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Method Article
Este trabajo documenta un método simple para crear controles de antígenos sintéticos para la inmunohistoquímica. La técnica es adaptable a una variedad de antígenos en una amplia gama de concentraciones. Las muestras proporcionan una referencia con la que evaluar el rendimiento y la reproducibilidad intra e interensayo.
Los ensayos de inmunohistoquímica (IHC) proporcionan información valiosa sobre los patrones de expresión de proteínas, cuya interpretación confiable requiere muestras de control positivas y negativas bien caracterizadas. Debido a que los controles apropiados de tejido o línea celular no siempre están disponibles, un método simple para crear controles sintéticos de IHC puede ser beneficioso. Tal método se describe aquí. Es adaptable a varios tipos de antígenos, incluyendo proteínas, péptidos u oligonucleótidos, en una amplia gama de concentraciones. Este protocolo explica los pasos necesarios para crear controles de antígenos sintéticos, utilizando como ejemplo un péptido del dominio intracelular (ICD) del oncogén eritroblástico humano B2 (ERBB2 / HER2) reconocido por una variedad de anticuerpos relevantes para el diagnóstico. Las diluciones seriadas del péptido HER2 ICD en solución de albúmina sérica bovina (BSA) se mezclan con formaldehído y se calientan durante 10 min a 85 °C para solidificar y reticular la mezcla de péptido/BSA. El gel resultante puede ser procesado, seccionado y teñido como un tejido, produciendo una serie de muestras de concentraciones conocidas de antígenos que abarcan una amplia gama de intensidades de tinción.
Este protocolo simple es consistente con los procedimientos rutinarios del laboratorio de histología. El método solo requiere que el usuario tenga una cantidad suficiente del antígeno deseado. Las proteínas recombinantes, los dominios proteicos o los péptidos lineales que codifican epítopos relevantes pueden sintetizarse local o comercialmente. Los laboratorios que generan anticuerpos internos pueden reservar alícuotas del antígeno inmunizante como objetivo de control sintético. La oportunidad de crear controles positivos bien definidos en una amplia gama de concentraciones permite a los usuarios evaluar el rendimiento de los ensayos intra e interlaboratorios, obtener información sobre el rango dinámico y la linealidad de sus ensayos y optimizar las condiciones de ensayo para sus objetivos experimentales particulares.
La inmunohistoquímica (IHC) permite la detección sensible y específica y espacialmente precisa de antígenos diana en secciones de tejido fijadas en formalina e incrustadas en parafina (FFPE). Sin embargo, los resultados de la tinción de IHC pueden verse afectados por múltiples variables, incluido el tiempo de isquemia caliente y fría, la fijación tisular, el pretratamiento tisular, la reactividad y concentración de anticuerpos, la química de detección de ensayos y los tiempos de reacción1. En consecuencia, el rendimiento reproducible y la interpretación de las reacciones de IHC requieren un control riguroso de estas variables y el uso de muestras de control positivas y negativas bien caracterizadas. Los controles de uso frecuente incluyen tejidos incrustados en parafina o líneas celulares cultivadas conocidas por análisis independientes para expresar el antígeno de interés, pero tales muestras no siempre están disponibles1. Además, los niveles de expresión de los antígenos diana en tejidos y controles de líneas celulares generalmente se entienden solo cualitativamente y pueden ser variables. Los controles que contienen concentraciones reproducibles y conocidas con precisión de antígeno objetivo pueden ayudar a optimizar las condiciones de reacción de la IHC. Los autores han descrito un método general, adaptable a una variedad de tipos de antígenos en un rango de concentraciones fisiológicamente relevante para crear muestras sintéticas de control de IHC2. Aquí se proporciona un protocolo detallado para la creación y el uso de este tipo de estándar.
