JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

עבודה זו מתעדת שיטה פשוטה ליצירת בקרות אנטיגן סינתטיות לאימונוהיסטוכימיה. הטכניקה ניתנת להתאמה למגוון אנטיגנים במגוון רחב של ריכוזים. הדוגמאות מספקות אסמכתא שבאמצעותה ניתן להעריך את הביצועים ויכולת השכפול של בדיקות תוך ובין בדיקות.

Abstract

מבחני אימונוהיסטוכימיה (IHC) מספקים תובנות חשובות על דפוסי ביטוי חלבונים, שהפרשנות המהימנה שלהם דורשת דגימות בקרה חיוביות ושליליות מאופיינות היטב. מאחר שפקדי רקמות או קו תאים מתאימים אינם תמיד זמינים, שיטה פשוטה ליצירת בקרות IHC סינתטיות עשויה להועיל. שיטה כזו מתוארת כאן. הוא ניתן להתאמה לסוגי אנטיגנים שונים, כולל חלבונים, פפטידים או אוליגונוקלאוטידים, במגוון רחב של ריכוזים. פרוטוקול זה מסביר את השלבים הדרושים ליצירת בקרות אנטיגן סינתטיות, תוך שימוש כדוגמה בפפטיד מהתחום התוך-תאי של אונקוגן אריתרובלסטי אנושי B2 (ERBB2/HER2) (ICD) המוכר על ידי מגוון נוגדנים רלוונטיים מבחינה אבחנתית. דילולים סדרתיים של פפטיד HER2 ICD בתמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA) מעורבבים עם פורמלדהיד ומחוממים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס כדי להתמצק ולקשר את תערובת הפפטיד/BSA. ניתן לעבד, לחתוך ולהכתים את הג'ל שנוצר כמו רקמה, ולהניב סדרה של דגימות של ריכוזי אנטיגן ידועים המשתרעים על פני מגוון רחב של עוצמות צביעה.

פרוטוקול פשוט זה עולה בקנה אחד עם נהלי מעבדה היסטולוגיים שגרתיים. השיטה דורשת רק שלמשתמש תהיה כמות מספקת של האנטיגן הרצוי. חלבונים רקומביננטיים, תחומי חלבונים או פפטידים ליניאריים המקודדים אפיטופים רלוונטיים עשויים להיות מסונתזים באופן מקומי או מסחרי. מעבדות המייצרות נוגדנים פנימיים יכולות לשריין אליקוטים של האנטיגן המחסן כמטרה להדברה סינתטית. ההזדמנות ליצור בקרות חיוביות מוגדרות היטב במגוון רחב של ריכוזים מאפשרת למשתמשים להעריך את ביצועי הבדיקה התוך-מעבדתית והבין-מעבדתית, לקבל תובנה לגבי הטווח הדינמי והלינאריות של הבדיקות שלהם, ולמטב את תנאי הבדיקה למטרות הניסוי הספציפיות שלהם.

Introduction

אימונוהיסטוכימיה (IHC) מאפשרת זיהוי רגיש וספציפי ומדויק מרחבית של אנטיגנים מטרה בקטעי רקמות קבועים פורמלין, משובצי פרפין (FFPE). עם זאת, תוצאות צביעת IHC עשויות להיות מושפעות ממשתנים מרובים, כולל זמן איסכמיה חם וקר, קיבוע רקמות, טיפול מקדים ברקמות, תגובתיות וריכוז נוגדנים, כימיה של זיהוי בדיקה וזמני תגובה1. לפיכך, ביצועים ופרשנות הניתנים לשחזור של תגובות IHC דורשים שליטה קפדנית במשתנים אלה ושימוש בדגימות בקרה חיוביות ושליליות מאופיינות היטב. בקרות נפוצות כוללות רקמות משובצות פרפין או קווי תאים בתרבית הידועים מניתוחים עצמאיים כדי להביע את האנטיגן המעניין, אך דגימות כאלה לא תמיד זמינות1. יתר על כן, רמות הביטוי של אנטיגני המטרה ברקמות ובקרות קו התא מובנות בדרך כלל רק באופן איכותי ועשויות להיות משתנות. בקרות המכילות ריכוזים ידועים וידועים במדויק של אנטיגן מטרה יכולות לסייע באופטימיזציה של תנאי תגובת IHC. שיטה כללית, הניתנת להתאמה למגוון סוגי אנטיגנים בטווח ריכוזים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ליצירת דגימות בקרת IHC סינתטיות, תוארה על ידי המחברים2. פרוטוקול מפורט מסופק כאן ליצירה ושימוש בסוג זה של תקן.

