Synthetische Antigenkontrollen für die Immunhistochemie

Zusammenfassung

Diese Arbeit dokumentiert eine einfache Methode zur Erstellung synthetischer Antigenkontrollen für die Immunhistochemie. Die Technik ist an eine Vielzahl von Antigenen in einem breiten Konzentrationsbereich anpassbar. Die Proben bieten eine Referenz zur Beurteilung der Intra- und Inter-Assay-Leistung und Reproduzierbarkeit.

Zusammenfassung

Immunhistochemische (IHC) Assays liefern wertvolle Einblicke in Proteinexpressionsmuster, deren zuverlässige Interpretation gut charakterisierte positive und negative Kontrollproben erfordert. Da nicht immer geeignete Gewebe- oder Zelllinienkontrollen verfügbar sind, kann eine einfache Methode zur Erstellung synthetischer IHC-Kontrollen von Vorteil sein. Eine solche Methode wird hier beschrieben. Es ist anpassungsfähig an verschiedene Antigentypen, einschließlich Proteine, Peptide oder Oligonukleotide, in einem breiten Konzentrationsbereich. Dieses Protokoll erklärt die Schritte, die notwendig sind, um synthetische Antigenkontrollen zu erstellen, wobei als Beispiel ein Peptid aus der intrazellulären Domäne (ICD) des humanen erythroblastischen Onkogens B2 (ERBB2 / HER2) verwendet wird, das von einer Vielzahl von diagnostisch relevanten Antikörpern erkannt wird. Serielle Verdünnungen des HER2 ICD-Peptids in Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung werden mit Formaldehyd gemischt und 10 min bei 85 °C erhitzt, um das Peptid/BSA-Gemisch zu verfestigen und zu vernetzen. Das resultierende Gel kann wie ein Gewebe verarbeitet, geschnitten und gefärbt werden, was zu einer Reihe von Proben bekannter Antigenkonzentrationen führt, die einen weiten Bereich von Färbeintensitäten abdecken.

Dieses einfache Protokoll steht im Einklang mit routinemäßigen histologischen Laborverfahren. Die Methode erfordert lediglich, dass der Benutzer über eine ausreichende Menge des gewünschten Antigens verfügt. Rekombinante Proteine, Proteindomänen oder lineare Peptide, die für relevante Epitope kodieren, können lokal oder kommerziell synthetisiert werden. Labore, die hauseigene Antikörper erzeugen, können Aliquots des immunisierenden Antigens als synthetisches Kontrollziel reservieren. Die Möglichkeit, gut definierte Positivkontrollen für einen breiten Konzentrationsbereich zu erstellen, ermöglicht es Benutzern, die Leistung von Intra- und Inter-Laboratory-Assays zu bewerten, Einblicke in den Dynamikbereich und die Linearität ihrer Assays zu erhalten und die Assay-Bedingungen für ihre jeweiligen experimentellen Ziele zu optimieren.

Einleitung

Die Immunhistochemie (IHC) ermöglicht den sensitiven und spezifischen, räumlich präzisen Nachweis von Zielantigenen in formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeschnitten. Die Ergebnisse der IHC-Färbung können jedoch durch mehrere Variablen beeinflusst werden, einschließlich der warmen und kalten Ischämiezeit, der Gewebefixierung, der Gewebevorbehandlung, der Antikörperreaktivität und -konzentration, der Assay-Erkennungschemie und der Reaktionszeiten¹. Dementsprechend erfordern die reproduzierbare Leistung und Interpretation von IHC-Reaktionen eine strenge Kontrolle dieser Variablen und die Verwendung gut charakterisierter positiver und negativer Kontrollproben. Zu den häufig verwendeten Kontrollen gehören in Paraffin eingebettete Gewebe oder kultivierte Zelllinien, von denen aus unabhängigen Analysen bekannt ist, dass sie das Antigen von Interesse ausdrücken, aber solche Proben sind nicht immer verfügbar¹. Darüber hinaus werden die Expressionsniveaus der Zielantigene in Geweben und Zelllinienkontrollen im Allgemeinen nur qualitativ verstanden und können variabel sein. Kontrollen, die reproduzierbare, genau bekannte Konzentrationen von Zielantigen enthalten, können bei der Optimierung der IHC-Reaktionsbedingungen helfen. Eine allgemeine Methode, die an eine Vielzahl von Antigentypen in einem physiologisch relevanten Konzentrationsbereich angepasst werden kann, um synthetische IHC-Kontrollproben zu erzeugen, wurde von den Autoren^{beschrieben 2}. Für die Erstellung und Verwendung dieser Art von Standard wird hier ein detailliertes Protokoll bereitgestellt.