Los controles adecuados son esenciales para la interpretación válida de los ensayos de IHC 1,3,4. Los tejidos, las células cultivadas y los sustratos recubiertos de péptidos se han empleado como controles de IHC de acuerdo con las necesidades específicas de los investigadores. Las ventajas y limitaciones inherentes al uso de tejidos como controles de IHC han sido ampliamente discutidas 1,4. Para muchos anticuerpos, se pueden elegir controles apropiados de tejidos normales seleccionados que contienen poblaciones celulares que expresan el antígeno objetivo en un amplio rango dinámico. Los controles tisulares son menos adecuados cuando el antígeno objetivo no está bien caracterizado en cuanto al sitio de expresión o la abundancia, o cuando los antígenos potencialmente de reacción cruzada se coexpresan en las mismas células o sitios tisulares. En estos contextos, los bloques de líneas celulares cultivadas que expresan el antígeno de interés pueden ser útiles. Para proporcionar más evidencia de la especificidad del objetivo, las líneas celulares pueden diseñarse para sobreexpresar o subexpresar los antígenos objetivo. Por ejemplo, este enfoque se utilizó recientemente para evaluar una variedad de ensayos anti-PD-L1 utilizando un microarray tisular de líneas celulares isogénicas que expresan un rango de antígenoPD-L1 5. Las limitaciones prácticas para el uso rutinario de bloques de líneas celulares incluyen el costo y el tiempo necesarios para producir un número suficiente de células y el hecho de que la expresión de algunos antígenos puede no ser confiablemente consistente, incluso dentro de las líneas celulares clonales6. Los péptidos sintéticos son una tercera opción para los controles de IHC para anticuerpos que reconocen epítopos lineales cortos. Steven Bogen y sus colegas han publicado extensamente sobre el uso de péptidos acoplados a la superficie de los portaobjetos de vidrio 7,8 y las perlas de vidrio9. Un estudio realizado por este grupo demostró que el análisis cuantitativo de los controles de IHC basados en péptidos podría detectar la variación del proceso de tinción omitida por la evaluación cualitativa de los controles tisulares analizados en paralelo10. Si bien los estándares que utilizan antígenos basados en cuentas podrían ser ampliamente aplicables, muchos detalles son propiedad de los autores, lo que limita la adopción generalizada.
Otro enfoque para los estándares de IHC incorpora antígenos objetivo en geles de proteínas creados artificialmente. Este concepto fue demostrado por primera vez por Per Brandtzaeg en 1972 en un estudio en el que el suero normal de conejo se polimerizó utilizando glutaraldehído11. Pequeños bloques del gel resultante se remojaron durante 1-4 semanas en soluciones que contenían los antígenos de inmunoglobulina de interés en varias concentraciones. Después de la fijación de alcohol y la incrustación de parafina, se demostró que las secciones de los controles resultantes se tiñen con intensidades correspondientes al logaritmo de las soluciones de antígenos en las que se habían empapado. Posteriormente, los investigadores prepararon conjugados de glutaraldehído de aminoácidos específicos en soluciones diluidas de BSA u homogeneizados cerebrales como controles positivos en estudios de microscopía inmunoelectrónica12,13. Trabajos más recientes investigaron el uso de geles hechos de soluciones proteicas fijadas con formaldehído como sustitutos para el tejido FFPE en el análisis de espectrometría de masas14. Otro trabajo reciente investigó la estructura y las propiedades de los geles formados por el calentamiento de soluciones de albúmina sérica humana o bovina a diversas concentraciones y pH15. Estos autores encontraron que la albúmina sérica forma tres tipos de geles que difieren en elasticidad mecánica, preservación de la estructura secundaria y capacidad de unión a ácidos grasos dependiendo de las condiciones experimentales. Juntos, estos documentos demuestran la viabilidad general del enfoque empleado aquí. Las soluciones proteicas de composición definida crean geles similares a los tejidos que se pueden procesar, seccionar y teñir utilizando métodos histológicos de rutina.
Este protocolo describe la formación de un control sintético de IHC hecho de albúmina sérica bovina (BSA) polimerizada con calor y formaldehído. Los geles pueden incorporar una amplia variedad de antígenos, incluyendo proteínas de longitud completa, dominios proteicos y péptidos lineales, así como antígenos no proteicos incluyendo oligonucleótidos2. Esta demostración utiliza un antígeno de ejemplo, un péptido lineal que codifica los aminoácidos C-terminal 16 de la proteína humana ERBB2 (HER2/neu) TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (ver Tabla de Materiales). Esta secuencia incluye los epítopos reconocidos por tres anticuerpos disponibles comercialmente y relevantes para el diagnóstico, incluidos el reactivo policlonal Herceptest (ENPEYLGLDVP) y los anticuerpos monoclonales CB11 (AENPEYL) y 4B5 (TAENPEYLGL) (ver Tabla de Materiales)16.