בקרות מתאימות חיוניות לפרשנות תקפה של מבחני IHC 1,3,4. רקמות, תאים בתרבית ומצעים מצופים פפטידים שימשו כבקרות IHC בהתאם לצרכים הספציפיים של החוקרים. היתרונות והמגבלות הטמונים בשימוש ברקמות כבקרות IHC נדונו בהרחבה 1,4. עבור נוגדנים רבים, ניתן לבחור בקרות מתאימות מתוך רקמות נורמליות נבחרות המכילות אוכלוסיות תאים המבטאות את אנטיגן המטרה על פני טווח דינמי רחב. בקרות רקמות מתאימות פחות כאשר אנטיגן המטרה אינו מאופיין היטב לגבי אתר ביטוי או שפע, או כאשר אנטיגנים בעלי פוטנציאל לתגובה צולבת מתבטאים יחד באותם תאים או אתרי רקמה. בהקשרים אלה, בלוקים של קווי תאים בתרבית המבטאים את האנטיגן המעניין יכולים להיות מועילים. כדי לספק ראיות נוספות לספציפיות המטרה, ניתן להנדס את קווי התאים כך שאנטיגנים בעלי ביטוי יתר או תת-ביטוי. לדוגמה, גישה כזו שימשה לאחרונה להערכת מגוון של בדיקות נגד PD-L1 באמצעות מיקרו-מערך רקמה של קווי תאים איזוגניים המבטאים טווח של אנטיגן PD-L15. המגבלות המעשיות לשימוש השגרתי בבלוקים של קווי תאים כוללות את העלות והזמן הדרושים כדי לייצר מספרי תאים מספיקים ואת העובדה שהביטוי של אנטיגנים מסוימים עשוי שלא להיות עקבי באופן אמין, אפילו בתוך שורות תאי קלונל6. פפטידים סינתטיים הם אפשרות שלישית לבקרת IHC עבור נוגדנים המזהים אפיטופים ליניאריים קצרים. סטיבן בוגן ועמיתיו פרסמו בהרחבה על השימוש בפפטידים המוצמדים לפני השטח של שקופיות זכוכית 7,8 וחרוזי זכוכית9. מחקר אחד של קבוצה זו הראה כי ניתוח כמותי של בקרות IHC מבוססות פפטידים יכול לזהות שונות בתהליך הכתם שהוחמצה על ידי הערכה איכותית של בקרות רקמות שנותחו במקביל10. בעוד שתקנים המשתמשים באנטיגנים מבוססי חרוזים יכולים להיות ישימים באופן נרחב, פרטים רבים הם קנייניים עבור המחברים, ומגבילים אימוץ נרחב.

גישה נוספת לתקני IHC משלבת אנטיגנים ממוקדים בג'לים חלבוניים שנוצרו באופן מלאכותי. תפיסה זו הודגמה לראשונה על ידי פר ברנדצאג בשנת 1972 במחקר שבו סרום ארנבים רגיל עבר פולימריזציה באמצעות גלוטרלדהיד11. בלוקים קטנים של הג'ל שנוצר הושרו לאחר מכן במשך 1-4 שבועות בתמיסות המכילות את האנטיגנים האימונוגלובולינים המעניינים בריכוזים שונים. לאחר קיבוע אלכוהול והטבעת פרפין, חלקים מהפקדים שהתקבלו הוכתמו בעוצמות המתאימות ללוגריתם של תמיסות האנטיגן שבהן הושרו. מאוחר יותר, החוקרים הכינו צמדי גלוטארלדהיד של חומצות אמינו ספציפיות ב-BSA מדולל או בתמיסות הומוגנטיות במוח כבקרות חיוביות במחקרי מיקרוסקופיה חיסונית-אלקטרונית 12,13. עבודה עדכנית יותר בחנה את השימוש בג'לים העשויים מתמיסות חלבון קבועות פורמלדהיד כפונדקאיות עבור רקמת FFPE בניתוח ספקטרומטריית מסה14. עבודה נוספת שנערכה לאחרונה בחנה את המבנה והתכונות של ג'לים הנוצרים על ידי חימום תמיסות אלבומין בסרום אנושי או בקר בריכוזים שונים וב-pH15. מחברים אלה מצאו כי אלבומין בסרום יוצר שלושה סוגים של ג'לים הנבדלים זה מזה באלסטיות מכנית, בשימור מבנה משני וביכולת קשירת חומצות שומן בהתאם לתנאי הניסוי. יחד, מאמרים אלה מדגימים את ההיתכנות הכללית של הגישה הנהוגה כאן. תמיסות חלבונים בעלות הרכב מוגדר יוצרות ג'לים דמויי רקמה הניתנים לעיבוד, חתך והכתמה נוספים בשיטות היסטולוגיות שגרתיות.

