Controles de Antígeno Sintético para Imunohistoquímica

Resumo

Este trabalho documenta um método simples para criar controles de antígeno sintético para a imunohistoquímica. A técnica é adaptável a uma variedade de antígenos em uma ampla gama de concentrações. As amostras fornecem uma referência para avaliar o desempenho intra e o ensaio e a reprodutibilidade.

Resumo

Os ensaios de imunohistoquímica (IHC) fornecem insights valiosos sobre padrões de expressão proteica, a interpretação confiável da qual requer amostras de controle positivas e negativas bem caracterizadas. Como os controles adequados de tecido ou linha celular nem sempre estão disponíveis, um método simples para criar controles sintéticos de IHC pode ser benéfico. Tal método é descrito aqui. É adaptável a vários tipos de antígeno, incluindo proteínas, peptídeos ou oligonucleotídeos, em uma ampla gama de concentrações. Este protocolo explica as etapas necessárias para a criação de controles de antígeno sintético, utilizando como exemplo um peptídeo do domínio intracelular oncogene B2 (ERBB2/HER2) reconhecido por uma variedade de anticorpos diagnosticicamente relevantes. Diluições seriais do peptídeo HER2 ICD em grédulo bovino (BSA) são misturadas com formaldeído e aquecidas por 10 min a 85 °C para solidificar e cruzar a mistura peptídeo/BSA. O gel resultante pode ser processado, seccionado e manchado como um tecido, produzindo uma série de amostras de concentrações de antígeno conhecidas abrangendo uma ampla gama de intensidades de coloração.

Este protocolo simples é consistente com procedimentos de laboratório de histologia de rotina. O método exige apenas que o usuário tenha uma quantidade suficiente do antígeno desejado. Proteínas recombinantes, domínios proteicos ou peptídeos lineares que codificam epítopos relevantes podem ser sintetizados localmente ou comercialmente. Laboratórios que geram anticorpos internos podem reservar alíquotas do antígeno imunizante como alvo de controle sintético. A oportunidade de criar controles positivos bem definidos em uma ampla gama de concentrações permite que os usuários avaliem o desempenho de ensaios intra e inter-laboratorial, obtenham insights sobre o alcance dinâmico e linearidade de seus ensaios e otimizem condições de ensaio para seus objetivos experimentais particulares.

Introdução

A imunohistoquímica (IHC) permite a detecção sensível e específica e espacialmente precisa de antígenos de destino em seções de tecido com fixo de formalina e parafina (FFPE). No entanto, os resultados de coloração do IHC podem ser afetados por múltiplas variáveis, incluindo tempo de isquemia quente e fria, fixação tecidual, pré-tratamento de tecido, reatividade e concentração de anticorpos, química de detecção de ensaios e vezes^{de reação 1}. Assim, o desempenho reprodutível e a interpretação das reações do IHC requerem um controle rigoroso dessas variáveis e o uso de amostras de controle positivas e negativas bem caracterizadas. Os controles frequentemente utilizados incluem tecidos embutidos em parafina ou linhas de células cultivadas conhecidas a partir de análises independentes para expressar o antígeno de interesse, mas essas amostras nem sempre estão disponíveis¹. Além disso, os níveis de expressão dos antígenos alvo em tecidos e controles de linha celular são geralmente compreendidos apenas qualitativamente e podem ser variáveis. Controles contendo concentrações reprodutíveis e precisamente conhecidas de antígeno alvo podem auxiliar na otimização das condições de reação do IHC. Um método geral, adaptável a uma variedade de tipos de antígenos em uma gama fisiologicamente relevante de concentrações para criar amostras de controle de IHC sintéticas, foi descrito pelos autores². Um protocolo detalhado é fornecido aqui para a criação e uso deste tipo de padrão.