Geeignete Kontrollen sind für die gültige Interpretation der ^{IHC-Assays 1,3,4} unerlässlich. Gewebe, kultivierte Zellen und peptidbeschichtete Substrate wurden als IHC-Kontrollen entsprechend den spezifischen Bedürfnissen der Forscher eingesetzt. Die Vorteile und Einschränkungen, die der Verwendung von Geweben als IHC-Kontrollen innewohnen, wurden ausführlich diskutiert ^1,4. Für viele Antikörper können geeignete Kontrollen aus ausgewählten normalen Geweben ausgewählt werden, die Zellpopulationen enthalten, die das Zielantigen über einen weiten Dynamikbereich exprimieren. Gewebekontrollen sind weniger geeignet, wenn das Zielantigen hinsichtlich der Expressionsstelle oder -häufigkeit nicht gut charakterisiert ist oder wenn potenziell kreuzreagierende Antigene in denselben Zellen oder Gewebestellen koexprimiert werden. In diesen Kontexten können Blöcke von kultivierten Zelllinien, die das Antigen von Interesse ausdrücken, hilfreich sein. Um weitere Beweise für die Zielspezifität zu liefern, können Zelllinien so konstruiert werden, dass sie Zielantigene über- oder unterexprimieren. Zum Beispiel wurde ein solcher Ansatz kürzlich verwendet, um eine Vielzahl von Anti-PD-L1-Assays unter Verwendung eines Gewebe-Microarrays von isogenen Zelllinien zu bewerten, die eine Reihe von PD-L1-Antigen⁵ exprimieren. Zu den praktischen Einschränkungen bei der routinemäßigen Verwendung von Zelllinienblöcken gehören die Kosten und der Zeitaufwand für die Erzeugung ausreichender Zellzahlen und die Tatsache, dass die Expression einiger Antigene möglicherweise nicht zuverlässig konsistent ist, selbst innerhalb klonaler Zelllinien⁶. Synthetische Peptide sind eine dritte Option für IHC-Kontrollen für Antikörper, die kurze lineare Epitope erkennen. Steven Bogen und Kollegen haben ausführlich über die Verwendung von Peptiden publiziert, die an die Oberfläche von ^{Objektträgern 7,8} und Glasperlen⁹ gekoppelt sind. Eine Studie dieser Gruppe zeigte, dass die quantitative Analyse von peptidbasierten IHC-Kontrollen die Variation des Färbeprozesses erkennen konnte, die bei der qualitativen Bewertung der parallel analysierten Gewebekontrollen übersehen^{wurde 10}. Während Standards, die perlenbasierte Antigene verwenden, weit verbreitet sein könnten, sind viele Details Eigentum der Autoren, was die weit verbreitete Akzeptanz einschränkt.

