用于免疫组化的合成抗原对照

摘要

这项工作记录了一种为免疫组化创建合成抗原对照的简单方法。该技术适用于各种浓度的抗原。这些样品为评估测定内和测定间的性能和再现性提供了参考。

摘要

免疫组化 （IHC） 检测为蛋白质表达模式提供了有价值的见解，需要对蛋白质表达模式进行可靠的解释，需要对照样品进行明确表征的阳性和阴性对照样品。由于并不总是可以使用适当的组织或细胞系对照，因此创建合成IHC对照的简单方法可能是有益的。此处描述了这种方法。它适用于各种抗原类型，包括蛋白质，肽或寡核苷酸，浓度范围广。该协议解释了创建合成抗原对照所需的步骤，以来自人成红细胞癌基因B2（ERBB2 / HER2）细胞内结构域（ICD）的肽为例，由各种诊断相关抗体识别。将牛血清白蛋白（BSA）溶液中HER2 ICD肽的连续稀释液与甲醛混合，并在85°C下加热10分钟以固化并交联肽/ BSA混合物。所得凝胶可以像组织一样进行处理、切片和染色，产生一系列已知抗原浓度的样品，涵盖广泛的染色强度。

这个简单的方案与常规组织学实验室程序一致。该方法仅要求用户具有足够数量的所需抗原。编码相关表位的重组蛋白、蛋白结构域或线性肽可以在局部或商业上合成。产生内部抗体的实验室可以保留免疫抗原的等分试样作为合成对照靶标。在各种浓度下创建明确定义的阳性对照的机会使用户能够评估实验室内和实验室间的分析性能，深入了解其测定的动态范围和线性度，并针对其特定的实验目标优化测定条件。

引言

免疫组化 （IHC） 允许在福尔马林固定的石蜡包埋 （FFPE） 组织切片中对靶抗原进行灵敏、特异性、空间精确的检测。然而，IHC染色结果可能受到多种变量的影响，包括冷热缺血时间、组织固定、组织预处理、抗体反应性和浓度、测定检测化学和反应时间¹。因此，IHC反应的可重复性能和解释需要严格控制这些变量，并使用表征良好的阳性和阴性对照样品。常用的对照包括石蜡包埋组织或从独立分析中已知的培养细胞系来表达感兴趣的抗原，但此类样品并不总是可用的¹。此外，靶抗原在组织和细胞系对照中的表达水平通常只能定性地理解，并且可能是可变的。含有可重复的、精确已知的目标抗原浓度的对照有助于优化IHC反应条件。作者²已经描述了一种通用方法，该方法适用于在生理相关浓度范围内的各种抗原类型以创建合成的IHC对照样品。这里提供了创建和使用此类标准的详细协议。

适当的对照对于IHC测定的有效解释至关重要^1，3，4。根据研究人员的特定需求，组织，培养的细胞和肽包被的底物用作IHC对照。使用组织作为IHC对照组的固有优点和局限性已被广泛讨论^1，4。对于许多抗体，可以从选定的正常组织中选择合适的对照，这些组织含有在宽动态范围内表达靶抗原的细胞群。当靶抗原在表达位点或丰度方面不能很好地表征时，或者当潜在的交叉反应抗原在相同的细胞或组织位点共表达时，组织对照不太合适。在这些情况下，表达感兴趣抗原的培养细胞系块可能会有所帮助。为了提供靶标特异性的进一步证据，可以将细胞系设计为过度表达或表达不足的靶标抗原。例如，最近使用这种方法来评估各种抗PD-L1测定，使用表达一系列PD-L1抗原⁵的等基因细胞系的组织微阵列。常规使用细胞系块的实际限制包括产生足够细胞数量所需的成本和时间，以及某些抗原的表达可能不可靠地一致，即使在克隆细胞系⁶中也是如此。合成肽是识别短线性表位的抗体的IHC对照的第三种选择。Steven Bogen及其同事已经发表了大量关于将肽耦合到载玻片^7，8 和玻璃珠9表面的^用途。该组的一项研究表明，基于肽的IHC对照的定量分析可以检测通过对平行分析的组织对照进行定性评估而遗漏的染色过程变异¹⁰。虽然使用基于磁珠的抗原的标准品可能广泛适用，但许多细节是作者专有的，限制了广泛采用。