Os controles apropriados são essenciais para a interpretação válida dos ensaios^{iHC 1,3,4}. Tecidos, células cultivadas e substratos revestidos de peptídeos têm sido empregados como controles de IHC de acordo com as necessidades específicas dos investigadores. As vantagens e limitações inerentes ao uso de tecidos como controles de IHC foram amplamente discutidas ^1,4. Para muitos anticorpos, os controles apropriados podem ser escolhidos a partir de tecidos normais selecionados contendo populações celulares expressando o antígeno alvo em uma ampla faixa dinâmica. Os controles teciduais são menos adequados quando o antígeno alvo não é bem caracterizado em relação ao local de expressão ou abundância, ou quando antígenos potencialmente de reação cruzada são co-expressos nas mesmas células ou locais de tecido. Nesses contextos, blocos de linhas de células cultivadas expressando o antígeno de interesse podem ser úteis. Para fornecer mais evidências de especificidade de alvo, as linhas de celular podem ser projetadas para antígenos de alvos sobre-ou menos expressos. Por exemplo, tal abordagem foi recentemente usada para avaliar uma variedade de ensaios anti-PD-L1 usando uma microarraia tecidual de linhas celulares isogênicas expressando uma gama de antígeno PD-L1⁵. Limitações práticas ao uso rotineiro de blocos de linha celular incluem o custo e o tempo necessários para produzir números celulares suficientes e o fato de que a expressão de alguns antígenos pode não ser confiável consistente, mesmo dentro das linhas de células clonais⁶. Peptídeos sintéticos são uma terceira opção para controles IHC para anticorpos que reconhecem epítopos lineares curtos. Steven Bogen e colegas publicaram extensivamente sobre o uso de peptídeos acoplado à superfície de lâminas de vidro ^7,8 e contas de vidro⁹. Um estudo desse grupo demonstrou que a análise quantitativa dos controles de IHC baseados em peptídeos poderia detectar variação do processo de coloração perdida pela avaliação qualitativa dos controles teciduais analisados em^{paralelo 10}. Embora os padrões que usam antígenos baseados em contas possam ser amplamente aplicáveis, muitos detalhes são proprietários dos autores, limitando a adoção generalizada.

Outra abordagem aos padrões de IHC incorpora antígenos-alvo em géis proteicos criados artificialmente. Este conceito foi demonstrado pela primeira vez por Per Brandtzaeg em 1972 em um estudo no qual o soro de coelho normal foi polimerizado usando glutaraldeído¹¹. Pequenos blocos do gel resultante foram então encharcados por 1-4 semanas em soluções contendo os antígenos de imunoglobulina de interesse em várias concentrações. Após a fixação do álcool e a incorporação de parafinas, seções dos controles resultantes mostraram-se manchas com intensidades correspondentes ao logaritmo das soluções de antígeno em que haviam sido encharcadas. Mais tarde, os pesquisadores prepararam conjugados de glutaraldeído de aminoácidos específicos em soluções de BSA diluída ou homogeneizar cérebro como controles positivos em estudos de microscopia imuno-elétron^12,13. Trabalho mais recente investigou o uso de géis feitos a partir de soluções proteicas fixas por formaldeído como substitutos para o tecido FFPE na análise de espectrometria de massa¹⁴. Outro trabalho recente investigou a estrutura e propriedades dos géis formados pelo aquecimento de soluções de albumina de soro humano ou bovino em diversas concentrações e pH¹⁵. Esses autores descobriram que a albumina séum forma três tipos de géis que diferem na elasticidade mecânica, preservação da estrutura secundária e capacidade de ligação de ácidos graxos, dependendo das condições experimentais. Juntos, esses trabalhos demonstram a viabilidade geral da abordagem aqui empregada. Soluções proteicas de composição definida criam géis semelhantes a tecidos que podem ser processados, seccionados e manchados usando métodos histológicos de rotina.

Este protocolo descreve a formação de um controle de IHC sintético feito de albumina de soro bovino (BSA) polimerizada com calor e formaldeído. Os géis podem incorporar uma grande variedade de antígenos, incluindo proteínas de comprimento total, domínios de proteínas e peptídeos lineares, bem como antígenos não proteicos, incluindo oligonucleotídeos². Esta demonstração usa um exemplo de antígeno um peptídeo linear codificando os aminoácidos C-terminal 16 da proteína humana ERBB2 (HER2/neu) TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (ver Tabela de Materiais). Esta sequência inclui os epítos reconhecidos por três anticorpos comercialmente disponíveis e relevantes diagnósticos, incluindo o reagente policlonal Herceptest (ENPEYLGLDVP) e os anticorpos monoclonais CB11 (AENPEYL) e 4B5 (TAENPEYLGL) (ver Tabela de Materiais)¹⁶.

O método aqui demonstrado emprega reagentes prontamente disponíveis utilizando processos e técnicas familiares a qualquer laboratório de histologia praticante. A limitação mais significativa é a necessidade de identificar e comprar os antígenos alvo, que podem ser realizados em muitos casos a um custo relativamente modesto. Como esses controles sintéticos são de composição totalmente definida e feitos com métodos simples, eles podem ser implementados em muitos laboratórios com resultados reprodutíveis. Seu uso pode facilitar a avaliação objetiva e quantificável dos resultados de coloração do IHC e permitir maior reprodutibilidade intra e interseção de laboratório.

