JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Эта работа документирует простой метод создания синтетических антигенов для иммуногистохимии. Методика адаптируется к различным антигенам в широком диапазоне концентраций. Образцы служат ориентиром для оценки эффективности и воспроизводимости внутри- и межанализа.

Аннотация

Анализы иммуногистохимии (IHC) дают ценную информацию о паттернах экспрессии белка, надежная интерпретация которых требует хорошо охарактеризованных положительных и отрицательных контрольных образцов. Поскольку соответствующие элементы управления тканями или клеточными линиями не всегда доступны, простой метод создания синтетических элементов контроля IHC может быть полезным. Такой способ описан здесь. Он адаптируется к различным типам антигенов, включая белки, пептиды или олигонуклеотиды, в широком диапазоне концентраций. Этот протокол объясняет шаги, необходимые для создания синтетического контроля антигена, используя в качестве примера пептид из эритробластного онкогена человека B2 (ERBB2 / HER2) внутриклеточного домена (ICD), распознаваемого различными диагностически значимыми антителами. Серийные разведения пептида HER2 ICD в растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA) смешивают с формальдегидом и нагревают в течение 10 мин при 85 °C для затвердевания и сшивки смеси пептид/BSA. Полученный гель может быть обработан, разделен и окрашен как ткань, что дает серию образцов известных концентраций антигенов, охватывающих широкий диапазон интенсивности окрашивания.

Этот простой протокол согласуется с обычными лабораторными процедурами гистологии. Метод требует только, чтобы у пользователя было достаточное количество желаемого антигена. Рекомбинантные белки, белковые домены или линейные пептиды, кодирующие соответствующие эпитопы, могут синтезироваться локально или коммерчески. Лаборатории, генерирующие собственные антитела, могут резервировать аликвоты иммунизирующего антигена в качестве синтетической контрольной мишени. Возможность создания четко определенных положительных элементов управления в широком диапазоне концентраций позволяет пользователям оценивать эффективность внутри- и межлабораторного анализа, получать представление о динамическом диапазоне и линейности своих анализов и оптимизировать условия анализа для своих конкретных экспериментальных целей.

Введение

Иммуногистохимия (IHC) позволяет чувствительно и специфично, пространственно точно обнаруживать антигены-мишени в формалин-фиксированных, парафиновых (FFPE) участках тканей. Однако на результаты окрашивания IHC могут влиять несколько переменных, включая время теплой и холодной ишемии, фиксацию тканей, предварительную обработку тканей, реактивность и концентрацию антител, химию обнаружения анализа и время реакции1. Соответственно, воспроизводимые характеристики и интерпретация реакций МГК требуют строгого контроля этих переменных и использования хорошо охарактеризованных положительных и отрицательных контрольных образцов. Часто используемые контрольные элементы включают парафиновые внедренные ткани или культивируемые клеточные линии, известные из независимых анализов для экспрессии интересующего антигена, но такие образцы не всегда доступны1. Кроме того, уровни экспрессии целевых антигенов в тканях и контроле клеточных линий, как правило, понимаются только качественно и могут быть переменными. Контроль, содержащий воспроизводимые, точно известные концентрации целевого антигена, может помочь в оптимизации условий реакции IHC. Общий способ, адаптируемый к различным типам антигенов в физиологически значимом диапазоне концентраций для создания синтетических контрольных образцов IHC, был описан авторами2. Здесь представлен подробный протокол для создания и использования этого типа стандарта.