פרוטוקול זה מתאר את היווצרותה של בקרת IHC סינתטית העשויה מאלבומין בסרום בקר (BSA) שעבר פולימריזציה בחום ובפורמלדהיד. הג'לים יכולים לשלב מגוון רחב של אנטיגנים, כולל חלבונים באורך מלא, תחומי חלבונים ופפטידים ליניאריים, כמו גם אנטיגנים שאינם חלבונים כולל אוליגונוקלאוטידים2. הדגמה זו משתמשת באנטיגן לדוגמה, פפטיד ליניארי המקודד את חומצות האמינו C-terminal 16 של חלבון ERBB2 (HER2/neu) האנושי TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (ראו טבלת חומרים). רצף זה כולל את האפיטופים המוכרים על ידי שלושה נוגדנים זמינים מסחרית ורלוונטיים מבחינה אבחנתית, כולל המגיב הפוליקלונלי הרצפטי ביותר (ENPEYLGLDVP) והנוגדנים החד-שבטיים CB11 (AENPEYL) ו-4B5 (TAENPEYLGL) (ראו טבלת חומרים)16.

השיטה המודגמת כאן משתמשת בריאים בריאים בריאים ריאגנטים באמצעות תהליכים וטכניקות המוכרות לכל מעבדה היסטולוגית מתאמנת. המגבלה המשמעותית ביותר היא הצורך לזהות ולרכוש את האנטיגנים של היעד, דבר שניתן להשיג במקרים רבים בעלות צנועה יחסית. מכיוון שבקרות סינתטיות אלה הן בעלות הרכב מוגדר לחלוטין ועשויות בשיטות פשוטות, ניתן ליישם אותן במעבדות רבות עם תוצאות הניתנות לשחזור. השימוש בהם עשוי להקל על הערכה אובייקטיבית וניתנת לכימות של תוצאות צביעת IHC ולאפשר יכולת שכפול תוך-מעבדתית ובין-מעבדתית גדולה יותר.

Protocol

1. הכנת תמיסת מלאי וכלים

  1. הכן 20 מ"ל של תמיסת BSA של 25% w/v על ידי ערבוב אבקת BSA 5 גרם ב-14 מ"ל של PBS, pH 7.2 בצינור חרוטי של 50 מ"ל עד לפיזור שווה. מערבולת לפי הצורך כדי לפזר את אבקת ה-BSA.
    1. שמור את הפתרון למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר פירוק מלא. התאם את עוצמת הקול הסופית ל- 20 מ"ל עם PBS כדי ליצור פתרון מניות של 25% w/v.
  2. יש להכין 20 מ"ל של תמיסת BSA של 31.3% w/v על ידי ערבוב של 6.26 גרם אבקת BSA ב-13 מ"ל של PBS, pH 7.2 בצינור חרוטי של 50 מ"ל עד לפיזור שווה. שמור את הפתרון למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר פירוק מלא. התאם את הנפח הסופי ל- 20 מ"ל עם PBS כדי ליצור פתרון מניות של 31.3% w/v.
  3. מחממים מראש בלוק חום ל-85 מעלות צלזיוס.
    הערה: הפרוטוקול שלהלן יוצר ג'לים פפטידיים/BSA עם נפחים של 1.26-1.4 מ"ל הנוצרים בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. כדי להשתמש בכמויות קטנות יותר, למשל, כאשר מלאי האנטיגן מגביל, הכינו את הג'לים בצינורות PCR והשתמשו בתרמוצילר המוגדר ל-85 מעלות צלזיוס כגוש חום.
  4. בדקו שתערובת BSA/פורמלדהיד יוצרת ג'ל כצפוי על ידי ערבוב של 700 μL של תמיסת BSA של 25% עם 700 μL של 37% פורמלדהיד. מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה 5 פעמים בתוך 5-10 שניות. הימנעו מיצירת בועות אוויר.
    אזהרה: פורמלדהיד מרוכז הוא רעיל; להשתמש עם אמצעי בטיחות מתאימים.
  5. מיד לאחר ערבוב תמיסות BSA ופורמלדהיד, הניחו את צינור המיקרו-סנטריפוג' הסגור בבלוק חום בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר את הצינור מגוש החום ואפשר לו להתקרר. אשרו כי הג'ל נוצר כצפוי.