Protocolo

1. Elaboração de solução de estoque e ferramentas

1. Prepare 20 mL de uma solução BSA de 25% w/v misturando pó BSA de 5 g em 14 mL de PBS, pH 7,2 em um tubo cônico de 50 mL até dispersar uniformemente. Vórtice, conforme necessário, para dispersar o pó BSA.
   1. Mantenha a solução durante a noite a 4 °C para permitir a dissolução completa. Ajuste o volume final para 20 mL com PBS para fazer uma solução de estoque de 25% em w/v.
2. Prepare 20 mL de uma solução BSA de 31,3% w/v misturando pó BSA de 6,26 g em 13 mL de PBS, pH 7,2 em um tubo cônico de 50 mL até dispersar uniformemente. Mantenha a solução durante a noite a 4 °C para permitir a dissolução completa. Ajuste o volume final para 20 mL com PBS para fazer uma solução de estoque de 31,3% em w/v.
3. Pré-aqueça um bloco de calor a 85 °C.
   NOTA: O protocolo abaixo cria gels peptídeos/BSA com volumes de 1,26-1,4 mL formados em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL. Para usar volumes menores, por exemplo, quando os estoques de antígeno são limitados, prepare os géis em tubos PCR e use um termociclador definido para 85 °C como um bloco de calor.
4. Teste que a mistura BSA/formaldeído forme um gel como esperado, misturando 700 μL de solução BSA de 25% com 700 μL de 37% de formaldeído. Misture bem por pipetting para cima e para baixo 5 vezes dentro de 5-10 s. Evite criar bolhas de ar.
   ATENÇÃO: Formaldeído concentrado é tóxico; usar com as devidas precauções de segurança.
5. Imediatamente após a mistura das soluções BSA e formaldeído, coloque o tubo de microcentrifusidade fechado em um bloco de calor a 85 °C por 10 minutos. Retire o tubo do bloco de calor e deixe esfriar. Confirme se o gel se formou como esperado.

