   2. Si vous le souhaitez, utilisez d’autres séquences d’acides aminés N et C terminaux pour étendre l’épitope peptidique du noyau.
      REMARQUE: L’impact de différentes séquences varie selon les combinaisons anticorps/épitope. L’ajout du peptide C-terminal réduit la liaison de certains anticorps aux épitopes C-terminal. Dans de tels cas, omettez cette séquence.
   3. Confirmer que les peptides provenant de sources commerciales sont fournis à >95% de pureté, dont la composition est confirmée par HPLC et analyse par spectrométrie de masse.
2. Calculer les volumes nécessaires pour les solutions mères peptidiques 5x (1,25 E-2 M). En se référant au tableau 1, colonnes C-E, entrez les valeurs pour le poids moléculaire de l’antigène (g/mole), le pourcentage de pureté de l’antigène (0-100) et la masse de l’antigène (mg).
   REMARQUE: Le volume de solvant (en μL) pour remettre en suspension l’échantillon afin d’obtenir une solution mère de 1,25 E-2 M est de 800 x poids moléculaire de l’antigène x pourcentage de pureté de l’antigène / masse de l’antigène.
   1. Préparer et étiqueter clairement huit tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.
      REMARQUE: Les tubes contiendront 5x stock peptidique dans un solvant, 1x stock peptidique dans un solvant, cinq dilutions en série 10x de 2,5 E-4 M à 2,5 E-8 M peptide / BSA / gel de formaldéhyde, et un gel témoin négatif contenant BSA / formaldéhyde sans antigène ajouté. Tous les échantillons de gel sont identiques. Lorsque vous préparez plusieurs ensembles de dilutions peptidiques à la fois, prenez soin d’étiqueter et d’identifier correctement tous les tubes et cassettes de traitement. Utilisez des tubes de microcentrifugation à code couleur et des cassettes de traitement dans la mesure du possible pour minimiser les erreurs d’identification.
3. Préparer une solution mère peptidique 5x à 1,25 E-2 M en resusmettant en suspension toute la masse de peptide lyophilisé (20 mg pour les peptides ERBB2) dans 60 μL du solvant approprié.
   Remarque : Dans cet exemple, le diméthylformamide (DMF) a été ajouté directement au conteneur du fournisseur.
   1. Inspectez la solution pour vous assurer que le peptide est complètement dissous. Si nécessaire, ajouter un solvant supplémentaire et/ou soniquer l’échantillon jusqu’à ce que le peptide soit complètement dissous, en prenant soin de ne pas dépasser le volume calculé dans le tableau 1 pour le stock peptidique 5x.
      ATTENTION : Le DMF est toxique ; utiliser avec les précautions appropriées.
      REMARQUE: Selon la séquence d’acides aminés, l’hydrophobicité et la charge correspondantes, les peptides peuvent être solubles dans le DMF, le sulfoxyde de diméthyle (DMSO), l’eau pure ou des solutions diluées d’acide acétique, d’acide formique ou de bicarbonate d’ammonium. Les caractéristiques peptidiques peuvent être calculées à l’aide d’une variété d’outils en ligne¹⁷. Certains fournisseurs de peptides peuvent suggérer des solvants appropriés pour des séquences spécifiques.
   2. Ajouter le solvant si nécessaire pour amener le volume de la souche peptidique 5x au volume final calculé dans le tableau 1. Vortex pendant 5 s et centrifugeuse à température ambiante à 5000 x g pendant 5 s. Les solutions mères peptidiques peuvent être stockées à -80 °C.
4. En se référant au tableau 2, colonne C, préparer 150 μL de 1x solution mère peptidique (2,5 E-3 M) en diluant 30 μL de la 5x solution peptidique en 120 μL de solvant (DMF cet exemple). Vortex pendant 5 s et centrifugeuse à température ambiante à 5000 x g pendant 5 s.
5. En se référant au tableau 2, colonne D, préparer 700 μL de 5 peptides E-4 M/solution de BSA (dilution 1) en diluant 140 μL de 1x pellicule dans 560 μL de 31,3 % de BSA/PBS, pH 7,2. Vortex pendant 5 s et centrifugeuse à température ambiante à 5000 x g pendant 5 s.
   REMARQUE: La concentration finale de BSA de cette solution est de 25% (p / v).
6. En se référant au tableau 2, colonnes E-H, préparer quatre dilutions successives en série 10x du stock de 5 peptides E-4 M/BSA en ajoutant 70 μL de solution peptidique/BSA à 630 μL de 25 % de BSA/PBS, pH 7,2. Vortex pendant 5 s et centrifugeuse à température ambiante à 5000 x g pendant 5 s.
   REMARQUE: Après cette étape, il y aura cinq dilutions en série 10 fois du peptide (5 E-4 M à 5 E-8 M) dans 25% BSA / PBS, pH 7,2. Les quatre premiers échantillons contiendront 630 μL. Le dernier échantillon contiendra 700 μL.
7. En se référant au tableau 2, colonne I, préparer un échantillon de BSA témoin négatif contenant 700 μL de 25 % de BSA/PBS, pH 7,2 (figure 1A).