Соответствующие средства контроля необходимы для достоверной интерпретации анализов IHC 1,3,4. Ткани, культивируемые клетки и субстраты с пептидным покрытием использовались в качестве контроля IHC в соответствии с конкретными потребностями исследователей. Преимущества и ограничения, присущие использованию тканей в качестве средств контроля IHC, широко обсуждались 1,4. Для многих антител соответствующие элементы управления могут быть выбраны из выбранных нормальных тканей, содержащих клеточные популяции, экспрессирующие целевой антиген в широком динамическом диапазоне. Тканевые элементы контроля менее подходят, когда антиген-мишень недостаточно хорошо охарактеризован в отношении места экспрессии или изобилия, или когда потенциально перекрестно реагирующие антигены совместно экспрессируются в одних и тех же клетках или участках тканей. В этих контекстах блоки культивируемых клеточных линий, экспрессирующих интересующий антиген, могут быть полезны. Для предоставления дополнительных доказательств специфичности мишени клеточные линии могут быть спроектированы для чрезмерной или недостаточной экспрессии целевых антигенов. Например, такой подход недавно был использован для оценки различных анализов против PD-L1 с использованием тканевого микрочипа из изогенных клеточных линий, экспрессирующих диапазон антигена PD-L15. Практические ограничения на рутинное использование блоков клеточных линий включают стоимость и время, необходимые для получения достаточного количества клеток, а также тот факт, что экспрессия некоторых антигенов может быть ненадежно последовательной даже в пределах клональных клеточных линий6. Синтетические пептиды являются третьим вариантом контроля IHC для антител, которые распознают короткие линейные эпитопы. Стивен Боген и его коллеги опубликовали обширные публикации об использовании пептидов, соединенных с поверхностью стеклянных слайдов 7,8 и стеклянных бусин9. Одно исследование, проведенное этой группой, показало, что количественный анализ контроля IHC на основе пептидов может обнаружить вариации процесса окрашивания, пропущенные качественной оценкой контроля тканей, проанализированных параллельно10. В то время как стандарты, использующие антигены на основе бисера, могут быть широко применимы, многие детали являются собственностью авторов, ограничивая широкое распространение.

Другой подход к стандартам IHC включает целевые антигены в искусственно созданные белковые гели. Эта концепция была впервые продемонстрирована Пером Брандцаегом в 1972 году в исследовании, в котором нормальная сыворотка кролика была полимеризована с использованием глутаральдегида11. Небольшие блоки полученного геля затем замачивали в течение 1-4 недель в растворах, содержащих интересующие иммуноглобулиновые антигены в различных концентрациях. После фиксации спирта и встраивания парафина было показано, что участки полученного контроля окрашиваются с интенсивностью, соответствующей логарифму растворов антигенов, в которых они были пропитаны. Позже исследователи подготовили глутаральдегидные конъюгаты специфических аминокислот в разбавленных растворах BSA или гомогенатов мозга в качестве положительных контрольных элементов в исследованиях иммуноэлектронной микроскопии12,13. Более поздняя работа исследовала использование гелей, изготовленных из формальдегид-фиксированных белковых растворов, в качестве суррогатов для ткани FFPE в масс-спектрометрическом анализе14. Другая недавняя работа исследовала структуру и свойства гелей, образующихся при нагревании растворов сывороточного альбумина человека или крупного рогатого скота при различных концентрациях и рН15. Эти авторы обнаружили, что сывороточный альбумин образует три типа гелей, отличающихся механической эластичностью, сохранением вторичной структуры и способностью связывать жирные кислоты в зависимости от условий эксперимента. Вместе эти документы демонстрируют общую осуществимость применяемого здесь подхода. Белковые растворы определенного состава создают тканеподобные гели, которые могут быть дополнительно обработаны, разделены и окрашены с использованием обычных гистологических методов.

Этот протокол описывает образование синтетического контроля IHC, изготовленного из бычьего сывороточного альбумина (BSA), полимеризованного теплом и формальдегидом. Гели могут включать широкий спектр антигенов, включая полноразмерные белки, белковые домены и линейные пептиды, а также небелковые антигены, включая олигонуклеотиды2. В этой демонстрации используется пример антигена линейного пептида, кодирующего С-концевые 16 аминокислот человеческого белка ERBB2 (HER2/neu) TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (см. Таблицу материалов). Эта последовательность включает эпитопы, признанные тремя коммерчески доступными диагностически значимыми антителами, включая поликлональный реагент Herceptest (ENPEYLGLDVP) и моноклональные антитела CB11 (AENPEYL) и 4B5 (TAENPEYLGL) (см. Таблицу материалов)16.