2. Preparação e diluição de peptídeos

1. Obtenha 5-20 mg de peptídeo liofilizado da sequência desejada.
   NOTA: O C-terminal 16 aminoácidos do domínio intracelular ERBB2 humano reconhecido pelo 4B5 é TPTAENPEYLGLDVPV-COOH.
   1. Adicione 4 aminoácidos ao N-terminus, acetil-YGSG e C-terminus, GSGC-amide para facilitar a ligação cruzada do peptídeo ao BSA e fornecer espaçamento entre a molécula BSA e o epítope de peptídeo.
      NOTA: A sequência completa é: acetil-YGSGTPTAENPEYLGLDVPVGSGC-amide.
   2. Se desejar, use outras sequências de aminoácidos n e c-terminal para estender o epítope de peptídeo central.
      NOTA: O impacto de diferentes sequências varia com diferentes combinações de anticorpos/epítopes. A adição do peptídeo terminal C reduz a ligação de alguns anticorpos aos epítopos terminais C. Nesses casos, omita essa sequência.
   3. Confirme que peptídeos de fontes comerciais são fornecidos com >95% de pureza, sendo que a composição é confirmada pelo HPLC e pela análise de espectrometria de massa.
2. Calcule os volumes necessários para as soluções de estoque de peptídeos 5x (1,25 E-2 M). Referindo-se à Tabela 1, colunas C-E, insira valores para o peso molecular do antígeno (g/mole), pureza percentual de antígeno (0-100) e massa de antígeno (mg).
   NOTA: O volume de solvente (em μL) para resuspendar a amostra para alcançar uma solução de estoque de 1,25 E-2 M é 800 x peso molecular de antígeno x por cento de pureza/massa de antígeno.
   1. Prepare e rotule claramente oito tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL.
      NOTA: Os tubos conterão 5x de peptídeo em um solvente, 1x de peptídeo em um solvente, cinco diluições seriais de 10x de 2,5 E-4 M a 2,5 E-8 M peptídeo/BSA/gel de formaldeído, e um gel de controle negativo contendo BSA/formaldeído sem antígeno adicionado. Todas as amostras de gel parecem idênticas. Ao preparar vários conjuntos de diluições de peptídeos ao mesmo tempo, tome cuidado para rotular e identificar todos os tubos e processar fitas corretamente. Use tubos de microcentrifuuge codificados por cores e fitas de processamento sempre que possível para minimizar a identificação errada.
3. Prepare uma solução de estoque de peptídeo de 5x a 1,25 E-2 M, reutilizando toda a massa de peptídeo liofilizado (20 mgs para os peptídeos ERBB2) em 60 μL do solvente apropriado.
   NOTA: Neste exemplo, a dimetilformamida (DMF) foi adicionada diretamente ao recipiente do fornecedor.
   1. Inspecione a solução para garantir que o peptídeo seja completamente dissolvido. Se necessário, adicione solvente adicional e/ou sonicar a amostra até que o peptídeo seja completamente dissolvido, tomando cuidado para não exceder o volume calculado na Tabela 1 para o estoque de peptídeo de 5x.
      ATENÇÃO: A DMF é tóxica; usar com a devida precaução.
      NOTA: Dependendo da sequência de aminoácidos, e da hidrofobiidade e carga correspondentes, os peptídeos podem ser solúveis em DMF, sulfóxido de dimetil (DMSO), água pura ou soluções diluídas de ácido acético, ácido fórmico ou bicarbonato de amônio. As características do peptídeo podem ser calculadas usando uma variedade de ferramentas online¹⁷. Alguns fornecedores de peptídeos podem sugerir solventes apropriados para sequências específicas.
   2. Adicione solvente conforme necessário para trazer o volume do estoque de peptídeo de 5x para o volume final calculado na Tabela 1. Vórtice para 5 s e centrífuga à temperatura ambiente a 5000 x g para 5 s. As soluções de estoque de peptídeos podem ser armazenadas a -80 °C.
4. Referindo-se à Tabela 2, Coluna C, prepare 150 μL de solução de estoque de peptídeo 1x (2,5 E-3 M) diluindo 30 μL do estoque de peptídeos de 5x em 120 μL de solvente (DMF neste exemplo). Vórtice para 5 s e centrífuga à temperatura ambiente a 5000 x g para 5 s.
5. Referindo-se à Tabela 2, Coluna D, prepare 700 μL de solução de peptídeo/BSA de 5 E-4 M (Diluição 1) diluindo 140 μL de 1x de peptídeo em 560 μL de 31,3% BSA/PBS, pH 7,2. Vórtice para 5 s e centrífuga à temperatura ambiente a 5000 x g para 5 s.
   NOTA: A concentração final de BSA desta solução é de 25% (c/v).
6. Referindo-se à Tabela 2, as colunas E-H preparam quatro diluições seriais sucessivas de 10x do estoque de peptídeo/BSA de 5 E-4 M adicionando 70 μL de peptídeo/solução BSA a 630 μL de 25% BSA/PBS, pH 7.2. Vórtice para 5 s e centrífuga à temperatura ambiente a 5000 x g para 5 s.
   NOTA: Após esta etapa, haverá cinco diluições seriais de peptídeos em 10 vezes (5 E-4 M a 5 E-8 M) em 25% BSA/PBS, pH 7.2. As quatro primeiras amostras conterão 630 μL. A última amostra conterá 700 μL.
7. Referindo-se à Tabela 2, Coluna I, prepare uma amostra BSA de controle negativo contendo 700 μL de 25% BSA/PBS, pH 7.2 (Figura 1A).

