Синтетический контроль антигена для иммуногистохимии

Резюме

Эта работа документирует простой метод создания синтетических антигенов для иммуногистохимии. Методика адаптируется к различным антигенам в широком диапазоне концентраций. Образцы служат ориентиром для оценки эффективности и воспроизводимости внутри- и межанализа.

Аннотация

Анализы иммуногистохимии (IHC) дают ценную информацию о паттернах экспрессии белка, надежная интерпретация которых требует хорошо охарактеризованных положительных и отрицательных контрольных образцов. Поскольку соответствующие элементы управления тканями или клеточными линиями не всегда доступны, простой метод создания синтетических элементов контроля IHC может быть полезным. Такой способ описан здесь. Он адаптируется к различным типам антигенов, включая белки, пептиды или олигонуклеотиды, в широком диапазоне концентраций. Этот протокол объясняет шаги, необходимые для создания синтетического контроля антигена, используя в качестве примера пептид из эритробластного онкогена человека B2 (ERBB2 / HER2) внутриклеточного домена (ICD), распознаваемого различными диагностически значимыми антителами. Серийные разведения пептида HER2 ICD в растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA) смешивают с формальдегидом и нагревают в течение 10 мин при 85 °C для затвердевания и сшивки смеси пептид/BSA. Полученный гель может быть обработан, разделен и окрашен как ткань, что дает серию образцов известных концентраций антигенов, охватывающих широкий диапазон интенсивности окрашивания.

Этот простой протокол согласуется с обычными лабораторными процедурами гистологии. Метод требует только, чтобы у пользователя было достаточное количество желаемого антигена. Рекомбинантные белки, белковые домены или линейные пептиды, кодирующие соответствующие эпитопы, могут синтезироваться локально или коммерчески. Лаборатории, генерирующие собственные антитела, могут резервировать аликвоты иммунизирующего антигена в качестве синтетической контрольной мишени. Возможность создания четко определенных положительных элементов управления в широком диапазоне концентраций позволяет пользователям оценивать эффективность внутри- и межлабораторного анализа, получать представление о динамическом диапазоне и линейности своих анализов и оптимизировать условия анализа для своих конкретных экспериментальных целей.

Введение

Иммуногистохимия (IHC) позволяет чувствительно и специфично, пространственно точно обнаруживать антигены-мишени в формалин-фиксированных, парафиновых (FFPE) участках тканей. Однако на результаты окрашивания IHC могут влиять несколько переменных, включая время теплой и холодной ишемии, фиксацию тканей, предварительную обработку тканей, реактивность и концентрацию антител, химию обнаружения анализа и время реакции¹. Соответственно, воспроизводимые характеристики и интерпретация реакций МГК требуют строгого контроля этих переменных и использования хорошо охарактеризованных положительных и отрицательных контрольных образцов. Часто используемые конт....

протокол

1. Подготовка складского раствора и инструментов

1. Готовят 20 мл 25% мас./об.раствора BSA путем смешивания 5 г порошка BSA в 14 мл PBS, рН 7,2 в конической пробирке объемом 50 мл до равномерного диспергирования. Вихрь по мере необходимости диспергирует порошок BSA.
   1. Держите раствор в течение ночи при температуре 4 °C, чтобы обеспечить полное растворение. Отрегулируйте конечный объем до 20 мл с помощью PBS, чтобы получить 25% мас./v запасной раствор.
2. Готовят 20 мл 31,3% мас./об.раствора BSA путем смешивания 6,26 г порошка BSA в 13 мл PBS, рН 7,2 в конической пробирке объемом 50 мл до равномерного диспергирования. Держите раствор в те....

Результаты

Пептиды должны полностью растворяться в соответствующем растворителе при комнатной температуре с образованием оптически прозрачного раствора. Если видимый твердый материал все еще присутствует через 30-60 мин, может быть полезно добавить дополнительные объемы исходного растворителя .......

Обсуждение

Этот метод позволяет пользователю создавать однородные образцы известного состава и концентрации антигена в качестве стандартов в реакциях IHC, используя материалы и методы, знакомые большинству гистологических лабораторий. Наиболее важным шагом является идентификация эпитопа, с кот.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-HER2/neu clone 4B5	Ventana	5278368001
Biopsy Wraps	Leica	3801090
Bovine Serum Albumin, ultra pure	Cell Signaling Technology	BSA #9998
50 mL Conical Tube	Corning	352070
Disposable base mold (15 mm x 15 mm)	Fisher	22-363-553
Disposable base mold (24 mm x 24 mm)	Fisher	22-363-554
Disposable spatula	VWR	80081-188
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	22331
37% Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15686
ERBB2 / HER2 peptide			UniProt P04626-1; a.a. 1240-55
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010
Magnetic Stir Bar
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager	Hamamatsu
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128
Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL
Paraplast paraffin	Leica	39601006
Peptide parameter calculator	Pep-Calc17	https://www.pep-calc.com/
Peptide suppliers	ABclonal Science		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	Anaspec Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	CPC Scientific		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	New England Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
Phosphate Buffered Saline pH 7.2
Reagent Alcohol	Thermo Scientific	9111
Single Edge Razor	VWR	55411-050
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214
TMA Tissue Grand Master	3DHISTECH
Xylenes	VWR	89370-088