2. הכנה ודילול של פפטידים

  1. להשיג 5-20 מ"ג של פפטיד lyophilized של הרצף הרצוי.
    הערה: חומצות האמינו C-terminal 16 של התחום התוך-תאי האנושי ERBB2 המוכר על ידי 4B5 הוא TPTAENPEYLGLDVPV-COOH.
    1. הוסיפו 4 חומצות אמינו ל-N-terminus, אצטיל-YGSG ו-C-terminus, GSGC-amide, כדי להקל על קישור צולב של הפפטיד ל-BSA ולספק ריווח בין מולקולת ה-BSA לאפיטופ הפפטידי.
      הערה: הרצף המלא הוא: אצטיל-YGSGTPTAENPEYLGLDVPVGSGC-אמיד.
    2. אם תרצה בכך, השתמש ברצף חומצות אמינו N ו-C-terminal אחרים כדי להרחיב את האפיטופ של פפטיד הליבה.
      הערה: ההשפעה של רצפים שונים משתנה בהתאם לשילובי נוגדנים/אפיטופים שונים. התוספת של פפטיד C-terminal מפחיתה את הקשירה של נוגדנים מסוימים לאפיטופים של C-terminal. במקרים כאלה, להשמיט את הרצף הזה.
    3. לאשר כי פפטידים ממקורות מסחריים מסופקים בטוהר >95%, שהרכבם מאושר על ידי HPLC וניתוח ספקטרומטריית מסה.
  2. חשב את הנפחים הדרושים עבור 5x (1.25 E-2 M) פתרונות מלאי פפטידים. בהתייחסו לטבלה 1, עמודות C-E, הזן ערכים עבור המשקל המולקולרי של האנטיגן (g/שומה), אחוז טוהר האנטיגן (0-100) ומסת האנטיגן (mg).
    הערה: נפח הממס (ב-μL) להחייאת הדגימה כדי להשיג תמיסת מלאי של 1.25 E-2 M הוא 800 x משקל מולקולרי של אנטיגן x אחוז טוהר אנטיגן/מסת אנטיגן.
    1. הכן ותייג בבירור שמונה צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
      הערה: הצינורות יכילו מלאי פפטידים של 5x בממס, מלאי פפטידים של 1x בממס, חמישה דילולים סדרתיים של 10x של 2.5 E-4 M עד 2.5 E-8 M פפטיד/BSA/ג'ל פורמלדהיד, וג'ל בקרה שלילי המכיל BSA/פורמלדהיד חסר אנטיגן נוסף. כל דגימות הג'ל נראות זהות. בעת הכנת קבוצות מרובות של דילולים פפטידיים בו זמנית, הקפידו לתייג ולזהות את כל הצינורות ואת קלטות העיבוד בצורה נכונה. השתמש בצינורות microcentrifuge מקודדים בצבעים ובקלטות עיבוד במידת האפשר כדי למזער זיהוי שגוי.
  3. הכן תמיסת מלאי פפטידים 5x ב- 1.25 E-2 M על ידי החייאה של כל המסה של פפטיד ליופילי (20 מ"ג עבור הפפטידים ERBB2) ב- 60 μL של הממס המתאים.
    הערה: בדוגמה זו, דימתילפורמיד (DMF) נוסף ישירות למיכל של הספק.