3. Preparando géis BSA-peptídeos

1. Confirme se o bloco de calor ou termociclador está estável a 85 °C.
2. Consulte a Tabela 3, Colunas B-E. Trabalhando uma amostra de cada vez, adicione à primeira amostra de 25% BSA/peptídeo (Diluição 1) 630 μL de 37% de formaldeído. Misture bem por pipetting para cima e para baixo 5 vezes dentro de 5-10 s. Evite criar bolhas de ar.
   ATENÇÃO: Formaldeído concentrado é tóxico; usar com as devidas precauções de segurança.
   1. Depois de misturar as soluções peptídeo/BSA e formaldeído, coloque o tubo de microcentrifusagem fechado em um bloco de calor a 85 °C por 10 min.
      NOTA: Misture bem a solução BSA-peptídeo e o formaldeído, mas não gaste mais de 10 s tubos da mistura antes de colocar a amostra em fogo. Uma vez que a ligação cruzada do formaldeído começa imediatamente, o gel pode se formar de forma diferente se o procedimento for variado para diferentes amostras. A concentração final de BSA nesses géis é de 12,5% (w/v). As concentrações finais de BSA inferiores a 10% podem produzir géis que não se solidificam; concentrações bsa finais superiores a 16% podem produzir géis mais frágeis e difíceis de seção após o processamento.
   2. Repita as etapas 3.2 e 3.2.1 para cada uma das diluições 2-4.
   3. Repita as etapas 3.2 e 3.2.1 para diluição 5, mas adicione 700 μL de formaldeído de 37%, um volume igual aos 700 μL da solução BSA-antígeno.
   4. Consulte a coluna Tabela 3 Coluna G; repetição de passos 3.2 e 3.2.1 para a amostra de controle negativo, adicionando 700 μL de 37% de formaldeído, volume igual aos 700 μL da solução BSA de controle negativo.
3. Remova os tubos do bloco de calor após 10-12 min. O tempo de aquecimento deve ser o mais consistente possível para cada amostra. Deixe os géis esfriarem no banco por 5-10 min (Figura 1B).
4. Utilizando uma espátula de laboratório descartável limpa e flexível, remova a amostra de gel em uma peça do tubo de microcentrifuuuagem e coloque-a em um recipiente selado contendo pelo menos 15 mL de formalina tamponada neutra (NBF), utilizando um recipiente separado de NBF para cada amostra.
   1. Alternativamente, corte a parte inferior do tubo de microcentrifuge com uma nova lâmina de barbear de borda única, e empurre o gel para fora da parte inferior com ar ou uma sonda adequada (Figura 1C-G).
      NOTA: Os géis formaldeído/BSA solidificados podem permanecer nos tubos de microcentrifuuge à temperatura ambiente por até 24 h. Deixar os géis no tubo de microcentrifuuge por mais de 24 h pode fazer com que eles se tornem frágeis e mais difíceis de processar e seção.

4. Aparar, processar e incorporar géis BSA

1. Corte o cone de gel em discos cilíndricos com aproximadamente 5 mm de espessura usando uma lâmina de borda única limpa (Figura 1H,I). Enrole os discos em um envoltório de biópsia, colocando um disco de gel maior em um (a ser usado no estudo piloto na etapa 5), e os discos de gel restantes juntos em um segundo (Figura 2A,E) para uso na construção de microarray tecidual (TMA) na etapa 6. Coloque os discos de gel embrulhados em fitas de processamento de tecido claramente rotuladas.
   1. Coloque os géis cassetted em pelo menos 15 mL de 10% NBF por amostra de gel antes do processamento, utilizando um recipiente separado de NBF para cada amostra. Os géis podem permanecer em 10% NBF por 6-48 h.
2. Processe os géis em um processador automatizado de tecido histologia, seguindo um grande cronograma de tecido com pressão e vácuo. Cada passo leva 1h: 10% NBF, 70% etanol, 95% etanol (repetir duas vezes), 100% etanol (repetir duas vezes), xileno (repetir três vezes), parafina a 60 °C (repetir três vezes).
   NOTA: Para os investigadores que optarem por processar amostras manualmente, siga a mesma sequência de reagentes e horários.
3. Quando o processamento da amostra estiver concluído, remova as fitas do processador de tecido e mova-as para o centro de incorporação da parafina.
4. Desembrulhe os géis do envoltório da biópsia e incorpore os géis em parafina. Para cada amostra, incorpore um disco de gel em um pequeno molde de 15 mm x 15 mm (Figura 2B-D), e os discos de gel restantes juntos em um segundo molde maior (Figura 2F-H). O primeiro bloco com uma amostra será usado para testar o gel de peptídeo em um estudo piloto. O segundo bloco pode ser usado para construção de TMA.