3. Préparation de gels peptidiques BSA

1. Vérifiez que le bloc thermique ou le thermocycleur est stable à 85 °C.
2. Reportez-vous au tableau 3, colonnes B à E. En travaillant un échantillon à la fois, ajouter au premier échantillon de 25 % de BSA/peptide (Dilution 1) 630 μL de formaldéhyde à 37 %. Bien mélanger en pipetant de haut en bas 5 fois en 5-10 s. Évitez de créer des bulles d’air.
   ATTENTION : Le formaldéhyde concentré est toxique; à utiliser avec les précautions de sécurité appropriées.
   1. Après avoir mélangé les solutions peptidiques/BSA et formaldéhyde, placer le tube de microcentrifugation fermé dans un bloc thermique à 85 °C pendant 10 min.
      REMARQUE: Mélangez soigneusement la solution peptidique BSA et le formaldéhyde, mais ne passez pas plus de 10 s à pipeter le mélange avant de placer l’échantillon à feu. Étant donné que la réticulation du formaldéhyde commence immédiatement, le gel peut se former différemment si la procédure est variée pour différents échantillons. La concentration finale de BSA dans ces gels est de 12,5 % (p/v). Des concentrations finales de BSA inférieures à 10 % peuvent donner des gels qui ne se solidifient pas; des concentrations finales de BSA supérieures à 16 % peuvent produire des gels plus fragiles et difficiles à sectionner après le traitement.
   2. Répétez les étapes 3.2 et 3.2.1 pour chacune des dilutions 2 à 4.
   3. Répétez les étapes 3.2 et 3.2.1 pour la dilution 5, mais ajoutez 700 μL de formaldéhyde à 37 %, soit un volume égal aux 700 μL de solution d’antigène BSA.
   4. Reportez-vous à la colonne G du tableau 3 ; répéter les étapes 3.2 et 3.2.1 pour l’échantillon témoin négatif, en ajoutant 700 μL de formaldéhyde à 37 %, soit un volume égal aux 700 μL de solution de BSA témoin négatif.
3. Retirez les tubes du bloc chauffant après 10-12 min. Le temps de chauffage doit être aussi constant que possible pour chaque échantillon. Laissez les gels refroidir sur la paillasse pendant 5 à 10 min (Figure 1B).
4. À l’aide d’une spatule de laboratoire jetable propre et flexible, retirez l’échantillon de gel en une seule pièce du tube de microcentrifugation et placez-le dans un récipient scellé contenant au moins 15 mL de formol tamponné neutre (FBN), en utilisant un récipient séparé de FBN pour chaque échantillon.
   1. Vous pouvez également couper le fond du tube de microcentrifugation à l’aide d’une nouvelle lame de rasoir à un seul bord et pousser le gel par le bas avec de l’air ou une sonde appropriée (Figure 1C-G).
      REMARQUE: Les gels solidifiés de formaldéhyde / BSA peuvent rester dans les tubes de microcentrifugation à température ambiante jusqu’à 24 h. Laisser les gels dans le tube de microcentrifugation pendant plus de 24 heures peut les rendre cassants et plus difficiles à traiter et à sectionner.