IHC标准的另一种方法是将靶抗原掺入人造蛋白质凝胶中。1972年，Per Brandtzaeg在一项研究中首次证明了这一概念，其中使用戊二醛¹¹聚合了正常的兔血清。然后将所得凝胶的小块在含有不同浓度的目标免疫球蛋白抗原的溶液中浸泡1-4周。在酒精固定和石蜡包埋之后，显示所得对照的部分染色强度对应于它们浸泡的抗原溶液的对数。后来，研究人员在稀释的BSA或脑匀浆溶液中制备了特定氨基酸的戊二醛偶联物，作为免疫电子显微镜研究中的阳性对照^12，13。最近的工作研究了在质谱分析中使用由甲醛固定蛋白质溶液制成的凝胶作为FFPE组织的替代品¹⁴。最近的另一项工作研究了通过加热人或牛血清白蛋白溶液以各种浓度和pH¹⁵形成的凝胶的结构和性质。这些作者发现，血清白蛋白形成三种类型的凝胶，根据实验条件的不同，它们在机械弹性，二级结构保存和脂肪酸结合能力方面有所不同。这些论文共同证明了这里采用的方法的一般可行性。具有明确成分的蛋白质溶液产生组织样凝胶，可以使用常规组织学方法进一步处理，切片和染色。

该协议描述了由牛血清白蛋白（BSA）与热和甲醛聚合而成的合成IHC对照的形成。凝胶可以包含多种抗原，包括全长蛋白、蛋白结构域和线性肽，以及包括寡核苷酸²在内的非蛋白抗原。本演示使用了一个抗原，该肽是一种线性肽，编码人ERBB2（HER2 /neu）蛋白TPTAENPEGLDV-COOH的C端16个氨基酸（参见 材料表）。该序列包括由三种市售的诊断相关抗体识别的表位，包括赫西普斯特多克隆试剂（ENPEYLGLDVP）和单克隆抗体CB11（AENPEYL）和4B5（绦柏）（见 材料表）¹⁶。

这里演示的方法使用任何实践组织学实验室都熟悉的过程和技术来使用现成的试剂。最重要的限制是需要鉴定和购买靶抗原，这在许多情况下可以以相对适度的成本完成。由于这些合成对照具有完全定义的成分并用简单的方法制成，因此它们可以在许多实验室中实施，结果可重复。它们的使用可能有助于对IHC染色结果进行客观，可量化的评估，并允许更高的实验室内和实验室间重现性。

研究方案

1. 储备溶液和工具的制备

1. 通过将5g BSA粉末与14 mL PBS混合，在50 mL锥形管中混合pH 7.2直至均匀分散，制备20 mL 25%w / v BSA溶液。根据需要涡旋以分散BSA粉末。
   1. 将溶液保持在4°C过夜以使其完全溶解。用PBS将最终体积调节至20 mL，制成25%w / v储备溶液。
2. 通过将6.26g BSA粉末与13 mL PBS混合，在50 mL锥形管中混合pH 7.2，直到均匀分散，制备20 mL 31.3%w / v BSA溶液。将溶液保持在4°C过夜以使其完全溶解。用PBS将最终体积调节至20 mL，制成31.3%w / v储备溶液。
3. 将加热块预热至85°C。
   注意:下面的方案产生在1.5 mL微量离心管中形成的体积为1.26-1.4 mL的肽/ BSA凝胶。例如，要使用较小的体积，当抗原储液受到限制时，请在PCR管中制备凝胶，并使用设置为85°C的热循环仪作为热块。
4. 通过将700μL 25%BSA溶液与700μL37%甲醛混合，测试BSA /甲醛混合物是否按预期形成凝胶。通过在5-10秒内上下移液5次充分混合。避免产生气泡。
   注意:浓甲醛有毒;使用时应采取适当的安全预防措施。
5. 在混合BSA和甲醛溶液后，立即将封闭的微量离心管置于85°C的热块中10分钟。从加热块上取下管子，让它冷却。确认凝胶已按预期形成。