5. Avaliação piloto da série de diluição de peptídeos

1. Para cada série de diluição de peptídeos, planeje criar dois slides de vidro contendo um total de 6 seções separadas: uma seção de cada uma das cinco amostras da série de diluição, mais uma seção da amostra de controle negativo somente BSA.
   1. No primeiro slide de vidro, corte uma seção de 4 μm de espessura de cada um dos blocos menores contendo um disco de gel com as três concentrações mais altas de peptídeo (2,5 E-4 M a 2,5 E-6 M).
   2. Em um segundo slide, corte uma seção de 4 μm de espessura de cada bloco com as duas concentrações de peptídeos mais baixas (2,5 E-7 M e 2,5 E-8 M) e uma seção do bloco de controle somente BSA. Regisso ordem das amostras nos slides.
      NOTA: Espere que os géis embutidos na parafina cortem suavemente, produzindo seções uniformes sem fragmentação, rasgos ou artefato tagarelando. Se amostras específicas de gel embarcadas em parafina forem difíceis de seção, mergulhe brevemente a face do bloco em água destilada gelada antes da secção. Se necessário, experimente com diferentes tempos de imersão ou com soluções diferentes (por exemplo, água de amônia).
   3. Após a secção, seque os slides à temperatura ambiente (cerca de 23 °C) por 24 h seguido de 60 °C por 30 min.
2. Colora os dois slides preparados para cada peptídeo com o anticorpo desejado de acordo com os protocolos padrão de IHC.
   NOTA: A concentração primária de anticorpos no slide utilizada para coelho monoclonal 4B5 nesta demonstração foi de 1,5 ug/mL.
   1. Espere ver um sinal relativamente uniforme dentro de cada seção de gel, com as diferentes amostras de gel mostrando uma faixa de intensidade de sinal correspondente às diluições do peptídeo.
3. Se os resultados do estudo piloto forem satisfatórios, construa um TMA a partir dos blocos doadores de gel contendo diferentes concentrações de antígeno de peptídeo, conforme descrito nos próximos passos do protocolo.

6. Construção de TMA gel BSA

1. Construa uma microarray tecidual contendo núcleos duplicados de 1 mm de diâmetro a partir de blocos de doadores contendo gel BSA sozinho e géis BSA contendo todas as cinco diluições de peptídeo ERBB2.
   NOTA: Se desejar, inclua géis BSA contendo as mesmas cinco diluições de um peptídeo não-alvo como controles negativos adicionais. Se desejar, inclua núcleos de linhas celulares representativas erbb2 expressando como controles positivos.
2. Corte 4 μm de espessura do TMA e colora com 1,5 ug/mL de monoclonal de coelho anti-ERBB2/HER2/neu rabbit 4B5 (ver Tabela de Materiais) de acordo com protocolos padrão de laboratório.
3. Avalie a intensidade da mancha resultante qualitativamente por inspeção ou quantitativamente por digitalização e análise de imagens digitais (Figura 3A,B).
   NOTA: Como a análise de imagem digital não é o foco deste protocolo, essas etapas são deixadas para o leitor realizar de acordo com sua preferência.

Resultados

Os peptídeos devem dissolver-se inteiramente em um solvente apropriado à temperatura ambiente para formar uma solução opticamente clara. Se o material de partículas visíveis ainda estiver presente após 30-60 min, pode ser útil adicionar volumes adicionais do solvente original ou um solvente alternativo não excedendo o volume pretendido da solução de estoque de peptídeo de 5x calculada na Tabela 1. Da mesma forma, a solução de peptídeo/BSA combinada deve permanecer translúcida (

Discussão

Este método permite ao usuário criar amostras uniformes de composição conhecida e concentração de antígenos como padrões em reações de IHC, utilizando materiais e técnicas familiares à maioria dos laboratórios de histologia. O passo mais crucial é identificar o epítope ao qual o anticorpo de interesse se liga. Este protocolo descreve o uso de um antígeno de peptídeo linear da CID ERBB2/HER2. O mesmo protocolo pode ser usado para formar géis BSA contendo oligonucleotídeos, rótulos fluorescentes, domín...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-HER2/neu clone 4B5	Ventana	5278368001
Biopsy Wraps	Leica	3801090
Bovine Serum Albumin, ultra pure	Cell Signaling Technology	BSA #9998
50 mL Conical Tube	Corning	352070
Disposable base mold (15 mm x 15 mm)	Fisher	22-363-553
Disposable base mold (24 mm x 24 mm)	Fisher	22-363-554
Disposable spatula	VWR	80081-188
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	22331
37% Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15686
ERBB2 / HER2 peptide			UniProt P04626-1; a.a. 1240-55
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010
Magnetic Stir Bar
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager	Hamamatsu
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128
Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL
Paraplast paraffin	Leica	39601006
Peptide parameter calculator	Pep-Calc17	https://www.pep-calc.com/
Peptide suppliers	ABclonal Science		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	Anaspec Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	CPC Scientific		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	New England Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
Phosphate Buffered Saline pH 7.2
Reagent Alcohol	Thermo Scientific	9111
Single Edge Razor	VWR	55411-050
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214
TMA Tissue Grand Master	3DHISTECH
Xylenes	VWR	89370-088