    1. בדוק את התמיסה כדי לוודא שהפפטיד מומס לחלוטין. במידת הצורך, יש להוסיף ממס נוסף ו/או להנמיך את הדגימה עד להמסת הדגימה לחלוטין, תוך הקפדה שלא לחרוג מהנפח המחושב בטבלה 1 עבור מלאי הפפטידים פי 5.
      אזהרה: DMF הוא רעיל; להשתמש בזהירות מתאימה.
      הערה: בהתאם לרצף חומצות האמינו, ולהידרופויביות ולמטען המתאימים, פפטידים עשויים להיות מסיסים ב-DMF, דימתיל סולפוקסיד (DMSO), מים טהורים או תמיסות מדוללות של חומצה אצטית, חומצה פורמית או אמוניום ביקרבונט. ניתן לחשב את מאפייני הפפטידים באמצעות מגוון כלים מקוונים17. ספקי פפטידים מסוימים עשויים להציע ממסים המתאימים לרצפים ספציפיים.
    2. הוסף ממס לפי הצורך כדי להביא את נפח מלאי הפפטידים פי 5 לנפח הסופי המחושב בטבלה 1. מערבולת ל-5 שניות וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב-5000 x גרם ל-5 שניות. ניתן לאחסן פתרונות מלאי פפטידים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  4. בהתייחס לטבלה 2, עמודה C, הכן 150 μL של תמיסת מלאי פפטידים 1x (2.5 E-3 M) על ידי דילול 30 μL של מלאי הפפטידים 5x לתוך 120 μL של ממס (DMF דוגמה זו). מערבולת ל-5 שניות וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב-5000 x גרם ל-5 שניות.
  5. בהתייחס לטבלה 2, עמודה D, הכן 700 μL של 5 תמיסת פפטיד/BSA E-4 M (דילול 1) על-ידי דילול 140 μL של מלאי פפטידים של 1x ל-560 μL של 31.3% BSA/PBS, pH 7.2. מערבולת ל-5 שניות וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב-5000 x גרם ל-5 שניות.
    הערה: ריכוז ה-BSA הסופי של תמיסה זו הוא 25% (w/v).
  6. בהתייחס לטבלה 2, עמודות E-H, מכינות ארבעה דילולים סדרתיים עוקבים של 10x של מלאי הפפטידים/BSA של 5 E-4 M על ידי הוספת 70 μL של תמיסת פפטיד/BSA ל-630 μL של 25% BSA/PBS, pH 7.2. מערבולת ל-5 שניות וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב-5000 x גרם ל-5 שניות.
    הערה: לאחר שלב זה, יהיו חמישה דילולים סדרתיים פי 10 של פפטיד (5 E-4 M עד 5 E-8 M) ב-25% BSA/PBS, pH 7.2. ארבע הדגימות הראשונות יכילו 630 μL. המדגם האחרון יכיל 700 μL.
  7. בהתייחס לטבלה 2, עמודה I, הכינו דגימת BSA של בקרה שלילית המכילה 700 μL של 25% BSA/PBS, pH 7.2 (איור 1A).