Ein weiterer Ansatz für IHC-Standards integriert Zielantigene in künstlich hergestellte Proteingele. Dieses Konzept wurde erstmals¹⁹⁷² von Per Brandtzaeg in einer Studie demonstriert, in der normales Kaninchenserum mit Glutaraldehyd 11 polymerisiert wurde. Kleine Blöcke des resultierenden Gels wurden dann für 1-4 Wochen in Lösungen eingeweicht, die die Immunglobulin-Antigene von Interesse in verschiedenen Konzentrationen enthielten. Nach Alkoholfixierung und Paraffineinbettung wurde gezeigt, dass Abschnitte der resultierenden Kontrollen mit Intensitäten färbten, die dem Logarithmus der Antigenlösungen entsprachen, in denen sie eingeweicht worden waren. Später stellten die Forscher Glutaraldehyd-Konjugate spezifischer Aminosäuren in verdünnten BSA- oder Gehirnhomogenatlösungen als Positivkontrollen in Immunelektronenmikroskopie-Studien^{vor 12,13}. Neuere Arbeiten untersuchten die Verwendung von Gelen aus formaldehydfixierten Proteinlösungen als Surrogate für FFPE-Gewebe in der Massenspektrometrie-Analyse¹⁴. Eine weitere neuere Arbeit untersuchte die Struktur und Eigenschaften von Gelen, die durch Erhitzen von menschlichen oder bovinen Serumalbuminlösungen bei verschiedenen Konzentrationen und^pH-15 gebildet wurden. Diese Autoren fanden heraus, dass Serumalbumin drei Arten von Gelen bildet, die sich in Abhängigkeit von den experimentellen Bedingungen in mechanischer Elastizität, Sekundärstrukturerhaltung und Fettsäurebindungsfähigkeit unterscheiden. Zusammen demonstrieren diese Papiere die allgemeine Machbarkeit des hier verwendeten Ansatzes. Proteinlösungen definierter Zusammensetzung erzeugen gewebeähnliche Gele, die mit histologischen Routinemethoden weiterverarbeitet, geschnitten und gefärbt werden können.

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung einer synthetischen IHC-Kontrolle aus Rinderserumalbumin (BSA), das mit Hitze und Formaldehyd polymerisiert ist. Die Gele können eine Vielzahl von Antigenen enthalten, darunter Proteine in voller Länge, Proteindomänen und lineare Peptide sowie Nicht-Protein-Antigene einschließlich Oligonukleotide². Diese Demonstration verwendet ein Beispielantigen, ein lineares Peptid, das für die C-terminalen 16 Aminosäuren des humanen ERBB2 (HER2/neu) Proteins TPTAENPEYLGLDVPV-COOH kodiert (siehe Materialtabelle). Diese Sequenz umfasst die Epitope, die von drei kommerziell erhältlichen, diagnostisch relevanten Antikörpern erkannt wurden, darunter das polyklonale Reagenz Herceptest (ENPEYLGLDVP) und die monoklonalen Antikörper CB11 (AENPEYL) und 4B5 (TAENPEYLGL) (siehe Materialtabelle⁾¹⁶.

Die hier demonstrierte Methode verwendet leicht verfügbare Reagenzien unter Verwendung von Prozessen und Techniken, die jedem praktizierenden Histologielabor vertraut sind. Die wichtigste Einschränkung ist die Notwendigkeit, die Zielantigene zu identifizieren und zu kaufen, was in vielen Fällen zu relativ geringen Kosten erreicht werden kann. Da diese synthetischen Kontrollen von vollständig definierter Zusammensetzung sind und mit einfachen Methoden hergestellt werden, können sie in vielen Labors mit reproduzierbaren Ergebnissen implementiert werden. Ihre Verwendung kann die objektive, quantifizierbare Bewertung der Ergebnisse der IHC-Färbung erleichtern und eine größere Reproduzierbarkeit innerhalb und zwischen den Labors ermöglichen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Lagerlösung und der Werkzeuge