4. Rognage, traitement et intégration de gels BSA

1. Coupez le cône de gel en disques cylindriques d’environ 5 mm d’épaisseur à l’aide d’un rasoir à bord unique propre (Figure 1H,I). Enveloppez les disques dans une enveloppe de biopsie, en plaçant un disque de gel plus grand dans une cassette (à utiliser dans l’étude pilote à l’étape 5), et les disques de gel restants ensemble dans une deuxième cassette (Figure 2A, E) pour une utilisation dans la construction de microréseaux tissulaires (TMA) à l’étape 6. Placez les disques de gel enveloppés dans des cassettes de traitement des tissus clairement étiquetées.
   1. Placer les gels cassettes dans au moins 15 mL de 10 % de FBN par échantillon de gel avant le traitement, en utilisant un récipient séparé de FBN pour chaque échantillon. Les gels peuvent rester dans 10% NBF pendant 6-48 h.
2. Traitez les gels dans un processeur de tissu histologique automatisé, en suivant un grand calendrier tissulaire avec pression et vide. Chaque étape prend 1 h : 10 % de FBN, 70 % d’éthanol, 95 % d’éthanol (répéter deux fois), 100 % d’éthanol (répéter deux fois), xylènes (répéter trois fois), paraffine à 60 °C (répéter trois fois).
   REMARQUE : Pour les chercheurs qui choisissent de traiter les échantillons manuellement, suivez la même séquence de réactifs et de temps.
3. Une fois le traitement de l’échantillon terminé, retirez les cassettes du processeur de tissu et déplacez-les vers le centre d’incorporation de paraffine.
4. Déballez les gels de l’enveloppe de biopsie et incorporez les gels dans de la paraffine. Pour chaque échantillon, incorporez un disque de gel dans un petit moule de 15 mm x 15 mm (figure 2B-D) et les disques de gel restants ensemble dans un deuxième moule plus grand (figure 2F-H). Le premier bloc avec un échantillon sera utilisé pour tester le gel peptidique dans une étude pilote. Le deuxième bloc peut être utilisé pour la construction de TMA.

5. Évaluation pilote de la série de dilution peptidique

1. Pour chaque série de dilution peptidique, prévoyez de créer deux lames de verre contenant un total de 6 sections distinctes : une section de chacun des cinq échantillons de la série de dilution, plus une section de l’échantillon témoin négatif BSA uniquement.
   1. Sur la première lame de verre, coupez une section de 4 μm d’épaisseur dans chacun des plus petits blocs contenant un disque de gel avec les trois concentrations peptidiques les plus élevées (2,5 E-4 M à 2,5 E-6 M).
   2. Sur une deuxième lame, coupez une section de 4 μm d’épaisseur de chaque bloc avec les deux concentrations peptidiques les plus faibles (2,5 E-7 M et 2,5 E-8 M) et une section du bloc de contrôle BSA uniquement. Enregistrez l’ordre des échantillons sur les diapositives.
      REMARQUE: Attendez-vous à ce que les gels incorporés à la paraffine coupent en douceur, produisant des sections uniformes sans fragmentation, déchirure ou artefact bavard. Si des échantillons particuliers de gel incorporés à la paraffine sont difficiles à sectionner, trempez brièvement la face du bloc dans de l’eau distillée glacée avant de sectionner. Si nécessaire, expérimentez avec différents temps de trempage ou avec différentes solutions (par exemple, de l’eau ammoniacale).
   3. Après sectionnement, sécher les lames à température ambiante (environ 23 °C) pendant 24 h, puis 60 °C pendant 30 min.
2. Colorez les deux lames préparées pour chaque peptide avec l’anticorps souhaité selon les protocoles IHC standard.
   REMARQUE : La concentration d’anticorps primaire sur lame utilisée pour le 4B5 monoclonal de lapin dans cette démonstration était de 1,5 ug/mL.
   1. Attendez-vous à voir un signal relativement uniforme dans chaque section de gel, les différents échantillons de gel montrant une plage d’intensité de signal correspondant aux dilutions peptidiques.
3. Si les résultats de l’étude pilote sont satisfaisants, construire un TMA à partir des blocs donneurs de gel contenant différentes concentrations d’antigène peptidique, comme décrit dans les étapes suivantes du protocole.