Метод, продемонстрированный здесь, использует легкодоступные реагенты с использованием процессов и методов, знакомых любой практикующей гистологической лаборатории. Наиболее существенным ограничением является необходимость выявления и приобретения целевых антигенов, что во многих случаях может быть достигнуто при относительно скромных затратах. Поскольку эти синтетические элементы управления имеют полностью определенный состав и изготовлены простыми методами, они могут быть реализованы во многих лабораториях с воспроизводимыми результатами. Их использование может способствовать объективной, поддающейся количественной оценке результатов окрашивания IHC и обеспечивать большую внутри- и межлабораторную воспроизводимость.

протокол

1. Подготовка складского раствора и инструментов

  1. Готовят 20 мл 25% мас./об.раствора BSA путем смешивания 5 г порошка BSA в 14 мл PBS, рН 7,2 в конической пробирке объемом 50 мл до равномерного диспергирования. Вихрь по мере необходимости диспергирует порошок BSA.
    1. Держите раствор в течение ночи при температуре 4 °C, чтобы обеспечить полное растворение. Отрегулируйте конечный объем до 20 мл с помощью PBS, чтобы получить 25% мас./v запасной раствор.
  2. Готовят 20 мл 31,3% мас./об.раствора BSA путем смешивания 6,26 г порошка BSA в 13 мл PBS, рН 7,2 в конической пробирке объемом 50 мл до равномерного диспергирования. Держите раствор в течение ночи при температуре 4 °C, чтобы обеспечить полное растворение. Отрегулируйте конечный объем до 20 мл с помощью PBS, чтобы получить 31,3% мас./v запасной раствор.
  3. Разогрейте тепловой блок до 85 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный ниже протокол создает пептидные/BSA гели объемом 1,26-1,4 мл, сформированные в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл. Чтобы использовать меньшие объемы, например, когда запасы антигена ограничены, приготовьте гели в пробирках ПЦР и используйте термоциклер, установленный на 85 ° C в качестве теплового блока.
  4. Проверьте, что смесь BSA/формальдегид образует гель, как и ожидалось, путем смешивания 700 мкл 25% раствора BSA с 700 мкл 37% формальдегида. Хорошо перемешать, пипеткой вверх и вниз 5 раз в течение 5-10 с. Избегайте создания пузырьков воздуха.
    ВНИМАНИЕ: Концентрированный формальдегид токсичен; использовать с соответствующими мерами предосторожности.
  5. Сразу после смешивания растворов BSA и формальдегида поместите закрытую микроцентрифужную трубку в тепловой блок при 85 °C в течение 10 мин. Снимите трубку с теплового блока и дайте ей остыть. Подтвердите, что гель сформировался должным образом.