1. Bereiten Sie 20 ml einer 25% w/v BSA-Lösung vor, indem Sie 5 g BSA-Pulver in 14 ml PBS, pH 7,2 in einem 50 ml konischen Röhrchen mischen, bis es gleichmäßig dispergiert ist. Vortex nach Bedarf, um das BSA-Pulver zu dispergieren.
   1. Halten Sie die Lösung über Nacht bei 4 °C, um eine vollständige Auflösung zu ermöglichen. Stellen Sie das Endvolumen mit PBS auf 20 ml ein, um eine 25% w/v Lagerlösung zu erhalten.
2. Bereiten Sie 20 ml einer 31,3% w/v BSA-Lösung vor, indem Sie 6,26 g BSA-Pulver in 13 ml PBS, pH 7,2 in einem 50 ml konischen Röhrchen mischen, bis es gleichmäßig dispergiert ist. Halten Sie die Lösung über Nacht bei 4 °C, um eine vollständige Auflösung zu ermöglichen. Stellen Sie das Endvolumen mit PBS auf 20 ml ein, um eine 31,3% w/v Lagerlösung zu erhalten.
3. Einen Heizblock auf 85 °C vorheizen.
   HINWEIS: Das folgende Protokoll erzeugt Peptid / BSA-Gele mit Volumina von 1,26-1,4 ml, die in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gebildet werden. Um kleinere Volumina zu verwenden, z. B. wenn die Antigenbestände begrenzen, bereiten Sie die Gele in PCR-Röhrchen vor und verwenden Sie einen auf 85 °C eingestellten Thermocycler als Wärmeblock.
4. Testen Sie, ob das BSA/Formaldehyd-Gemisch wie erwartet ein Gel bildet, indem Sie 700 μL 25%ige BSA-Lösung mit 700 μL 37%igem Formaldehyd mischen. Gut mischen, indem Sie 5 Mal innerhalb von 5-10 s auf und ab pipettieren. Vermeiden Sie es, Luftblasen zu erzeugen.
   ACHTUNG: Konzentriertes Formaldehyd ist giftig; Verwendung mit geeigneten Sicherheitsvorkehrungen.
5. Unmittelbar nach dem Mischen der BSA- und Formaldehydlösungen das geschlossene Mikrozentrifugenröhrchen für 10 min in einen Wärmeblock bei 85 °C legen. Entfernen Sie das Rohr vom Wärmeblock und lassen Sie es abkühlen. Vergewissern Sie sich, dass sich das Gel wie erwartet gebildet hat.

2. Herstellung und Verdünnung von Peptiden

1. Erhalten Sie 5-20 mg lyophilisiertes Peptid der gewünschten Sequenz.
   HINWEIS: Die C-terminalen 16 Aminosäuren der humanen intrazellulären ERBB2-Domäne, die von 4B5 erkannt werden, sind TPTAENPEYLGLDVPV-COOH.
   1. Fügen Sie 4 Aminosäuren zum N-Terminus, Acetyl-YGSG und C-Terminus, GSGC-Amid, hinzu, um die Vernetzung des Peptids mit BSA zu erleichtern und den Abstand zwischen dem BSA-Molekül und dem Peptidepitop zu schaffen.
      HINWEIS: Die vollständige Sequenz ist: Acetyl-YGSGTPTAENPEYLGLDVPVGSGC-Amid.
   2. Verwenden Sie auf Wunsch andere N- und C-terminale Aminosäuresequenzen, um das Kernpeptidepitop zu erweitern.
      HINWEIS: Die Auswirkungen verschiedener Sequenzen variieren mit unterschiedlichen Antikörper/Epitop-Kombinationen. Die Zugabe des C-terminalen Peptids reduziert die Bindung einiger Antikörper an C-terminale Epitope. Lassen Sie in solchen Fällen diese Sequenz weg.
   3. Bestätigen Sie, dass Peptide aus kommerziellen Quellen mit einer Reinheit von >95% geliefert werden, deren Zusammensetzung durch HPLC- und Massenspektrometrieanalysen bestätigt wird.
2. Berechnen Sie die notwendigen Volumina für die 5x (1,25 E-2 M) Peptid-Stammlösungen. In Bezug auf Tabelle 1 geben die Spalten C-E Werte für das Antigenmolekulargewicht (g/mol), die prozentuale Antigenreinheit (0-100) und die Antigenmasse (mg) ein.
   HINWEIS: Das Volumen des Lösungsmittels (in μL) zur Resuspendierung der Probe, um eine Stammlösung von 1,25 E-2 M zu erhalten, beträgt 800 x Antigenmolekulargewicht x Prozent Antigenreinheit / Antigenmasse.
   1. Bereiten Sie acht 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor und beschriften Sie sie deutlich.
      HINWEIS: Die Röhrchen enthalten 5x Peptidstock in einem Lösungsmittel, 1x Peptidstock in einem Lösungsmittel, fünf 10x serielle Verdünnungen von 2,5 E-4 M bis 2,5 E-8 M Peptid / BSA / Formaldehyd-Gel und ein Negativkontrollgel, das BSA / Formaldehyd ohne zusätzliches Antigen enthält. Alle Gelproben sehen gleich aus. Wenn Sie mehrere Sätze von Peptidverdünnungen gleichzeitig vorbereiten, achten Sie darauf, alle Röhrchen und Verarbeitungskassetten korrekt zu markieren und zu identifizieren. Verwenden Sie nach Möglichkeit farbcodierte Mikrozentrifugenröhrchen und Verarbeitungskassetten, um Fehlidentifikationen zu minimieren.
3. Es wird eine 5-fache Peptidstammlösung bei 1,25 E-2 M hergestellt, indem die gesamte Masse des lyophilisierten Peptids (20 mg für die ERBB2-Peptide) in 60 μL des entsprechenden Lösungsmittels resuspendiert wird.
   HINWEIS: In diesem Beispiel wurde Dimethylformamid (DMF) direkt in den Container des Anbieters gegeben.
   1. Prüfen Sie die Lösung, um sicherzustellen, dass das Peptid vollständig gelöst ist. Falls erforderlich, fügen Sie zusätzliches Lösungsmittel hinzu und/oder beschallen Sie die Probe, bis das Peptid vollständig gelöst ist, wobei darauf zu achten ist, dass das in Tabelle 1 für den 5-fachen Peptidbestand berechnete Volumen nicht überschritten wird.
      ACHTUNG: DMF ist giftig; Verwenden Sie mit geeigneten Vorsichtsmaßnahmen.
      HINWEIS: Abhängig von der Aminosäuresequenz und der entsprechenden Hydrophobie und Ladung können Peptide in DMF, Dimethylsulfoxid (DMSO), reinem Wasser oder verdünnten Lösungen von Essigsäure, Ameisensäure oder Ammoniumbicarbonat löslich sein. Peptideigenschaften können mit einer Vielzahl von Online-Tools berechnet^{werden 17}. Einige Peptidverkäufer können Lösungsmittel vorschlagen, die für bestimmte Sequenzen geeignet sind.
   2. Fügen Sie bei Bedarf Lösungsmittel hinzu, um das Volumen des 5-fachen Peptidbestands auf das in Tabelle 1 berechnete Endvolumen zu bringen. Vortex für 5 s und Zentrifuge bei Raumtemperatur bei 5000 x g für 5 s. Peptid-Stammlösungen können bei -80 °C gelagert werden.
4. Unter Bezugnahme auf Tabelle 2, Spalte C, werden 150 μL 1x Peptidbestandslösung ( 2,5 E-3 M) hergestellt, indem 30 μL der 5x Peptidfrucht in 120 μL Lösungsmittel verdünnt werden (DMF dieses Beispiel). Vortex für 5 s und Zentrifuge bei Raumtemperatur bei 5000 x g für 5 s.
5. Unter Bezugnahme auf Tabelle 2, Spalte D, sind 700 μL 5 E-4 M Peptid/BSA-Lösung (Verdünnung 1) herzustellen, indem 140 μL 1x Peptidstock in 560 μL 31,3% BSA/PBS, pH 7,2 verdünnt werden. Vortex für 5 s und Zentrifuge bei Raumtemperatur bei 5000 x g für 5 s.
   HINWEIS: Die endgültige BSA-Konzentration dieser Lösung beträgt 25% (w/v).
6. Unter Bezugnahme auf Tabelle 2, Spalten E-H, sind vier aufeinanderfolgende 10-fache serielle Verdünnungen des 5 E-4 M Peptid/BSA-Stammes durch Zugabe von 70 μL Peptid/BSA-Lösung zu 630 μL 25% BSA/PBS, pH 7,2, herzustellen. Vortex für 5 s und Zentrifuge bei Raumtemperatur bei 5000 x g für 5 s.
   HINWEIS: Nach diesem Schritt wird es fünf 10-fache serielle Verdünnungen von Peptid (5 E-4 M bis 5 E-8 M) in 25% BSA / PBS, pH 7,2 geben. Die ersten vier Proben werden 630 μL enthalten. Die letzte Probe enthält 700 μL.
7. Unter Bezugnahme auf Tabelle 2, Spalte I, ist eine BSA-Negativkontrollprobe mit 700 μL von 25 % BSA/PBS, pH 7,2 (Abbildung 1A) herzustellen.

3. Herstellung von BSA-Peptid-Gelen

1. Vergewissern Sie sich, dass der Heizblock oder Thermocycler bei 85 °C stabil ist.
2. Siehe Tabelle 3, Spalten B-E. Fügen Sie der ersten 25% BSA/Peptid-Probe (Verdünnung 1) 630 μL 37% Formaldehyd hinzu. Gut mischen, indem Sie 5 Mal innerhalb von 5-10 s auf und ab pipettieren. Vermeiden Sie es, Luftblasen zu erzeugen.
   ACHTUNG: Konzentriertes Formaldehyd ist giftig; Verwendung mit geeigneten Sicherheitsvorkehrungen.
   1. Nach dem Mischen der Peptid-/BSA- und Formaldehydlösungen das geschlossene Mikrozentrifugenröhrchen für 10 min in einen Heizblock bei 85 °C legen.
      HINWEIS: Mischen Sie die BSA-Peptidlösung und Formaldehyd gründlich, aber verbringen Sie nicht mehr als 10 s damit, die Mischung zu pipettieren, bevor Sie die Probe auf Hitze legen. Da die Formaldehyd-Vernetzung sofort beginnt, kann sich das Gel unterschiedlich bilden, wenn das Verfahren für verschiedene Proben variiert wird. Die endgültige BSA-Konzentration in diesen Gelen beträgt 12,5% (w/v). Endgültige BSA-Konzentrationen von weniger als 10% können Gele ergeben, die sich nicht verfestigen; endgültige BSA-Konzentrationen von mehr als 16% können zu Gelen führen, die nach der Verarbeitung spröder und schwer zu schneiden sind.
   2. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 und 3.2.1 für jede der Verdünnungen 2-4.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 und 3.2.1 für die Verdünnung 5, fügen Sie jedoch 700 μL 37% Formaldehyd hinzu, ein Volumen, das dem 700 μL der BSA-Antigenlösung entspricht.
   4. Siehe Tabelle 3 Spalte Spalte G; Wiederholen Sie die Schritte 3.2 und 3.2.1 für die Negativkontrollprobe, wobei 700 μL 37 % Formaldehyd zugegeben werden, ein Volumen, das dem 700 μL der BSA-Negativkontrolllösung entspricht.
3. Entfernen Sie die Rohre nach 10-12 min aus dem Heizblock. Die Aufheizzeit sollte für jede Probe so konstant wie möglich sein. Lassen Sie die Gele 5-10 min auf der Tischplatte abkühlen (Abbildung 1B).
4. Entfernen Sie mit einem sauberen, flexiblen Einweg-Laborspatel die Gelprobe in einem Stück aus dem Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie sie in einen verschlossenen Behälter mit mindestens 15 ml neutralem gepuffertem Formalin (NBF), wobei Sie für jede Probe einen separaten NBF-Behälter verwenden.
   1. Alternativ schneiden Sie den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens mit einer neuen einschneidigen Rasierklinge ab und drücken das Gel mit Luft oder einer geeigneten Sonde von unten heraus (Abbildung 1C-G).
      HINWEIS: Die erstarrten Formaldehyd/BSA-Gele können bei Raumtemperatur bis zu 24 h in den Mikrozentrifugenröhrchen verbleiben. Wenn Sie die Gele länger als 24 Stunden im Mikrozentrifugenröhrchen belassen, können sie spröde und schwieriger zu verarbeiten und zu schneiden sein.