6. Construction TMA en gel BSA

1. Construire un microréseau tissulaire contenant des noyaux dupliqués de 1 mm de diamètre à partir de blocs donneurs contenant du gel BSA seul et des gels BSA contenant les cinq dilutions du peptide ERBB2.
   REMARQUE: Si vous le souhaitez, inclure des gels BSA contenant les mêmes cinq dilutions d’un peptide non ciblé que des témoins négatifs supplémentaires. Si vous le souhaitez, inclure des noyaux de lignées cellulaires représentatives exprimant ERBB2 comme témoins positifs.
2. Couper des sections de 4 μm d’épaisseur du TMA et tacher avec 1,5 ug/mL de 4B5 monoclonal de lapin anti-ERBB2/HER2/neu (voir tableau des matériaux) selon les protocoles standard du laboratoire.
3. Évaluer qualitativement l’intensité des taches résultantes par inspection ou quantitativement par numérisation et analyse d’images numériques (Figure 3A,B).
   REMARQUE: Comme l’analyse d’images numériques n’est pas au centre de ce protocole, ces étapes sont laissées au lecteur pour effectuer selon ses préférences.

Résultats

Les peptides doivent se dissoudre entièrement dans un solvant approprié à température ambiante pour former une solution optiquement claire. Si des particules visibles sont toujours présentes après 30 à 60 minutes, il peut être utile d’ajouter des volumes supplémentaires du solvant d’origine ou d’un solvant alternatif ne dépassant pas le volume prévu de la solution mère peptidique 5x calculée dans le tableau 1. De même, la solution combinée peptide/BSA doit rester translucide (

Discussion

Cette méthode permet à l’utilisateur de créer des échantillons uniformes de composition connue et de concentration d’antigènes comme normes dans les réactions IHC, en utilisant des matériaux et des techniques familiers à la plupart des laboratoires d’histologie. L’étape la plus cruciale consiste à identifier l’épitope auquel l’anticorps d’intérêt se lie. Ce protocole décrit l’utilisation d’un antigène peptidique linéaire de l’ICD ERBB2/HER2. Le même protocole peut être utilisé pour ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-HER2/neu clone 4B5	Ventana	5278368001
Biopsy Wraps	Leica	3801090
Bovine Serum Albumin, ultra pure	Cell Signaling Technology	BSA #9998
50 mL Conical Tube	Corning	352070
Disposable base mold (15 mm x 15 mm)	Fisher	22-363-553
Disposable base mold (24 mm x 24 mm)	Fisher	22-363-554
Disposable spatula	VWR	80081-188
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	22331
37% Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15686
ERBB2 / HER2 peptide			UniProt P04626-1; a.a. 1240-55
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010
Magnetic Stir Bar
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager	Hamamatsu
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128
Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL
Paraplast paraffin	Leica	39601006
Peptide parameter calculator	Pep-Calc17	https://www.pep-calc.com/
Peptide suppliers	ABclonal Science		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	Anaspec Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	CPC Scientific		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	New England Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
Phosphate Buffered Saline pH 7.2
Reagent Alcohol	Thermo Scientific	9111
Single Edge Razor	VWR	55411-050
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214
TMA Tissue Grand Master	3DHISTECH
Xylenes	VWR	89370-088