2. Получение и разведение пептидов

  1. Получают 5-20 мг лиофилизированного пептида нужной последовательности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С-концевые 16 аминокислот внутриклеточного домена человека ERBB2, распознаваемого 4B5, являются TPTAENPEYLGLDVPV-COOH.
    1. Добавьте 4 аминокислоты к N-концу, ацетил-YGSG и C-концу, GSGC-амид, чтобы облегчить сшивание пептида с BSA и обеспечить расстояние между молекулой BSA и пептидным эпитопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полная последовательность: ацетил-YGSGTPTAENPEYLGLDVPVGSGC-амид.
    2. При желании используют другие N- и C-концевые аминокислотные последовательности для расширения эпитопа основного пептида.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Воздействие различных последовательностей варьируется при различных комбинациях антител/эпитопов. Добавление С-концевого пептида снижает связывание некоторых антител с С-концевыми эпитопами. В таких случаях опускайте эту последовательность.
    3. Подтвердить, что пептиды из коммерческих источников поставляются в чистоте >95%, состав которой подтверждается ВЭЖХ и масс-спектрометрическим анализом.
  2. Рассчитайте необходимые объемы для 5x (1,25 E-2 M) пептидного запаса растворов. Ссылаясь на таблицу 1, столбцы C-E, введите значения молекулярной массы антигена (г/моль), процента чистоты антигена (0-100) и массы антигена (мг).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем растворителя (в мкл) для повторного суспендирования образца для получения запасного раствора 1,25 Е-2 М составляет 800 х молекулярной массы антигена х процентов чистоты антигена/массы антигена.
    1. Подготовьте и четко маркируйте восемь микроцентрифужных трубок по 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пробирки будут содержать 5x пептидного материала в растворителе, 1x пептидного материала в растворителе, пять 10-кратных последовательных разведений от 2,5 E-4 M до 2,5 пептида E-8 M/формальдегидного геля и отрицательный контрольный гель, содержащий BSA/формальдегид без добавления антигена. Все образцы геля выглядят одинаково. При одновременном приготовлении нескольких наборов пептидных разведений позаботьтесь о том, чтобы правильно маркировать и идентифицировать все трубки и обрабатывать кассеты. По возможности используйте микроцентрифужные трубки с цветовой кодировкой и кассеты для обработки, чтобы свести к минимуму ошибочную идентификацию.
  3. Готовят 5-кратный пептидный раствор при 1,25 E-2 M путем повторного использования всей массы лиофилизированного пептида (20 мг для пептидов ERBB2) в 60 мкл соответствующего растворителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере диметилформамид (DMF) был добавлен непосредственно в контейнер поставщика.
    1. Осмотрите раствор, чтобы убедиться, что пептид полностью растворен. При необходимости добавляют дополнительный растворитель и/или обрабатывают образец ультразвуком до полного растворения пептида, следя за тем, чтобы объем, рассчитанный в таблице 1 для 5-кратного пептидного запаса.
      ВНИМАНИЕ: ДМФ токсичен; использовать с соответствующими мерами предосторожности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от аминокислотной последовательности и соответствующей гидрофобности и заряда пептиды могут быть растворимы в DMF, диметилсульфоксиде (DMSO), чистой воде или разбавленных растворах уксусной кислоты, муравьиной кислоты или бикарбоната аммония. Пептидные характеристики могут быть рассчитаны с использованием различных онлайн-инструментов17. Некоторые поставщики пептидов могут предлагать растворители, подходящие для определенных последовательностей.
    2. Добавляют растворитель по мере необходимости, чтобы довести объем 5-кратного запаса пептидов до конечного объема, рассчитанного в таблице 1. Вихрь на 5 с и центрифуга при комнатной температуре при 5000 х г в течение 5 с. Пептидные растворы можно хранить при -80 °C.
  4. Ссылаясь на таблицу 2, колонка С, получают 150 мкл 1x пептидного раствора (2,5 E-3 M) путем разбавления 30 мкл 5x пептидного запаса в 120 мкл растворителя (DMF в этом примере). Вихрь на 5 с и центрифуга при комнатной температуре при 5000 х г в течение 5 с.
  5. Ссылаясь на таблицу 2, колонка D, получают 700 мкл 5 раствора пептида E-4 M/BSA (разбавление 1) путем разбавления 140 мкл 1x пептидного материала в 560 мкл 31,3% BSA/PBS, рН 7,2. Вихрь на 5 с и центрифуга при комнатной температуре при 5000 х г в течение 5 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация BSA этого раствора составляет 25% (мас./об.).
  6. Ссылаясь на таблицу 2, колонки E-H, готовят четыре последовательных 10-кратных последовательных разведения 5 пептидов E-4 M/BSA путем добавления 70 мкл раствора пептида/BSA к 630 мкл 25% BSA/PBS, рН 7,2. Вихрь на 5 с и центрифуга при комнатной температуре при 5000 х г в течение 5 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После этого этапа будет пять 10-кратных последовательных разведений пептида (от 5 E-4 M до 5 E-8 M) в 25% BSA/PBS, pH 7,2. Первые четыре образца будут содержать 630 мкл. Последний образец будет содержать 700 мкл.
  7. Ссылаясь на таблицу 2, колонка I, подготовьте отрицательный контрольный образец BSA, содержащий 700 мкл 25% BSA/PBS, рН 7,2 (рисунок 1A).