2. 肽的制备和稀释

1. 获得所需序列的5-20mg冻干肽。
   注意:4B5识别的人ERBB2细胞内结构域的C端16个氨基酸是TP太烯丙基VPV-COOH。
   1. 向 N 末端乙酰基 YGSG 和 C 末端 GSGC 酰胺中加入 4 个氨基酸，以促进肽与 BSA 的交联，并在 BSA 分子和肽表位之间提供间距。
      注意:完整的序列是:乙酰基-YGS-YGSTP-脊髓灰质型氟化物-酰胺。
   2. 如果需要，使用其他N-和C-末端氨基酸序列来扩展核心肽表位。
      注意:不同序列的影响因不同的抗体/表位组合而异。C端肽的加入减少了一些抗体与C端表位的结合。在这种情况下，请省略此序列。
   3. 确认来自商业来源的肽以>95%的纯度提供，其组成通过HPLC和质谱分析证实。
2. 计算5x（1.25 E-2 M）肽储备溶液的必要体积。参考 表1，C-E列，输入抗原分子量（g /摩尔），抗原纯度百分比（0-100）和抗原质量（mg）的值。
   注意:重悬样品以达到1.25 E-2 M的储备溶液的溶剂体积（以μL为单位）为800 x抗原分子量x%抗原纯度/抗原质量百分比。
   1. 准备并清楚地标记八个1.5 mL微量离心管。
      注意:试管中将含有5x肽储备液，溶剂中含有1x肽储备，5个10x连续稀释的2.5 E-4 M至2.5 E-8 M肽/ BSA /甲醛凝胶，以及含有不含添加抗原的BSA /甲醛的阴性对照凝胶。所有凝胶样品看起来都一样。一次制备多组肽稀释液时，请注意正确标记和识别所有试管和处理盒。尽可能使用颜色编码的微量离心管和加工盒，以尽量减少错误识别。
3. 通过在60μL适当的溶剂中重悬整个质量的冻干肽（ERBB2肽为20mg），在1.25 E-2 M下制备5x肽储备溶液。
   注意:在此示例中，二甲基甲酰胺 （DMF） 直接添加到供应商的容器中。
   1. 检查溶液以确保肽完全溶解。如有必要，加入额外的溶剂和/或超声处理样品，直到肽完全溶解，注意不要超过 表1 中计算的5x肽储备的体积。
      注意:密度纤维化物是有毒的;使用时应采取适当的预防措施。
      注意:根据氨基酸序列以及相应的疏水性和电荷，肽可溶于DMF、二甲基亚砜（DMSO）、纯水或乙酸、甲酸或碳酸氢铵的稀溶液。肽的特征可以使用各种在线工具¹⁷进行计算。一些肽供应商可能会建议适合特定序列的溶剂。
   2. 根据需要加入溶剂，使5x肽储备的体积达到 表1中计算的最终体积。涡旋5秒，室温下以5000× g 离心5秒。肽储备溶液可以储存在-80°C。
4. 参照 表2C列，通过将30μL的5x肽储备液稀释到120μL溶剂中来制备150μL1x肽储备溶液（2.5 E-3 M）（本例为DMF）。涡旋5秒，室温下以5000× g 离心5秒。
5. 参照 表2D列，通过将140μL1x肽储备液稀释到560μL31.3%BSA / PBS，pH 7.2中，制备700μL 5 E-4 M肽/ BSA溶液（稀释1）。涡旋5秒，室温下以5000× g 离心5秒。
   注意:该溶液的最终BSA浓度为25%（w / v）。
6. 参照 表2，列E-H，通过将70μL肽/ BSA溶液加入630μL 25%BSA / PBS，pH 7.2，制备5个连续10倍连续稀释的5个E-4 M肽/ BSA储备液。涡旋5秒，室温下以5000× g 离心5秒。
   注意:在此步骤之后，将在25%BSA / PBS，pH 7.2中进行五次10倍连续稀释的肽（5 E-4 M至5 E-8 M）。前四个样品将含有630μL。最后一个样品将含有700μL。
7. 参照 表2第I列，制备含有700μL 25%BSA / PBS，pH值为7.2的阴性对照BSA样品（图1A）。