3. הכנת ג'לים BSA-פפטידים

  1. ודא כי בלוק החום או thermocycler יציב ב 85 °C (85 °F).
  2. עיין בטבלה 3, עמודות B-E. בעבודה על דגימה אחת בכל פעם, הוסיפו לדגימת ה-BSA/פפטיד הראשונה של 25% (דילול 1) 630 μL של 37% פורמלדהיד. מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה 5 פעמים בתוך 5-10 שניות. הימנעו מיצירת בועות אוויר.
    אזהרה: פורמלדהיד מרוכז הוא רעיל; להשתמש עם אמצעי בטיחות מתאימים.
    1. לאחר ערבוב תמיסות הפפטיד/BSA והפורמלדהיד, הניחו את צינור המיקרו-סנטריפוג' הסגור בבלוק חום בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
      הערה: ערבבו היטב את תמיסת BSA-פפטיד ופורמלדהיד, אך אל תשקיעו יותר מ-10 שניות בצנרת התערובת לפני הנחת הדגימה על חום. מכיוון שחיבור צולב של פורמלדהיד מתחיל באופן מיידי, הג'ל עשוי להיווצר באופן שונה אם ההליך מגוון עבור דגימות שונות. ריכוז ה-BSA הסופי בג'לים אלה הוא 12.5% (w/v). ריכוזי BSA סופיים של פחות מ-10% עשויים להניב ג'לים שאינם מתמצקים; ריכוזי BSA סופיים הגדולים מ-16% עשויים לייצר ג'לים שבירים יותר וקשים יותר לניתוח לאחר העיבוד.
    2. חזור על שלבים 3.2 ו- 3.2.1 עבור כל אחד מהדילולים 2-4.
    3. חזור על שלבים 3.2 ו- 3.2.1 לדילול 5, אך הוסף 700 μL של 37% פורמלדהיד, נפח השווה ל- 700 μL של תמיסת BSA-אנטיגן.
    4. עיין בטבלה 3 עמודה עמודה G; חזור על שלבים 3.2 ו- 3.2.1 עבור מדגם הבקרה השלילית, והוסיף 700 μL של 37% פורמלדהיד, נפח השווה ל- 700 μL של פתרון BSA בקרה שלילית.
  3. הסר את הצינורות מגוש החום לאחר 10-12 דקות. זמן החימום צריך להיות עקבי ככל האפשר עבור כל דגימה. אפשרו לג'לים להתקרר על הספסל למשך 5-10 דקות (איור 1B).
  4. באמצעות מרית מעבדה חד פעמית נקייה וגמישה, הסר את דגימת הג'ל בחתיכה אחת מצינור המיקרוצנטריפוגה, והנח אותה במיכל אטום המכיל לפחות 15 מ"ל של פורמלין נייטרלי (NBF), באמצעות מיכל נפרד של NBF לכל דגימה.
    1. לחלופין, חתכו את החלק התחתון של צינור המיקרו-צנטריפוגה באמצעות סכין גילוח חדשה בעלת קצה יחיד, ודחפו את הג'ל החוצה מהתחתית עם אוויר או בדיקה מתאימה (איור 1C-G).
      הערה: ג'ל הפורמלדהיד/BSA המוצק יכול להישאר בצינורות המיקרוצנטריפוגה בטמפרטורת החדר עד 24 שעות. השארת הג'לים בצינור microcentrifuge במשך יותר מ -24 שעות עלולה לגרום להם להיות שבירים וקשים יותר לעיבוד ולניתוח.

4. חיתוך, עיבוד והטמעה של ג'ל BSA

  1. חותכים את חרוט הג'ל לדיסקים גליליים בעובי של כ-5 מ"מ באמצעות סכין גילוח נקי בעל קצה יחיד (איור 1H,I). עוטפים את הדיסקים בעטיפת ביופסיה, ומניחים דיסק ג'ל אחד גדול יותר לתוך קלטת אחת (שישמש במחקר הפיילוט בשלב 5), ואת דיסקי הג'ל הנותרים יחד לתוך קלטת שנייה (איור 2A,E) לשימוש בבניית מיקרו-מערך רקמות (TMA) בשלב 6. הניחו את דיסקי הג'ל העטופים בקלטות עיבוד רקמות מסומנות בבירור.
    1. מניחים את הג'לים הקסטות בלפחות 15 מ"ל של 10% NBF לכל דגימת ג'ל לפני העיבוד, באמצעות מיכל נפרד של NBF לכל דגימה. ג'לים יכולים להישאר ב-10% NBF למשך 6-48 שעות.
  2. לעבד את הג'לים במעבד רקמות היסטולוגי אוטומטי, בעקבות לוח זמנים גדול של רקמות עם לחץ ואקום. כל צעד לוקח שעה אחת: 10% NBF, 70% אתנול, 95% אתנול (חזור פעמיים), 100% אתנול (חזור פעמיים), קסילנים (חזור שלוש פעמים), פרפין ב-60 מעלות צלזיוס (חזור שלוש פעמים).
    הערה: עבור חוקרים הבוחרים לעבד דגימות באופן ידני, עקוב אחר אותו רצף של ריאגנטים וזמנים.
  3. לאחר השלמת עיבוד הדגימה, הסר את הקסטות ממעבד הרקמה והעבר אותן למרכז הטבעת הפרפין.
  4. פותחים את הג'לים מהביופסיה עוטפים ומטביעים את הג'לים בפרפין. עבור כל דגימה, הטבעו דיסק אחד של ג'ל בתבנית קטנה בגודל 15 מ"מ x 15 מ"מ (איור 2B-D), ואת דיסקי הג'ל הנותרים יחד בתבנית שנייה גדולה יותר (איור 2F-H). הבלוק הראשון עם דגימה אחת ישמש לבדיקת הג'ל הפפטידי במחקר פיילוט. הבלוק השני יכול לשמש לבניית TMA.