3. Приготовление BSA-пептидных гелей

  1. Убедитесь, что тепловой блок или термоциклер стабилен при температуре 85 °C.
  2. См. таблицу 3, столбцы B-E. Работая по одному образцу за раз, добавляют к первому 25% образцу BSA/пептида (разбавление 1) 630 мкл 37% формальдегида. Хорошо перемешать, пипеткой вверх и вниз 5 раз в течение 5-10 с. Избегайте создания пузырьков воздуха.
    ВНИМАНИЕ: Концентрированный формальдегид токсичен; использовать с соответствующими мерами предосторожности.
    1. После смешивания растворов пептида/BSA и формальдегида поместите закрытую микроцентрифужную трубку в тепловой блок при 85 °C в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно перемешайте раствор BSA-пептида и формальдегид, но не тратьте более 10 с на пипетирование смеси перед помещением образца на тепло. Поскольку сшивание формальдегида начинается немедленно, гель может образовываться по-разному, если процедура варьируется для разных образцов. Конечная концентрация BSA в этих гелях составляет 12,5% (мас./об.). Конечные концентрации BSA менее 10% могут давать гели, которые не затвердевают; конечные концентрации BSA, превышающие 16%, могут привести к образованию гелей, более хрупких и трудно поддающихся разделению после обработки.
    2. Повторите шаги 3.2 и 3.2.1 для каждого из разведений 2-4.
    3. Повторите шаги 3.2 и 3.2.1 для разбавления 5, но добавьте 700 мкл 37% формальдегида, объем, равный 700 мкл раствора BSA-антигена.
    4. См. таблицу 3 колонки G; повторите шаги 3.2 и 3.2.1 для отрицательного контрольного образца, добавив 700 мкл 37% формальдегида, объем, равный 700 мкл отрицательного контрольного раствора BSA.
  3. Снимите трубки с теплового блока через 10-12 мин. Время нагрева должно быть как можно более последовательным для каждого образца. Дайте гелям остыть на столешнице в течение 5-10 мин (рисунок 1B).
  4. Используя чистый, гибкий одноразовый лабораторный шпатель, извлеките образец геля в одном куске из микроцентрифужной трубки и поместите его в герметичный контейнер, содержащий, по меньшей мере, 15 мл нейтрального буферизованного формалина (NBF), используя отдельный контейнер NBF для каждого образца.
    1. В качестве альтернативы можно отрезать дно трубки микроцентрифуги новым лезвием бритвы с одним кромкой и вытолкнуть гель со дна воздухом или подходящим зондом (рисунок 1C-G).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Затвердевшие формальдегидные/BSA гели могут оставаться в микроцентрифужных трубках при комнатной температуре до 24 ч. Оставление гелей в микроцентрифужной трубке более чем на 24 ч может привести к тому, что они станут хрупкими и более трудными для обработки и секционирования.