3. 制备血链氨基酸肽凝胶

1. 确认热块或热循环仪在85°C下稳定。
2. 请参阅 表 3 的 B-E 列。一次处理一个样品，加入到第一个25%BSA /肽样品（稀释1）630μL的37%甲醛中。通过在5-10秒内上下移液5次充分混合。避免产生气泡。
   注意:浓甲醛有毒;使用时应采取适当的安全预防措施。
   1. 在混合肽/ BSA和甲醛溶液后，将封闭的微量离心管置于85°C的热块中10分钟。
      注意:将BSA肽溶液和甲醛彻底混合，但在将样品置于加热状态之前，不要花费超过10秒的移液混合物。由于甲醛交联立即开始，因此如果不同样品的程序不同，凝胶可能会形成不同。这些凝胶中的最终BSA浓度为12.5%（w / v）。最终BSA浓度低于10%可能会产生不固化的凝胶;最终BSA浓度大于16%可能会在处理后产生更脆且难以切片的凝胶。
   2. 对每种稀释液2-4重复步骤3.2和3.2.1。
   3. 重复步骤3.2和3.2.1稀释5，但加入700μL37%甲醛，体积等于700μLBSA抗原溶液。
   4. 参见 表3 列G列;重复步骤3.2和3.2.1，对于阴性对照样品，加入700μL37%甲醛，体积等于700μL阴性对照BSA溶液。
3. 10-12分钟后从热块中取出管子。每个样品的加热时间应尽可能一致。让凝胶在台面上冷却5-10分钟（图1B）。
4. 使用干净、灵活的一次性实验室刮刀，从微量离心管中取出凝胶样品，并将其放入含有至少15 mL中性缓冲福尔马林（NBF）的密封容器中，每个样品使用单独的NBF容器。
   1. 或者，用新的单刃剃须刀片切断微量离心管的底部，并用空气或合适的探针将凝胶从底部推出（图1C-G）。
      注意:固化的甲醛/ BSA凝胶可以在室温下在微量离心管中保留长达24小时。将凝胶留在微量离心管中超过24小时会导致它们变脆并且更难以处理和切片。

4. 修剪、加工和包埋 BSA 凝胶

1. 使用干净的单刃剃须刀将凝胶锥修剪成约5mm厚的圆柱形圆盘（图1H，I）。将光盘包裹在活检包装中，将一个较大的凝胶盘放入一个盒中（用于步骤5的试点研究），并将剩余的凝胶圆盘一起放入第二个盒中（图2A，E），用于步骤6中的组织微阵列（TMA）构建。将包裹的凝胶圆盘放在明确标记的组织处理盒中。
   1. 在处理之前，将盒状凝胶置于每个凝胶样品至少15 mL的10%NBF中，为每个样品使用单独的NBF容器。凝胶可以在10%NBF中保持6-48小时。
2. 在自动组织学组织处理器中处理凝胶，遵循压力和真空的大组织时间表。每步需要1小时:10%NBF，70%乙醇，95%乙醇（重复两次），100%乙醇（重复两次），二甲苯（重复三次），石蜡在60°C（重复三次）。
   注意:对于选择手动处理样品的研究者，请遵循相同的试剂顺序和时间。
3. 样品处理完成后，从组织处理器中取出盒并将其移动到石蜡包埋中心。
4. 从活检包装中展开凝胶，并将凝胶包埋在石蜡中。对于每个样品，将一个凝胶盘嵌入15 mm x 15 mm的小模具中（图2B-D），并将剩余的凝胶圆盘一起放在第二个较大的模具中（图2F-H）。具有一个样品的第一个块将用于在试点研究中测试肽凝胶。第二个块可用于 TMA 施工。