5. הערכת פיילוט של סדרת דילול הפפטידים

  1. עבור כל סדרת דילול פפטידים, תכנן ליצור שתי שקופיות זכוכית המכילות בסך הכל 6 חלקים נפרדים: קטע אחד מכל אחת מחמש דגימות סדרת הדילול, בתוספת קטע אחד מדגימת הבקרה השלילית BSA בלבד.
    1. על מגלשת הזכוכית הראשונה, חתכו מקטע אחד בעובי 4 מיקרומטר מכל אחד מהגושים הקטנים יותר המכילים דיסק ג'ל אחד עם שלושת ריכוזי הפפטידים הגבוהים ביותר (2.5 E-4 M עד 2.5 E-6 M).
    2. בשקופית שנייה, חתכו קטע אחד בעובי 4 מיקרומטר מכל בלוק עם שני ריכוזי הפפטידים הנמוכים ביותר (2.5 E-7 M ו-2.5 E-8 M) וקטע אחד מגוש הבקרה של BSA בלבד. רשום את סדר הדוגמאות בשקופיות.
      הערה: צפו שהג'לים המשובצים בפרפין ייחתכו בצורה חלקה, וייצרו מקטעים אחידים ללא פיצול, קריעה או פטפוטים. אם קשה לנתח דגימות ג'ל משובצות פרפין מסוימות, השרו לזמן קצר את פני הבלוק במים מזוקקים קרים כקרח לפני החתך. במידת הצורך, התנסו בזמני השרייה שונים או בתמיסות שונות (למשל, מי אמוניה).
    3. לאחר חתך, ייבשו את המגלשות בטמפרטורת החדר (כ-23 מעלות צלזיוס) למשך 24 שעות ולאחר מכן 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  2. הכתימו את שתי השקופיות שהוכנו עבור כל פפטיד בנוגדן הרצוי בהתאם לפרוטוקולים הסטנדרטיים של IHC.
    הערה: ריכוז הנוגדן העיקרי בהחלקה ששימש לארנבת מונוקלונלית 4B5 בהדגמה זו היה 1.5 מ"ג/מ"ל.
    1. צפו לראות אות אחיד יחסית בתוך כל מקטע ג'ל, כאשר דגימות הג'ל השונות מראות טווח של עוצמת אות המתאימה לדילול הפפטידים.
  3. אם התוצאות של מחקר הפיילוט משביעות רצון, בנו TMA מבלוקים של תורמי ג'ל המכילים ריכוזים שונים של אנטיגן פפטידי, כמתואר בשלבים הבאים של הפרוטוקול.

6. בניית ג'ל TMA של BSA

  1. בנה מיקרו-מערך רקמות המכיל ליבות כפולות בקוטר 1 מ"מ מבלוקים של תורמים המכילים ג'ל BSA בלבד וג'ל BSA המכיל את כל חמשת הדילולים של פפטיד ERBB2.
    הערה: אם תרצה, כלול ג'לים BSA המכילים את אותם חמישה דילולים של פפטיד שאינו מטרה כבקרות שליליות נוספות. אם תרצה, כלול ליבות של קווי תאים מייצגים המבטאים ERBB2 כפקדים חיוביים.
  2. חתכו חלקים בעובי 4 מיקרומטר של ה-TMA והכתימו ב-1.5 מ"ג/מ"ל של אנטי-ERBB2/HER2/neu ארנב מונוקלונלי 4B5 (ראו טבלת חומרים) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים במעבדה.
  3. הערך את עוצמת הכתם המתקבלת באופן איכותי על ידי בדיקה או כמותית על ידי סריקה וניתוח של תמונות דיגיטליות (איור 3A,B).
    הערה: מכיוון שניתוח תמונות דיגיטלי אינו המוקד של פרוטוקול זה, שלבים אלה נותרים לקורא לבצע בהתאם להעדפתו.