El método demostrado aquí emplea reactivos fácilmente disponibles utilizando procesos y técnicas familiares para cualquier laboratorio de histología practicante. La limitación más importante es la necesidad de identificar y comprar los antígenos objetivo, lo que se puede lograr en muchos casos a un costo relativamente modesto. Debido a que estos controles sintéticos son de composición totalmente definida y están hechos con métodos simples, se pueden implementar en muchos laboratorios con resultados reproducibles. Su uso puede facilitar la evaluación objetiva y cuantificable de los resultados de tinción de IHC y permitir una mayor reproducibilidad intra e interlaboratorio.
1. Preparación de soluciones de stock y herramientas
2. Preparación y dilución de péptidos
3. Preparación de geles de péptidos BSA
4. Recorte, procesamiento e incrustación de geles BSA
5. Evaluación piloto de la serie de dilución peptídica
6. Construcción de BSA gel TMA
Los péptidos deben disolverse completamente en un disolvente apropiado a temperatura ambiente para formar una solución ópticamente transparente. Si el material particulado visible todavía está presente después de 30-60 min, puede ser útil agregar volúmenes adicionales del disolvente original o un disolvente alternativo que no exceda el volumen previsto de la solución de 5x péptido calculada en la Tabla 1. Del mismo modo, la solución combinada de péptido/BSA debe permanecer translúcida (
Este método permite al usuario crear muestras uniformes de composición conocida y concentración de antígenos como estándares en las reacciones de IHC, utilizando materiales y técnicas familiares para la mayoría de los laboratorios de histología. El paso más crucial es identificar el epítopo al que se une el anticuerpo de interés. Este protocolo describe el uso de un antígeno peptídico lineal del ICD ERBB2/HER2. El mismo protocolo se puede utilizar para formar geles BSA que contienen oligonucleótidos, etique...
Charles A. Havnar, Kathy J. Hötzel, Charles A. Jones, Carmina M. Espiritu, Linda K. Rangell y Franklin V. Peale son empleados y accionistas de Genentech y Roche. Sus afiliados producen reactivos e instrumentos utilizados en este estudio.
Los autores agradecen a sus colegas Jeffrey Tom y Aimin Song por la síntesis de péptidos, Nianfeng Ge por la construcción de TMA, Shari Lau por la tinción de IHC, Melissa Edick por el escaneo microscópico digital y Hai Ngu por la cuantificación digital de imágenes.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anti-HER2/neu clone 4B5 | Ventana | 5278368001 | |
Biopsy Wraps | Leica | 3801090 | |
Bovine Serum Albumin, ultra pure | Cell Signaling Technology | BSA #9998 | |
50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
Disposable base mold (15 mm x 15 mm) | Fisher | 22-363-553 | |
Disposable base mold (24 mm x 24 mm) | Fisher | 22-363-554 | |
Disposable spatula | VWR | 80081-188 | |
Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22331 | |
37% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15686 | |
ERBB2 / HER2 peptide | UniProt P04626-1; a.a. 1240-55 | ||
Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | |
Magnetic Stir Bar | |||
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL | |||
Paraplast paraffin | Leica | 39601006 | |
Peptide parameter calculator | Pep-Calc17 | https://www.pep-calc.com/ | |
Peptide suppliers | ABclonal Science | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | |
Anaspec Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
CPC Scientific | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
New England Peptide | Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost. | ||
Phosphate Buffered Saline pH 7.2 | |||
Reagent Alcohol | Thermo Scientific | 9111 | |
Single Edge Razor | VWR | 55411-050 | |
Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
TMA Tissue Grand Master | 3DHISTECH | ||
Xylenes | VWR | 89370-088 |
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