5. 肽稀释系列的试点评估

1. 对于每个肽稀释系列，计划创建两个载玻片，总共包含6个单独的部分:五个稀释系列样品中的每一个部分，加上一个部分来自仅BSA阴性对照样品。
   1. 在第一张载玻片上，从每个较小的块上切下一个4μm厚的部分，其中包含一个具有三种最高肽浓度（2.5 E-4 M至2.5 E-6 M）的凝胶盘。
   2. 在第二张载玻片上，从每个具有两个最低肽浓度（2.5 E-7 M和2.5 E-8 M）的块中切出一个4μm厚的部分，并从仅BSA的控制块中切出一段。记录幻灯片上样品的顺序。
      注意:预计石蜡包埋的凝胶能够顺利切割，产生均匀的切片，而不会出现碎裂、撕裂或颤振伪影。如果特定的石蜡包埋凝胶样品难以切片，请在切片前将块面短暂浸泡在冰冷的蒸馏水中。如有必要，尝试不同的浸泡时间或不同的溶液（例如，氨水）。
   3. 切片后，在室温（约23°C）下干燥载玻片24小时，然后在60°C下干燥30分钟。
2. 根据标准IHC方案，用所需的抗体对为每个肽制备的两张载玻片进行染色。
   注意:本演示中用于兔单克隆4B5的一抗载玻片浓度为1.5 ug / mL。
   1. 期望在每个凝胶切片中看到相对均匀的信号，不同的凝胶样品显示出与肽稀释液相对应的信号强度范围。
3. 如果试点研究的结果令人满意，则从含有不同浓度肽抗原的凝胶供体块构建TMA，如方案的后续步骤所述。

6. 黑牛血清 TMA 结构

1. 从单独含有BSA凝胶的供体块和含有所有五种稀释的ERBB2肽的BSA凝胶中构建包含重复的1mm直径核心的组织微阵列。
   注意:如果需要，包括含有与附加阴性对照相同的五种非靶肽稀释液的BSA凝胶。如果需要，包括具有代表性的ERBB2表达细胞系的核心作为阳性对照。
2. 根据实验室标准方案，切割4μm厚的TMA切片，并用1.5 ug / mL抗ERBB2 / HER2 /neu兔单克隆4B5染色（参见 材料表）。
3. 通过检查定性地评估产生的染色强度，或通过数字图像扫描和分析定量评估（图3A，B）。
   注意:由于数字图像分析不是该协议的重点，因此这些步骤留给读者根据自己的喜好执行。

结果

肽应在室温下完全溶解在适当的溶剂中以形成光学透明的溶液。如果可见颗粒材料在30-60分钟后仍然存在，则添加额外体积的原始溶剂或替代溶剂可能会有所帮助，不超过 表1中计算的5x肽储备溶液的预期体积。同样，组合的肽/ BSA溶液应保持半透明（图1A）。

肽/ BSA凝胶样品在用37%甲醛加热后应形成不透明的橡胶块（图1B-I

讨论

该方法允许用户使用大多数组织学实验室熟悉的材料和技术，创建已知成分和抗原浓度的均匀样品作为IHC反应的标准。最关键的一步是鉴定目标抗体与之结合的表位。该协议描述了使用来自ERBB2 / HER2 ICD的线性肽抗原。相同的方案可用于形成含有寡核苷酸，荧光标记，蛋白质结构域或全长蛋白质的BSA凝胶。后一种方法有助于抗体与构象表位结合，这些表位不是由单个线性肽序列重建的。例如，含有...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-HER2/neu clone 4B5	Ventana	5278368001
Biopsy Wraps	Leica	3801090
Bovine Serum Albumin, ultra pure	Cell Signaling Technology	BSA #9998
50 mL Conical Tube	Corning	352070
Disposable base mold (15 mm x 15 mm)	Fisher	22-363-553
Disposable base mold (24 mm x 24 mm)	Fisher	22-363-554
Disposable spatula	VWR	80081-188
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	22331
37% Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15686
ERBB2 / HER2 peptide			UniProt P04626-1; a.a. 1240-55
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010
Magnetic Stir Bar
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager	Hamamatsu
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128
Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL
Paraplast paraffin	Leica	39601006
Peptide parameter calculator	Pep-Calc17	https://www.pep-calc.com/
Peptide suppliers	ABclonal Science		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	Anaspec Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	CPC Scientific		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	New England Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
Phosphate Buffered Saline pH 7.2
Reagent Alcohol	Thermo Scientific	9111
Single Edge Razor	VWR	55411-050
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214
TMA Tissue Grand Master	3DHISTECH
Xylenes	VWR	89370-088