תוצאות

פפטידים צריכים להתמוסס לחלוטין בממס מתאים בטמפרטורת החדר כדי ליצור פתרון ברור אופטית. אם חומר חלקיקי נראה לעין עדיין קיים לאחר 30-60 דקות, ייתכן שיהיה זה מועיל להוסיף נפחים נוספים של הממס המקורי או ממס חלופי שאינו עולה על הנפח המיועד של תמיסת מלאי הפפטידים 5x המחושבת בטבלה 1. באופן דו...

Discussion

שיטה זו מאפשרת למשתמש ליצור דגימות אחידות של הרכב ידוע וריכוז אנטיגן כסטנדרטים בתגובות IHC, תוך שימוש בחומרים ובטכניקות המוכרות לרוב מעבדות ההיסטולוגיה. הצעד המכריע ביותר הוא לזהות את האפיטופ שאליו נקשר הנוגדן בעל העניין. פרוטוקול זה מתאר שימוש באנטיגן פפטידי ליניארי מ-ERBB2/HER2 ICD. ניתן להשתמ...

Disclosures

צ'ארלס א. הוואר, קתי ג'יי הוצל, צ'ארלס א. ג'ונס, כרמינה מ. אספיריטו, לינדה ק. ריינג'ל ופרנקלין ו. פייל הם עובדים ובעלי מניות של ג'ננטק ורוש. שלוחותיהם מייצרות ריאגנטים ומכשירים ששימשו במחקר זה.

Acknowledgements

המחברים מודים לעמיתיהם ג'פרי טום ואימין סונג על סינתזת פפטידים, ל-Nianfeng Ge על בניית TMA, לשרי לאו על צביעת IHC, למליסה אדיק על סריקה מיקרוסקופית דיגיטלית, ול-Hai Ngu על כימות תמונה דיגיטלית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-HER2/neu clone 4B5Ventana5278368001
Biopsy WrapsLeica3801090
Bovine Serum Albumin, ultra pureCell Signaling TechnologyBSA #9998
50 mL Conical TubeCorning352070
Disposable base mold (15 mm x 15 mm)Fisher22-363-553
Disposable base mold
(24 mm x 24 mm)		Fisher22-363-554
Disposable spatulaVWR80081-188
Eppendorf ThermomixerEppendorf22331
37% FormaldehydeElectron Microscopy Sciences15686
ERBB2 / HER2 peptideUniProt P04626-1; a.a. 1240-55
Leica Autostainer XLLeicaST5010
Magnetic Stir Bar
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imagerHamamatsu
10% Neutral Buffered FormalinVWR16004-128
Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL
Paraplast paraffinLeica39601006
Peptide parameter calculatorPep-Calc17https://www.pep-calc.com/
Peptide suppliersABclonal ScienceUsers should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
Anaspec PeptideUsers should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
CPC ScientificUsers should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
New England PeptideUsers should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
Phosphate Buffered Saline pH 7.2
Reagent AlcoholThermo Scientific9111
Single Edge RazorVWR55411-050
Superfrost Plus positively charged microscope slidesThermo Scientific6776214
TMA Tissue Grand Master3DHISTECH
XylenesVWR89370-088

References

  1. Torlakovic, E. E., et al. Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).
  2. Hötzel, K. J., et al. Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).
  3. Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
  4. Torlakovic, E. E., et al. Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).
  5. Martinez-Morilla, S., et al. Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray. Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).
  6. Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
  7. Sompuram, S. R., et al. Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets. Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).
  8. Sompuram, S. R., et al. A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).
  9. Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).
  10. Vani, K., et al. Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).
  11. Brandtzaeg, P. Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity. Immunology. 22, 177-183 (1972).
  12. Matute, C., Streit, P. Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity. Histochemistry. 86, 147-157 (1986).
  13. Ottersen, O. P. Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing. Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).
  14. Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. 'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).
  15. Arabi, S. H., et al. Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties. Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).
  16. Schrohl, A. -. S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Brünner, N. Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies. Histopathology. 59, 975-983 (2011).
  17. Lear, S., Cobb, S. L. Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).
  18. Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays. Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).
  19. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  20. Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
  21. Forsström, B., et al. Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).
  22. Forsström, B., et al. Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes. PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).
  23. Prasad, B., et al. Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174ERBB2HER2neu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved