İmmünohistokimya için Sentetik Antijen Kontrolleri

Özet

Bu çalışma, immünohistokimya için sentetik antijen kontrolleri oluşturmak için basit bir yöntemi belgelemektedir. Teknik, çok çeşitli konsantrasyonlarda çeşitli antijenlere uyarlanabilir. Numuneler, tahlil içi ve tahliller arası performansı ve tekrarlanabilirliği değerlendirmek için bir referans sağlar.

Özet

İmmünohistokimya (IHC) testleri, güvenilir yorumu iyi karakterize edilmiş pozitif ve negatif kontrol örnekleri gerektiren protein ekspresyon paternleri hakkında değerli bilgiler sağlar. Uygun doku veya hücre hattı kontrolleri her zaman mevcut olmadığından, sentetik IHC kontrolleri oluşturmak için basit bir yöntem faydalı olabilir. Böyle bir yöntem burada açıklanmıştır. Çok çeşitli konsantrasyonlarda proteinler, peptitler veya oligonükleotidler dahil olmak üzere çeşitli antijen tiplerine uyarlanabilir. Bu protokol, sentetik antijen kontrolleri oluşturmak için gerekli adımları açıklamakta, örnek olarak çeşitli tanısal olarak ilgili antikorlar tarafından tanınan insan eritroblastik onkogen B2 (ERBB2 / HER2) hücre içi alanından (ICD) bir peptid kullanmaktadır. Sığır serum albümini (BSA) çözeltisindeki HER2 ICD peptidinin seri seyreltimleri formaldehit ile karıştırılır ve peptid / BSA karışımını katılaştırmak ve çapraz bağlamak için 85 ° C'de 10 dakika ısıtılır. Elde edilen jel, bir doku gibi işlenebilir, kesitlenebilir ve boyanabilir, böylece çok çeşitli boyama yoğunluklarını kapsayan bilinen antijen konsantrasyonlarında bir dizi örnek elde edilebilir.

Bu basit protokol rutin histoloji laboratuarı prosedürleri ile tutarlıdır. Yöntem sadece kullanıcının istenen antijenden yeterli miktarda olmasını gerektirir. İlgili epitopları kodlayan rekombinant proteinler, protein alanları veya doğrusal peptitler lokal veya ticari olarak sentezlenebilir. Kurum içi antikorlar üreten laboratuvarlar, bağışıklayıcı antijenin alikotlarını sentetik kontrol hedefi olarak rezerve edebilir. Çok çeşitli konsantrasyonlarda iyi tanımlanmış pozitif kontroller oluşturma fırsatı, kullanıcıların laboratuvar içi ve laboratuvarlar arası tahlil performansını değerlendirmelerine, tahlillerinin dinamik aralığı ve doğrusallığı hakkında fikir edinmelerine ve tahlil koşullarını belirli deneysel hedefleri için optimize etmelerine olanak tanır.

Giriş

İmmünohistokimya (IHC), formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku kesitlerinde hedef antijenlerin hassas ve spesifik, mekansal olarak hassas tespitini sağlar. Bununla birlikte, IHC boyama sonuçları, sıcak ve soğuk iskemi süresi, doku fiksasyonu, doku ön tedavisi, antikor reaktivitesi ve konsantrasyonu, tahlil tespit kimyası ve^{reaksiyon süreleri 1} dahil olmak üzere birçok değişkenden etkilenebilir. Buna göre, tekrarlanabilir performans ve IHC reaksiyonlarının yorumlanması, bu değişkenlerin sıkı kontrolünü ve iyi karakterize edilmiş pozitif ve negatif kontrol örneklerinin kullanılmasını gerektirir. Sık kullanılan kontroller, ilgilenilen antijeni ifade etmek için bağımsız analizlerden bilinen parafin gömülü dokuları veya kültürlenmiş hücre hatlarını içerir, ancak bu tür örnekler her zaman mevcut değildir¹. Ayrıca, hedef antijenlerin dokulardaki ekspresyon düzeyleri ve hücre hattı kontrolleri genellikle sadece kalitatif olarak anlaşılır ve değişken olabilir. Tekrarlanabilir, kesin olarak bilinen hedef antijen konsantrasyonlarını içeren kontroller, IHC reaksiyon koşullarının optimizasyonuna yardımcı olabilir. Sentetik IHC kontrol numuneleri oluşturmak için fizyolojik olarak ilgili bir konsantrasyon aralığında çeşitli antijen tiplerine uyarlanabilen genel bir yöntem, yazarlar tarafından tanımlanmıştır². Bu tür bir standardın oluşturulması ve kullanılması için burada ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır.

IHC tahlilleri ^1,3,4'ün geçerli yorumlanması için uygun kontroller şarttır. Dokular, kültürlenmiş hücreler ve peptit kaplı substratlar, araştırmacıların özel ihtiyaçlarına göre IHC kontrolleri olarak kullanılmıştır. Dokuların İHH kontrolleri olarak kullanılmasının doğasında var olan avantajlar ve sınırlamalar kapsamlı bir şekilde tartışılmıştır ^1,4. Birçok antikor için, geniş bir dinamik aralıkta hedef antijeni eksprese eden hücre popülasyonlarını içeren seçilmiş normal dokulardan uygun kontroller seçilebilir. Doku kontrolleri, hedef antijen ekspresyon bölgesi veya bolluğu ile ilgili olarak iyi karakterize edilmediğinde veya potansiyel olarak çapraz reaksiyona giren antijenler aynı hücrelerde veya doku bölgelerinde birlikte eksprese edildiğinde daha az uygundur. Bu bağlamlarda, ilgilenilen antijeni ifade eden kültürlenmiş hücre hatları blokları yardımcı olabilir. Hedef özgüllüğüne dair daha fazla kanıt sağlamak için, hücre hatları hedef antijenleri aşırı veya az eksprese edecek şekilde tasarlanabilir. Örneğin, böyle bir yaklaşım yakın zamanda, bir dizi PD-L1 antijeni^5'i eksprese eden izojenik hücre hatlarından oluşan bir doku mikrodizisi kullanarak çeşitli anti-PD-L1 tahlillerini değerlendirmek için kullanılmıştır. Hücre hattı bloklarının rutin kullanımındaki pratik sınırlamalar, yeterli hücre sayıları üretmek için gereken maliyet ve zamanı ve bazı antijenlerin ekspresyonunun, klonal hücre hatları⁶ içinde bile güvenilir bir şekilde tutarlı olmayabileceği gerçeğini içerir. Sentetik peptitler, kısa lineer epitopları tanıyan antikorlar için IHC kontrolleri için üçüncü bir seçenektir. Steven Bogen ve meslektaşları, cam slaytların ^7,8 ve cam boncukların 9 yüzeyine bağlanmış peptitlerin kullanımı hakkında kapsamlı bir şekilde yayın^yaptılar. Bu grup tarafından yapılan bir çalışma, peptid bazlı IHC kontrollerinin kantitatif analizinin, paralel^10'da analiz edilen doku kontrollerinin kalitatif değerlendirmesi ile kaçırılan boyama süreci varyasyonunu tespit edebileceğini göstermiştir. Boncuk bazlı antijenleri kullanan standartlar yaygın olarak uygulanabilirken, birçok ayrıntı yazarlara aittir ve yaygın olarak benimsenmesini sınırlar.

IHC standartlarına bir başka yaklaşım, hedef antijenleri yapay olarak oluşturulan protein jellerine dahil eder. Bu kavram ilk olarak 1972 yılında Per Brandtzaeg tarafından normal tavşan serumunun glutaraldehit¹¹ kullanılarak polimerize edildiği bir çalışmada gösterilmiştir. Elde edilen jelin küçük blokları daha sonra çeşitli konsantrasyonlarda ilgilenilen immünoglobulin antijenlerini içeren çözeltilerde 1-4 hafta bekletildi. Alkol fiksasyonu ve parafin gömülmesinden sonra, ortaya çıkan kontrollerin bölümlerinin, ıslatıldıkları antijen çözeltilerinin logaritmasına karşılık gelen yoğunluklarda lekelendiği gösterilmiştir. Daha sonra, araştırmacılar immün-elektron mikroskobu çalışmalarında pozitif kontroller olarak seyreltik BSA veya beyin homojenat çözeltilerinde spesifik amino asitlerin glutaraldehit konjugatlarını hazırladılar^12,13. Daha yeni çalışmalar, formaldehit sabit protein çözeltilerinden yapılan jellerin, kütle spektrometrisi analizinde FFPE dokusu için vekil olarak kullanımını araştırdı¹⁴. Son zamanlarda yapılan bir başka çalışmada, insan veya sığır serum albümin çözeltilerinin çeşitli konsantrasyonlarda ve pH^15'te ısıtılmasıyla oluşan jellerin yapısı ve özellikleri araştırılmıştır. Bu yazarlar, serum albüminin, deneysel koşullara bağlı olarak mekanik elastikiyet, ikincil yapı koruması ve yağ asidi bağlama kabiliyeti bakımından farklılık gösteren üç tip jel oluşturduğunu bulmuşlardır. Birlikte, bu makaleler burada kullanılan yaklaşımın genel fizibilitesini göstermektedir. Tanımlanmış bileşimin protein çözeltileri, rutin histolojik yöntemler kullanılarak daha fazla işlenebilen, kesitlenebilen ve boyanabilen doku benzeri jeller oluşturur.

Bu protokol, ısı ve formaldehit ile polimerize edilmiş sığır serum albümininden (BSA) yapılan sentetik bir IHC kontrolünün oluşumunu tanımlar. Jeller, tam uzunlukta proteinler, protein alanları ve doğrusal peptitlerin yanı sıra oligonükleotidler² dahil olmak üzere protein olmayan antijenler de dahil olmak üzere çok çeşitli antijenleri içerebilir. Bu gösterim, insan ERBB2 (HER2 / neu) proteini TPTAENPEYLGLDVPV-COOH'un C-terminal 16 amino asitlerini kodlayan bir doğrusal peptit örneği antijen kullanmaktadır (bkz. Bu sekans, Herceptest poliklonal reaktifi (ENPEYLGLDVP) ve monoklonal antikorlar CB11 (AENPEYL) ve 4B5 (TAENPEYLGL) dahil olmak üzere ticari olarak temin edilebilen, tanısal olarak ilgili üç antikor tarafından tanınan epitopları içerir (bakınız Malzeme Tablosu)¹⁶.

Burada gösterilen yöntem, herhangi bir pratik histoloji laboratuvarına aşina olan süreçleri ve teknikleri kullanarak hazır bulunan reaktifleri kullanır. En önemli sınırlama, birçok durumda nispeten mütevazı bir maliyetle gerçekleştirilebilecek hedef antijenleri tanımlama ve satın alma ihtiyacıdır. Bu sentetik kontroller tamamen tanımlanmış bileşime sahip olduğundan ve basit yöntemlerle yapıldığından, birçok laboratuvarda tekrarlanabilir sonuçlarla uygulanabilirler. Bunların kullanımı, IHC boyama sonuçlarının objektif, ölçülebilir değerlendirmesini kolaylaştırabilir ve laboratuvar içi ve laboratuvarlar arası daha fazla tekrarlanabilirlik sağlayabilir.

Protokol

1. Stok çözeltisinin ve takımlarının hazırlanması

1. 5 g BSA tozunu 14 mL PBS içinde, pH 7.2'yi 50 mL'lik bir konik tüpte eşit olarak dağılana kadar karıştırarak 20 mL'lik bir w/v BSA çözeltisi hazırlayın. BSA tozunu dağıtmak için gerektiği gibi vorteks.
   1. Tamamen çözünmesini sağlamak için çözeltiyi gece boyunca 4 ° C'de tutun. PBS ile son ses seviyesini 20 mL'ye ayarlayarak %25 w/v stok çözümü elde edin.
2. 6.26 g BSA tozunu 13 mL PBS içinde, pH 7.2'yi 50 mL'lik bir konik tüpte eşit dağılana kadar karıştırarak 20 mL'lik bir w/v BSA çözeltisi hazırlayın. Tamamen çözünmesini sağlamak için çözeltiyi gece boyunca 4 ° C'de tutun. PBS ile son ses seviyesini 20 mL'ye ayarlayarak %31,3 w/v stok çözümü elde edin.
3. Bir ısı bloğunu 85 °C'ye önceden ısıtın.
   NOT: Aşağıdaki protokol, 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde oluşan 1.26-1.4 mL hacimli peptid / BSA jelleri oluşturur. Daha küçük hacimler kullanmak için, örneğin, antijen stokları sınırlandığında, jelleri PCR tüplerinde hazırlayın ve ısı bloğu olarak 85 ° C'ye ayarlanmış bir termosikler kullanın.
4. BSA/formaldehit karışımının, 700 μL %25 BSA çözeltisini 700 μL %37 formaldehit ile karıştırarak beklendiği gibi bir jel oluşturduğunu test edin. 5-10 saniye içinde 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, iyice karıştırın. Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.
   DİKKAT: Konsantre formaldehit toksiktir; uygun güvenlik önlemleri ile kullanın.
5. BSA ve formaldehit çözeltilerini karıştırdıktan hemen sonra, kapalı mikrosantrifüj tüpünü 10 dakika boyunca 85 ° C'de bir ısı bloğuna yerleştirin. Tüpü ısı bloğundan çıkarın ve soğumasını bekleyin. Jelin beklendiği gibi oluştuğunu onaylayın.

2. Peptitlerin hazırlanması ve seyreltilmesi

1. İstenilen sekansın 5-20 mg liyofilize peptidini elde edin.
   NOT: 4B5 tarafından tanınan insan ERBB2 hücre içi alanının C-terminal 16 amino asitleri TPTAENPEYLGLDVPV-COOH'dur.
   1. N-terminus, asetil-YGSG ve C-terminus, GSGC-amide 4 amino asit ekleyerek peptidin BSA'ya çapraz bağlanmasını kolaylaştırır ve BSA molekülü ile peptid epitopu arasında boşluk bırakır.
      NOT: Tam sekans şöyledir: asetil-YGSGTPTAENPEYLGLDVPVGSGC-amid.
   2. İstenirse, çekirdek peptid epitopunu genişletmek için diğer N- ve C-terminal amino asit dizilerini kullanın.
      NOT: Farklı sekansların etkisi, farklı antikor/epitop kombinasyonlarına göre değişir. C-terminal peptidinin eklenmesi, bazı antikorların C-terminal epitoplarına bağlanmasını azaltır. Bu gibi durumlarda, bu sırayı atlayın.
   3. Ticari kaynaklardan elde edilen peptitlerin, bileşimi HPLC ve kütle spektrometresi analizi ile doğrulanan% >95 saflıkta sağlandığını doğrulayın.
2. 5x (1.25 E-2 M) peptid stok çözeltileri için gerekli hacimleri hesaplayın. Tablo 1'e atıfta bulunarak, C-E sütunları, antijen moleküler ağırlığı (g / mol), yüzde antijen saflığı (0-100) ve antijen kütlesi (mg) değerlerini girin.
   NOT: 1.25 E-2 M'lik bir stok çözeltisi elde etmek için numuneyi yeniden askıya almak için çözücü hacmi (μL cinsinden), 800 x antijen moleküler ağırlığı x yüzde antijen saflığı / antijen kütlesidir.
   1. Sekiz adet 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü hazırlayın ve açıkça etiketleyin.
      NOT: Tüpler bir çözücüde 5x peptid stoğu, bir çözücüde 1x peptid stoğu, 2.5 E-4 M ila 2.5 E-8 M peptid / BSA / formaldehit jeli arasında beş adet 10x seri seyreltme ve ilave antijen içermeyen BSA / formaldehit içeren negatif bir kontrol jeli içerecektir. Tüm jel örnekleri aynı görünür. Aynı anda birden fazla peptit seyreltme seti hazırlarken, tüm tüpleri ve işleme kasetlerini doğru şekilde etiketlemeye ve tanımlamaya dikkat edin. Yanlış tanımlamayı en aza indirmek için mümkün olduğunca renk kodlu mikrosantrifüj tüpleri ve işleme kasetleri kullanın.
3. Uygun çözücünün 60 μL'sinde liyofilize peptidin tüm kütlesini (ERBB2 peptidleri için 20 mg) yeniden askıya alarak 1.25 E-2 M'de 5x peptid stok çözeltisi hazırlayın.
   NOT: Bu örnekte, dimetilformamid (DMF) doğrudan satıcının kabına eklenmiştir.
   1. Peptitin tamamen çözündüğünden emin olmak için çözeltiyi inceleyin. Gerekirse, peptid tamamen çözünene kadar numuneyi ek çözücü ekleyin ve / veya sonikleştirin, 5x peptid stoğu için Tablo 1'de hesaplanan hacmi aşmamaya dikkat edin.
      DİKKAT: DMF toksiktir; uygun önlemle kullanın.
      NOT: Amino asit dizisine ve buna karşılık gelen hidrofobikliğe ve yüke bağlı olarak, peptitler DMF, dimetil sülfoksit (DMSO), saf su veya seyreltik asetik asit, formik asit veya amonyum bikarbonat çözeltilerinde çözünür olabilir. Peptit özellikleri çeşitli çevrimiçi araçlar kullanılarak hesaplanabilir¹⁷. Bazı peptit satıcıları, belirli diziler için uygun çözücüler önerebilir.
   2. 5x peptid stoğunun hacmini Tablo 1'de hesaplanan son hacme getirmek için gerektiğinde çözücü ekleyin. 5 s için vorteks ve 5 s için 5000 x g'da oda sıcaklığında santrifüj. Peptit stok çözeltileri -80 °C'de saklanabilir.
4. Tablo 2, Sütun C'ye atıfta bulunarak, 5x peptid stoğunun 30 μL'sini 120 μL çözücüye seyrelterek 150 μL 1x peptid stok çözeltisi ( 2.5 E-3 M) hazırlayın (DMF bu örnek). 5 s için vorteks ve 5 s için 5000 x g'da oda sıcaklığında santrifüj.
5. Tablo 2, Sütun D'ye atıfta bulunarak, 140 μL 1x peptid stoğunu 560 μL% 31.3 BSA / PBS, pH 7.2'ye seyrelterek 700 μL 5 E-4 M peptid / BSA çözeltisi (Seyreltme 1) hazırlayın. 5 s için vorteks ve 5 s için 5000 x g'da oda sıcaklığında santrifüj.
   NOT: Bu çözeltinin nihai BSA konsantrasyonu %25'tir (w/v).
6. Tablo 2'ye atıfta bulunarak, E-H Sütunları, 630 μL% 25 BSA / PBS, pH 7.2'ye 70 μL peptid / BSA çözeltisi ekleyerek 5 E-4 M peptid / BSA stoğunun dört ardışık 10x seri seyreltmesini hazırlar. 5 s için vorteks ve 5 s için 5000 x g'da oda sıcaklığında santrifüj.
   NOT: Bu adımdan sonra, %25 BSA/PBS, pH 7.2'de beş adet 10 katlı seri peptit seyreltmesi (5 E-4 M ila 5 E-8 M) olacaktır. İlk dört örnek 630 μL içerecektir. Son örnek 700 μL içerecektir.
7. Tablo 2, Sütun I'e atıfta bulunarak, 700 μL% 25 BSA / PBS, pH 7.2 içeren negatif kontrol BSA numunesi hazırlayın (Şekil 1A).

3. BSA-peptid jellerinin hazırlanması

1. Isı bloğunun veya termosikletin 85 ° C'de kararlı olduğunu onaylayın.
2. Tablo 3, B-E sütunlarına bakın. Her seferinde bir numune çalışarak, ilk% 25 BSA / peptid örneğine (Seyreltme 1) 630 μL% 37 formaldehit ekleyin. 5-10 saniye içinde 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, iyice karıştırın. Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.
   DİKKAT: Konsantre formaldehit toksiktir; uygun güvenlik önlemleri ile kullanın.
   1. Peptit/BSA ve formaldehit çözeltilerini karıştırdıktan sonra, kapalı mikrosantrifüj tüpünü 10 dakika boyunca 85 °C'de bir ısı bloğuna yerleştirin.
      NOT: BSA-peptid çözeltisini ve formaldehiti iyice karıştırın, ancak numuneyi ısıya koymadan önce karışımı pipetlemek için 10 saniyeden fazla harcamayın. Formaldehit çapraz bağlama hemen başladığından, prosedür farklı numuneler için değiştirilirse jel farklı şekilde oluşabilir. Bu jellerdeki son BSA konsantrasyonu% 12.5'tir (w / v). % 10'dan daha düşük nihai BSA konsantrasyonları, katılaşmayan jeller verebilir; % 16'dan daha yüksek nihai BSA konsantrasyonları, işlendikten sonra daha kırılgan ve kesilmesi zor jeller üretebilir.
   2. 2-4 arası seyreltmelerin her biri için 3.2 ve 3.2.1 numaralı adımları yineleyin.
   3. Seyreltme 5 için 3.2 ve 3.2.1 adımlarını tekrarlayın, ancak 700 μL BSA-antijen çözeltisine eşit bir hacim olan 700 μL% 37 formaldehit ekleyin.
   4. Tablo 3 sütunu G sütununa bakın; Negatif kontrol numunesi için 3.2 ve 3.2.1 adımlarını tekrarlayın, 700 μL negatif kontrol BSA çözeltisine eşit bir hacim olan 700 μL% 37 formaldehit ekleyin.
3. Tüpleri 10-12 dakika sonra ısı bloğundan çıkarın. Isıtma süresi, her numune için mümkün olduğunca tutarlı olmalıdır. Jellerin tezgah üstünde 5-10 dakika soğumasını bekleyin (Şekil 1B).
4. Temiz, esnek tek kullanımlık bir laboratuvar spatula kullanarak, jel numunesini mikrosantrifüj tüpünden tek parça halinde çıkarın ve her numune için ayrı bir NBF kabı kullanarak en az 15 mL nötr tamponlu formalin (NBF) içeren kapalı bir kaba yerleştirin.
   1. Alternatif olarak, mikrosantrifüj tüpünün tabanını yeni bir tek kenarlı tıraş bıçağı ile kesin ve jeli alttan hava veya uygun bir prob ile dışarı itin (Şekil 1C-G).
      NOT: Katılaştırılmış formaldehit/BSA jelleri, oda sıcaklığında mikrosantrifüj tüplerinde 24 saate kadar kalabilir. Jelleri mikrosantrifüj tüpünde 24 saatten fazla bırakmak, kırılgan hale gelmelerine ve işlenmesi ve bölümlenmesi daha zor hale gelmesine neden olabilir.

4. BSA jellerinin kırpılması, işlenmesi ve gömülmesi

1. Jel koniyi temiz bir tek kenarlı tıraş bıçağı kullanarak yaklaşık 5 mm kalınlığında silindirik disklere kesin (Şekil 1H,I). Diskleri bir biyopsi sargısına sarın, daha büyük bir jel diski bir kasete yerleştirin (adım 5'teki pilot çalışmada kullanılmak üzere) ve kalan jel diskleri adım 6'da doku mikrodizisi (TMA) yapımında kullanılmak üzere ikinci bir kaset halinde (Şekil 2A, E). Sarılmış jel diskleri açıkça etiketlenmiş doku işleme kasetlerine yerleştirin.
   1. Kasetlenmiş jelleri, her numune için ayrı bir NBF kabı kullanarak, işlemeden önce jel numunesi başına en az 15 mL% 10 NBF içine yerleştirin. Jeller 6-48 saat boyunca% 10 NBF'de kalabilir.
2. Jelleri otomatik bir histoloji doku işlemcisinde, basınç ve vakum ile büyük bir doku programını izleyerek işleyin. Her adım 1 saat sürer:% 10 NBF,% 70 etanol,% 95 etanol (iki kez tekrarlayın),% 100 etanol (iki kez tekrarlayın), ksilen (üç kez tekrarlayın), 60 ° C'de parafin (üç kez tekrarlayın).
   NOT: Numuneleri manuel olarak işlemeyi seçen araştırmacılar için, aynı reaktif ve zaman sırasını izleyin.
3. Numune işleme tamamlandığında, kasetleri doku işlemcisinden çıkarın ve parafin gömme merkezine taşıyın.
4. Biyopsi sargısından jelleri çıkarın ve jelleri parafin içine gömün. Her numune için, bir jel diskini küçük bir 15 mm x 15 mm kalıba (Şekil 2B-D) ve kalan jel disklerini ikinci bir büyük kalıba (Şekil 2F-H) yerleştirin. Bir numune içeren ilk blok, bir pilot çalışmada peptid jelini test etmek için kullanılacaktır. İkinci blok TMA inşaatı için kullanılabilir.

5. Peptit seyreltme serisinin pilot değerlendirmesi

1. Her peptid seyreltme serisi için, toplam 6 ayrı bölüm içeren iki cam slayt oluşturmayı planlayın: beş seyreltme serisi numunesinin her birinden bir bölüm, artı BSA'ya özgü negatif kontrol örneğinden bir bölüm.
   1. İlk cam kızağın üzerine, en yüksek üç peptit konsantrasyonuna (2,5 E-4 M ila 2,5 E-6 M) sahip bir jel disk içeren daha küçük blokların her birinden 4 μm kalınlığında bir bölüm kesin.
   2. İkinci bir slaytta, her bloktan 4 μm kalınlığında bir bölümü, en düşük iki peptit konsantrasyonuna (2.5 E-7 M ve 2.5 E-8 M) ve BSA'ya özel kontrol bloğundan bir bölüme kadar kesin. Slaytlardaki örneklerin sırasını kaydedin.
      NOT: Parafin gömülü jellerin düzgün bir şekilde kesilmesini, parçalanma, yırtılma veya gevezelik eden eser olmadan düzgün bölümler üretmesini bekleyin. Belirli parafine gömülü jel numunelerinin kesilmesi zorsa, bölümlemeden önce blok yüzünü buz gibi soğuk damıtılmış suya kısaca batırın. Gerekirse, farklı ıslatma süreleri veya farklı çözeltilerle (örneğin, amonyak suyu) deneyin.
   3. Kesitlemeden sonra, slaytları 24 saat boyunca oda sıcaklığında (yaklaşık 23 ° C) ve ardından 30 dakika boyunca 60 ° C'de kurutun.
2. Her peptid için hazırlanan iki slaytı standart IHC protokollerine göre istenilen antikor ile sabitleyin.
   NOT: Bu gösterimde tavşan monoklonal 4B5 için kullanılan primer antikor slayt konsantrasyonu 1.5 ug/mL idi.
   1. Her jel bölümünde nispeten düzgün bir sinyal görmeyi bekleyin, farklı jel örnekleri peptid seyreltilerine karşılık gelen bir dizi sinyal yoğunluğu gösterir.
3. Pilot çalışmanın sonuçları tatmin ediciyse, protokolün sonraki adımlarında açıklandığı gibi, farklı konsantrasyonlarda peptid antijeni içeren jel donör bloklarından bir TMA oluşturun.

6. BSA jel TMA konstrüksiyonu

1. Tek başına BSA jeli içeren donör bloklardan ve ERBB2 peptidinin beş seyreltisini içeren BSA jellerinden yinelenen 1 mm çapında çekirdekler içeren bir doku mikrodizisi oluşturun.
   NOT: İstenirse, ek negatif kontroller olarak hedef olmayan bir peptidin aynı beş seyreltisini içeren BSA jellerini dahil edin. İstenirse, pozitif kontroller olarak temsili ERBB2 eksprese eden hücre hatlarının çekirdeklerini ekleyin.
2. TMA'nın 4 μm kalınlığındaki kesitlerini kesin ve laboratuvar standardı protokollere göre 1,5 ug/mL anti-ERBB2/HER2/neu tavşan monoklonal 4B5 ile lekeleyin (bkz.
3. Ortaya çıkan leke yoğunluğunu inceleme yoluyla kalitatif olarak veya dijital görüntü tarama ve analizi ile kantitatif olarak değerlendirir (Şekil 3A, B).
   NOT: Dijital görüntü analizi bu protokolün odak noktası olmadığından, bu adımlar okuyucunun tercihlerine göre gerçekleştirmesi için bırakılmıştır.

Sonuçlar

Peptitler, optik olarak berrak bir çözelti oluşturmak için oda sıcaklığında uygun bir çözücü içinde tamamen çözülmelidir. Görünür partikül malzeme 30-60 dakika sonra hala mevcutsa, orijinal çözücünün ek hacimlerinin veya Tablo 1'de hesaplanan 5x peptid stok çözeltisinin amaçlanan hacmini aşmayan alternatif bir çözücünün eklenmesi yararlı olabilir. Benzer şekilde, kombine peptid / BSA çözeltisi yarı saydam kalmalıdır (Şekil 1A).

<...

Tartışmalar

Bu yöntem, kullanıcının çoğu histoloji laboratuvarına aşina olan malzeme ve teknikleri kullanarak, IHC reaksiyonlarında standart olarak bilinen bileşim ve antijen konsantrasyonunun tek tip numunelerini oluşturmasına olanak tanır. En önemli adım, ilgilenilen antikorun bağlandığı epitopu tanımlamaktır. Bu protokol, ERBB2 / HER2 ICD'den doğrusal bir peptid antijeninin kullanılmasını açıklar. Aynı protokol, oligonükleotidler, floresan etiketler, protein alanları veya tam uzunlukta proteinler iç...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-HER2/neu clone 4B5	Ventana	5278368001
Biopsy Wraps	Leica	3801090
Bovine Serum Albumin, ultra pure	Cell Signaling Technology	BSA #9998
50 mL Conical Tube	Corning	352070
Disposable base mold (15 mm x 15 mm)	Fisher	22-363-553
Disposable base mold (24 mm x 24 mm)	Fisher	22-363-554
Disposable spatula	VWR	80081-188
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	22331
37% Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15686
ERBB2 / HER2 peptide			UniProt P04626-1; a.a. 1240-55
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010
Magnetic Stir Bar
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager	Hamamatsu
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128
Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL
Paraplast paraffin	Leica	39601006
Peptide parameter calculator	Pep-Calc17	https://www.pep-calc.com/
Peptide suppliers	ABclonal Science		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	Anaspec Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	CPC Scientific		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
	New England Peptide		Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.
Phosphate Buffered Saline pH 7.2
Reagent Alcohol	Thermo Scientific	9111
Single Edge Razor	VWR	55411-050
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214
TMA Tissue Grand Master	3DHISTECH
Xylenes	VWR	89370-088