4. Trimmen, Verarbeiten und Einbetten von BSA-Gelen

1. Schneiden Sie den Gelkegel mit einem sauberen Einkantenrasierer in zylindrische Scheiben mit einer Dicke von etwa 5 mm (Abbildung 1H,I). Wickeln Sie die Bandscheiben in eine Biopsiefolie, legen Sie eine größere Gelscheibe in eine Kassette (die in der Pilotstudie in Schritt 5 verwendet werden soll) und die verbleibenden Gelscheiben zusammen zu einer zweiten Kassette (Abbildung 2A, E) für die Verwendung in der Gewebe-Microarray-Konstruktion (TMA) in Schritt 6. Legen Sie die umwickelten Gelscheiben in deutlich gekennzeichnete Tissue-Verarbeitungskassetten.
   1. Geben Sie die Kassettengele vor der Verarbeitung in mindestens 15 ml 10% NBF pro Gelprobe und verwenden Sie für jede Probe einen separaten Behälter NBF. Gele können 6-48 h in 10% NBF verbleiben.
2. Verarbeiten Sie die Gele in einem automatisierten histologischen Gewebeprozessor nach einem großen Gewebeplan mit Druck und Vakuum. Jeder Schritt dauert 1 h: 10% NBF, 70% Ethanol, 95% Ethanol (zweimal wiederholen), 100% Ethanol (zweimal wiederholen), Xylole (dreimal wiederholen), Paraffin bei 60 °C (dreimal wiederholen).
   HINWEIS: Für Ermittler, die Proben manuell verarbeiten möchten, befolgen Sie die gleiche Reihenfolge der Reagenzien und Zeiten.
3. Wenn die Probenverarbeitung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Kassetten aus dem Gewebeprozessor und bringen Sie sie in das Paraffin-Einbettungszentrum.
4. Wickeln Sie Gele aus dem Biopsiewickel aus und betten Sie die Gele in Paraffin ein. Für jede Probe betten Sie eine Gelscheibe in eine kleine 15 mm x 15 mm große Form ein (Abbildung 2B-D) und die restlichen Gelscheiben zusammen in eine zweite größere Form (Abbildung 2F-H). Der erste Block mit einer Probe wird verwendet, um das Peptidgel in einer Pilotstudie zu testen. Der zweite Block kann für die TMA-Konstruktion verwendet werden.

5. Pilotbewertung der Peptidverdünnungsreihe

1. Planen Sie, für jede Peptidverdünnungsserie zwei Glasobjektträger mit insgesamt 6 separaten Abschnitten zu erstellen: einen Abschnitt aus jeder der fünf Proben der Verdünnungsserie sowie einen Abschnitt aus der reinen BSA-Negativkontrollprobe.
   1. Auf den ersten Glasträger schneiden Sie einen 4 μm dicken Abschnitt aus jedem der kleineren Blöcke, die eine Gelscheibe mit den drei höchsten Peptidkonzentrationen (2,5 E-4 M bis 2,5 E-6 M) enthalten.
   2. Auf einen zweiten Objektträger schneiden Sie einen 4 μm dicken Abschnitt aus jedem Block mit den beiden niedrigsten Peptidkonzentrationen (2,5 E-7 M und 2,5 E-8 M) und einen Abschnitt aus dem reinen BSA-Kontrollblock. Notieren Sie die Reihenfolge der Proben auf den Objektträgern.
      HINWEIS: Erwarten Sie, dass die in Paraffin eingebetteten Gele reibungslos schneiden und gleichmäßige Abschnitte ohne Fragmentierung, Reißen oder Rattern erzeugen. Wenn bestimmte in Paraffin eingebettete Gelproben schwer zu schneiden sind, tränken Sie die Blockfläche vor dem Schneiden kurz in eiskaltem destilliertem Wasser. Experimentieren Sie bei Bedarf mit unterschiedlichen Einweichzeiten oder mit unterschiedlichen Lösungen (z.B. Ammoniakwasser).
   3. Nach dem Schneiden trocknen Sie die Dias bei Raumtemperatur (ca. 23 °C) für 24 h, gefolgt von 60 °C für 30 min.
2. Färben Sie die beiden für jedes Peptid vorbereiteten Objektträger mit dem gewünschten Antikörper gemäß den Standard-IHC-Protokollen.
   HINWEIS: Die primäre Antikörper-On-Slide-Konzentration, die in dieser Demonstration für monoklonales 4B5 für Kaninchen verwendet wurde, betrug 1,5 μg/ml.
   1. Erwarten Sie ein relativ gleichmäßiges Signal in jedem Gelabschnitt, wobei die verschiedenen Gelproben einen Bereich der Signalintensität zeigen, der den Peptidverdünnungen entspricht.
3. Wenn die Ergebnisse für die Pilotstudie zufriedenstellend sind, konstruieren Sie eine TMA aus den Gelspenderblöcken, die unterschiedliche Konzentrationen von Peptidantigen enthalten, wie in den nächsten Schritten des Protokolls beschrieben.