4. Обрезка, обработка и встраивание гелей BSA

  1. Обрежьте гелевой конус цилиндрическими дисками толщиной около 5 мм с помощью чистой бритвы с одним краем (рисунок 1H,I). Оберните диски в обертывание для биопсии, поместив один большой гель-диск в одну кассету (для использования в пилотном исследовании на этапе 5), а остальные гелевые диски вместе во вторую кассету (рисунок 2A, E) для использования в конструкции тканевого микрочипа (TMA) на этапе 6. Поместите обернутые гелевые диски в четко обозначенные кассеты для обработки тканей.
    1. Поместите кассетные гели по меньшей мере в 15 мл 10% NBF на образец геля перед обработкой, используя отдельный контейнер NBF для каждого образца. Гели могут оставаться в 10% НБФ в течение 6-48 ч.
  2. Обработайте гели в автоматизированном гистологическом тканевом процессоре, следуя большому тканевому графику с давлением и вакуумом. Каждый шаг занимает 1 ч: 10% NBF, 70% этанола, 95% этанола (повторите два раза), 100% этанола (повторите два раза), ксилолы (повторите три раза), парафин при 60 °C (повторите три раза).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для исследователей, решивших обрабатывать образцы вручную, следуйте той же последовательности реагентов и времени.
  3. Когда обработка образца будет завершена, извлеките кассеты из тканевого процессора и переместите их в центр встраивания парафина.
  4. Распакуйте гели из обертывания для биопсии и вложите гели в парафин. Для каждого образца вставьте один диск геля в небольшую форму размером 15 мм х 15 мм (рисунок 2B-D), а остальные гелевые диски вместе во вторую более крупную форму (рисунок 2F-H). Первый блок с одним образцом будет использоваться для тестирования пептидного геля в пилотном исследовании. Второй блок может быть использован для строительства TMA.

5. Пилотная оценка серии разбавления пептидов

  1. Для каждой серии разбавления пептидов планируется создать два стеклянных слайда, содержащих в общей сложности 6 отдельных секций: по одной секции из каждого из пяти образцов серии разбавления плюс один участок из отрицательного контрольного образца, предназначенного только для BSA.
    1. На первом стеклянном слайде вырежьте один участок толщиной 4 мкм от каждого из меньших блоков, содержащих один гель-диск с тремя самыми высокими концентрациями пептидов (от 2,5 E-4 M до 2,5 E-6 M).
    2. На втором слайде вырежьте один участок толщиной 4 мкм из каждого блока с двумя самыми низкими концентрациями пептидов (2,5 E-7 M и 2,5 E-8 M) и один участок из блока управления, предназначенного только для BSA. Запишите порядок образцов на слайдах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидайте, что гели, встроенные в парафин, будут резаться плавно, создавая однородные участки без фрагментации, разрыва или болтовни артефакта. Если определенные образцы геля, содержащие парафин, трудно разделить, кратковременно замочите поверхность блока в ледяной дистиллированной воде перед секционированием. При необходимости экспериментируйте с различным временем замачивания или с различными растворами (например, аммиачной водой).
    3. После секционирования высушите горки при комнатной температуре (около 23 °C) в течение 24 ч, а затем 60 °C в течение 30 мин.
  2. Окрасьте два слайда, подготовленные для каждого пептида, желаемым антителом в соответствии со стандартными протоколами IHC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первичная концентрация антител на слайде, используемая для моноклонального 4B5 кролика в этой демонстрации, составляла 1,5 мкг/мл.
    1. Ожидайте увидеть относительно однородный сигнал в каждой секции геля, при этом различные образцы геля показывают диапазон интенсивности сигнала, соответствующий пептидным разбавлениям.
  3. Если результаты пилотного исследования удовлетворительны, постройте ТМА из блоков донора геля, содержащих различные концентрации пептидного антигена, как описано в следующих шагах протокола.

6. BSA гель ТМА конструкция

  1. Построить тканевый микрочип, содержащий дубликаты сердечников диаметром 1 мм из донорских блоков, содержащих только гель BSA и гели BSA, содержащие все пять разведений пептида ERBB2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При желании включите гели BSA, содержащие те же пять разведений нецелевого пептида, что и дополнительные отрицательные контрольные элементы. При желании включите ядра репрезентативных ERBB2-экспрессирующих клеточных линий в качестве положительных контрольных элементов.
  2. Вырежьте участки TMA толщиной 4 мкм и окрасьте 1,5 мкг/мл анти-ERBB2/HER2/neu кролика моноклонального 4B5 (см. Таблицу материалов) в соответствии со стандартными лабораторными протоколами.
  3. Оцените результирующую интенсивность пятна качественно путем контроля или количественно с помощью сканирования и анализа цифровых изображений (рисунок 3A,B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку анализ цифровых изображений не находится в центре внимания этого протокола, эти шаги оставлены на усмотрение читателя в соответствии с его предпочтениями.