6. BSA Gel TMA Konstruktion

1. Konstruieren Sie ein Gewebe-Microarray, das doppelte Kerne mit einem Durchmesser von 1 mm aus Spenderblöcken enthält, die nur BSA-Gel enthalten, und BSA-Gele, die alle fünf Verdünnungen des ERBB2-Peptids enthalten.
   HINWEIS: Falls gewünscht, fügen Sie BSA-Gele hinzu, die die gleichen fünf Verdünnungen eines Nichtzielpeptids als zusätzliche Negativkontrollen enthalten. Falls gewünscht, schließen Sie Kerne repräsentativer ERBB2-exprimierender Zelllinien als Positivkontrollen ein.
2. Schneiden Sie 4 μm dicke Abschnitte der TMA und färben Sie sie mit 1,5 μl anti-ERBB2/HER2/neu rabbit monoclonal 4B5 (siehe Materialtabelle) gemäß Laborstandardprotokollen.
3. Beurteilen Sie die resultierende Fleckenintensität qualitativ durch Inspektion oder quantitativ durch digitales Scannen und Analysieren von Bildern (Abbildung 3A,B).
   HINWEIS: Da die digitale Bildanalyse nicht im Mittelpunkt dieses Protokolls steht, bleiben diese Schritte dem Leser überlassen, um sie nach seinen Wünschen auszuführen.

Ergebnisse

Peptide sollten sich bei Raumtemperatur vollständig in einem geeigneten Lösungsmittel auflösen, um eine optisch klare Lösung zu bilden. Wenn nach 30-60 min noch sichtbares partikuläres Material vorhanden ist, kann es hilfreich sein, zusätzliche Volumina des ursprünglichen Lösungsmittels oder eines alternativen Lösungsmittels hinzuzufügen, das das beabsichtigte Volumen der in Tabelle 1 berechneten 5-fachen Peptidlagerlösung nicht überschreitet. Ebenso sollte die kombinierte Peptid/BSA-Lösung ...

Diskussion

Diese Methode ermöglicht es dem Benutzer, einheitliche Proben der bekannten Zusammensetzung und Antigenkonzentration als Standards für IHC-Reaktionen zu erstellen, wobei Materialien und Techniken verwendet werden, die den meisten Histologielabors vertraut sind. Der wichtigste Schritt besteht darin, das Epitop zu identifizieren, an das der Antikörper von Interesse bindet. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines linearen Peptidantigens aus dem ERBB2/HER2-ICD. Das gleiche Protokoll kann verwendet werden, um BSA-...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-HER2/neu clone 4B5	Ventana	5278368001
Biopsy Wraps	Leica	3801090
Bovine Serum Albumin, ultra pure	Cell Signaling Technology	BSA #9998
50 mL Conical Tube	Corning	352070
Disposable base mold (15 mm x 15 mm)	Fisher	22-363-553
Disposable base mold (24 mm x 24 mm)	Fisher	22-363-554
Disposable spatula	VWR	80081-188
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	22331
37% Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15686
ERBB2 / HER2 peptide			UniProt P04626-1; a.a. 1240-55
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010
Magnetic Stir Bar
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager	Hamamatsu
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128
Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL
Paraplast paraffin	Leica	39601006
Peptide parameter calculator	Pep-Calc17	https://www.pep-calc.com/
Peptide suppliers	ABclonal Science		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	Anaspec Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	CPC Scientific		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	New England Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
Phosphate Buffered Saline pH 7.2
Reagent Alcohol	Thermo Scientific	9111
Single Edge Razor	VWR	55411-050
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214
TMA Tissue Grand Master	3DHISTECH
Xylenes	VWR	89370-088