Результаты

Пептиды должны полностью растворяться в соответствующем растворителе при комнатной температуре с образованием оптически прозрачного раствора. Если видимый твердый материал все еще присутствует через 30-60 мин, может быть полезно добавить дополнительные объемы исходного растворителя ...

Обсуждение

Этот метод позволяет пользователю создавать однородные образцы известного состава и концентрации антигена в качестве стандартов в реакциях IHC, используя материалы и методы, знакомые большинству гистологических лабораторий. Наиболее важным шагом является идентификация эпитопа, с кот...

Раскрытие информации

Чарльз А. Хавнар, Кэти Хётцель, Чарльз А. Джонс, Кармина М. Эспириту, Линда К. Рэнджелл и Франклин В. Пил являются сотрудниками и акционерами Genentech и Roche. Их филиалы производят реагенты и инструменты, используемые в этом исследовании.

Благодарности

Авторы с благодарностью отмечают своих коллег Джеффри Тома и Аймин Сонг за синтез пептидов, Нянфэн Гэ за построение TMA, Шари Лау за окрашивание IHC, Мелиссу Эдик за цифровое микроскопическое сканирование и Хай Нгу за количественную оценку цифрового изображения.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-HER2/neu clone 4B5Ventana5278368001
Biopsy WrapsLeica3801090
Bovine Serum Albumin, ultra pureCell Signaling TechnologyBSA #9998
50 mL Conical TubeCorning352070
Disposable base mold (15 mm x 15 mm)Fisher22-363-553
Disposable base mold
(24 mm x 24 mm)		Fisher22-363-554
Disposable spatulaVWR80081-188
Eppendorf ThermomixerEppendorf22331
37% FormaldehydeElectron Microscopy Sciences15686
ERBB2 / HER2 peptideUniProt P04626-1; a.a. 1240-55
Leica Autostainer XLLeicaST5010
Magnetic Stir Bar
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imagerHamamatsu
10% Neutral Buffered FormalinVWR16004-128
Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL
Paraplast paraffinLeica39601006
Peptide parameter calculatorPep-Calc17https://www.pep-calc.com/
Peptide suppliersABclonal ScienceUsers should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
Anaspec PeptideUsers should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
CPC ScientificUsers should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
New England PeptideUsers should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
Phosphate Buffered Saline pH 7.2
Reagent AlcoholThermo Scientific9111
Single Edge RazorVWR55411-050
Superfrost Plus positively charged microscope slidesThermo Scientific6776214
TMA Tissue Grand Master3DHISTECH
XylenesVWR89370-088

Ссылки

  1. Torlakovic, E. E., et al. Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).
  2. Hötzel, K. J., et al. Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).
  3. Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
  4. Torlakovic, E. E., et al. Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).
  5. Martinez-Morilla, S., et al. Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray. Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).
  6. Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
  7. Sompuram, S. R., et al. Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets. Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).
  8. Sompuram, S. R., et al. A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).
  9. Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).
  10. Vani, K., et al. Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).
  11. Brandtzaeg, P. Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity. Immunology. 22, 177-183 (1972).
  12. Matute, C., Streit, P. Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity. Histochemistry. 86, 147-157 (1986).
  13. Ottersen, O. P. Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing. Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).
  14. Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. 'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).
  15. Arabi, S. H., et al. Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties. Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).
  16. Schrohl, A. -. S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Brünner, N. Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies. Histopathology. 59, 975-983 (2011).
  17. Lear, S., Cobb, S. L. Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).
  18. Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays. Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).
  19. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  20. Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
  21. Forsström, B., et al. Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).
  22. Forsström, B., et al. Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes. PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).
  23. Prasad, B., et al. Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

174ERBB2HER2neu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены