عزل الخلايا الظهارية من بصيلات الأسنان البشرية

Summary

جريب الأسنان يحتوي على السكان الظهارية والخلايا الميكنشيمالية. تم اختيار السكان الظهارية من السكان خلية بصيلات الأسنان غير متجانسة من خلال توفير وسيلة ثقافة متميزة. نجت الخلايا الظهارية وشكلت مستعمرات في وسط خال من المصل.

Abstract

تم حصاد بصيلات الأسنان (DF) أثناء إزالة الضرس الثالث المتأثر من قبل جراح الوجه والفكين الفموي. تم إجراء عزل الخلايا الظهارية في يوم حصاد DF. تم غسل DF ثلاث مرات مع DPBS ثم تشريحها بمقص الأنسجة حتى كان للأنسجة اتساق اللب أو السحق. وكانت مجموعات الخلايا الواحدة ت حبيبات بالطرد المركزي وغسلها بمتوسط خال من الخلايا الكيراتينية المصلية. تم توزيع مجموعات الخلايا غير المتجانسة في طبق ثقافي. تم استخدام وسيلة خالية من مصل الكيراتينية لتحديد الخلايا الظهارية. تم تغيير وسيط الثقافة يوميا حتى لم يلاحظ وجود حطام عائم أو خلايا ميتة. ظهرت الخلايا الظهارية في غضون 7-10 أيام بعد توزيع سكان الخلية. نجت الخلايا الظهارية في وسط خال من المصل ، في حين سمح الحد الأدنى من التعديل α المتوسط الأساسي المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ بانتشار الخلايا من نوع mesenchymal. وDF هو مصدر الأنسجة لعزل الخلايا الظهارية الأسنان.

كان الغرض من هذه الدراسة هو وضع طريقة لعزل الخلايا الظهارية عن DF البشري. تم استخدام الرباط اللثة (PDL) لعزل الخلايا الظهارية الأسنان البشرية. شراء الخلايا الظهارية من PDL الإنسان ليست دائما ناجحة بسبب حجم الأنسجة الصغيرة، مما يؤدي إلى انخفاض أعداد الخلايا الظهارية. DF وحدة تخزين أكبر من PDL ويحتوي على خلايا أكثر. DF يمكن أن يكون مصدر نسيج للثقافة الأولية للخلايا الظهارية الأسنان البشرية. هذا البروتوكول أسهل وأكثر كفاءة من أسلوب العزل باستخدام PDL. شراء الخلايا الظهارية الأسنان البشرية قد تسهل المزيد من الدراسات من التفاعلات الظهارية الظهارية الأسنان.

Introduction

يبدأ تكوين الأسنان مع تجويف الظهارة ^{الفموية1}. وفقا لمرحلة نمو الأسنان ، فإن الظهارة الفموية لها أسماء مختلفة ، بما في ذلك ظهارة المينا الداخلية والخارجية ، وحلقة عنق الرحم ، وغمد جذر هيرتفيغ الظهاري (HERS). تتصل المقصورات الظهارية بالخلايا الميكنشيمالية المحيطة. التفاعلات الظهارية-الميكنشيمالية تنظم تكوين الأسنان وتجديد الأنسجة. شراء خلايا الظهارية الأسنان، مثل الخلايا القرنية عن طريق الفم وخلايا غمد الجذر الظهارية هيرتفيغ (HERSCs)، أمر بالغ الأهمية لدراسة التفاعلات الظهارية الظهارية ^{الأسنان2}.

يتم عزل الخلايا الظهارية الأسنان المشتقة من القوارض من الهيكل الظهاري ، مثل HERS. قام لي وزملاؤه بعزل وخلد الجرذان المشتقة من الأضراس HERSCs بعد حصاد الجزء apical من جراثيم الأسنان النامية من الفئران البالغة من العمر 8 ^أيام3. تم فصل HERS من الأنسجة apical تحت التكبير. وبالنظر إلى مرحلة نمو الأسنان والعمر ، فإن حصاد HERS من البشر يكاد يكون مستحيلا بسبب القضايا الأخلاقية: يجب إزالة جرثومة الأسنان النامية من طفل صغير لحصاد HERS البشري. نادرا ما يتم استخراج جراثيم الأسنان غير الناضجة. يمكن عزل الخلايا الظهارية أسنان الإنسان من اللثة والرباط اللثة (PDL). تشارك الخلايا المشتقة من البنية الظهارية في تكوين الأسنان جنبا إلى جنب مع المكونات الميكنشيمالية وقد تكون أكثر ملاءمة لدراسة التفاعلات الظهارية للأسنان من الخلايا القرنية الفموية. تقع الخلايا الظهارية من Malassez (ERM) هي بقايا ظهارية مشتقة من HERS وتقيم بأعداد صغيرة في ^PDL4. وتشير الدراسات إلى عزلة مراكز استراتيجية الأمن البشرية عن ^PDL5. ومع ذلك، فإن حصاد مركبات هيرسك البشرية من أنسجة ال PDL ليس ناجحا دائما بسبب ندرة السكان الظهاريين في هذا ^{الموقع5,6}.

على الرغم من الحفاظ على HERSCs المشتقة من القوارض في الوسائط المحتوية على ^{المصل3,7} ، يتم استزراع الخلايا الظهارية المشتقة من DF البشرية مع وسائط خالية من المصل مماثلة للخلايا الظهارية البشرية الأخرى ، مثل خلايا القرنية البشرة البشرية العادية وخلايا القرنية الفموية البشرية ^{العادية8،9}. وهذا يعني الاختلافات الفسيولوجية أو الوظيفية بين الخلايا الظهارية أسنان القوارض والخلايا الظهارية الأسنان البشرية. قد يساهم فهم الآلية المتعلقة بالتفاعلات الظهارية -الميسنشيمالية للأسنان في تطوير التطبيقات السريرية ، بما في ذلك إعادة ربط اللثة أثناء إعادة الزرع ، وتجديد اللثة في أمراض اللثة ، وتجديد عقدة اللب دينتين ، وتوليد الأسنان الحيوية. بالنظر إلى خصائص البحوث التحويلية ، قد تكون الخلايا الظهارية أسنان الإنسان أكثر ملاءمة من الخلايا الظهارية أسنان القوارض لدراسة التفاعلات الظهارية - mesenchymal.

وDF الإنسان هو النسيج الضام فضفاضة وغالبا ما يقيم في الأسنان المتضررة. يحتوي DF على السلائف الميكنشيمالية10. ومع ذلك ، على حد علمنا ، لم تبلغ أي دراسة عن عزل الخلايا الظهارية عن بصيلات الأسنان قبل عام 2021. أبلغ أوه ويي عن عزل الخلايا الظهارية عن DF البشري في عام 20218. تم تأكيد النمط الظاهري الظهاري من خلال النشاف الغربي والتحليل المورفولوجي. أظهر تحليل أصل الخلايا الظهارية المشتقة من DF نتائج مماثلة مع دراسات أخرى. لم تكن الخلايا الظهارية المشتقة من DF بطانة الرحم ولا هيماتوبيك5^،11 ، واقترح أوه ويي تسمية هذه الخلايا باسم DF-HERSCs. يحتوي DF على حجم أكبر من PDL، ويمكن عزل خلايا ظهارية أكثر من DF. وهذا يعزز ظهور المستعمرات الظهارية ويؤدي إلى ارتفاع معدل النجاح في حصاد الخلايا الظهارية من DF. تقترح هذه الدراسة استخدام DF كمصدر للأنسجة لعزل الخلايا الظهارية للأسنان.

في هذه الدراسة، تم عزل خلايا واحدة من DF وفقا للإجراءات الموصوفة ^{سابقا10،12}. يحتوي DF على مجموعات خلايا غير متجانسة ، ويمكن أن تكون هناك عدة أنواع من الخلايا في المرحلة المبكرة من الإجراء. قام مورشيك وزملاؤه بعزل الخلايا الجذعية الميكنشيمالية المشتقة من ^DF10. افترضنا أن DF يحتوي على خلايا ظهارية وأن الخلايا الظهارية فقط هي التي يمكنها البقاء على قيد الحياة في ظل ظروف خالية من المصل. تختلف هذه الدراسة عن دراسة مورشيك وآخرين من حيث اختيار السكان الظهاريين وتثبيط الخلايا الميكنشيمالية. تم إجراء الاختيار باستخدام الوسائط الخالية من مصل الكيراتينية (SFM) ، والتي تسمح بانتشار الخلايا الظهارية وتمنع انتشار الخلايا الوسيطة. نشأت هذه الدراسة من تقرير من قبل أوه ^وYy8. وكان الهدف من هذه الدراسة هو وصف تفاصيل الطريقة المستخدمة في ذلك التقرير لعزل الخلايا الظهارية عن DF البشري.

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمستشفى جامعة كيونغ هي في غانغدونغ (موافقة IRB رقم. KHNMC 2017-06-009).

1. جمع DF

ملاحظة: أعطى المرضى موافقة مستنيرة قبل الجراحة لإزالة الضرس الثالث الناضج أو غير الناضج. تم استبعاد المرضى الذين يعانون من المرض التالي: السكري وارتفاع ضغط الدم والسل والتهاب الكبد ومتلازمة نقص المناعة المكتسبة. كما استبعدت النساء الحوامل.

1. حصاد DF أثناء الاستخراج الجراحي من الأضراس الثالثة المتضررة (الشكل 1A).
   ملاحظة: تم إجراء الجراحة من قبل جراح الوجه والفكين عن طريق الفم. مطلوب التعاون مع طبيب أسنان لجمع الأنسجة.
2. تخزين DF في المالحة الفوسفات المخزنة بالفوسفات (DPBS) مع 3٪ البنسلين-streptomycin في 4 درجة مئوية قبل الاستخدام. إجراء إجراءات العزل في يوم حصاد DF (الشكل 1B).

2. عزل مجموعات أحادية الخلية من DF

1. إعداد حلول المخزون من الكولاجيناز من النوع الأول وبروتيز في DPBS بحيث التركيزات النهائية من نوع الكولاجينز الأول وبروتيز هي 1 ملغم / مل و 2.4 ملغ / مل ، على التوالي.
2. إعداد ثلاثة أنابيب غسل 50 مل مع 20 مل من DPBS لكل أنبوب. تسمية الأنابيب ك 1 و 2 و 3.
3. غسل DF في أنابيب الغسيل بالتسلسل. عقد DF مع ملاقط ووضع DF في أنبوب 1. أخرج DF من الأنبوب 1 وضعه في الأنبوب 2. أخرج DF من الأنبوب 2 وضعه في الأنبوب 3. يهز بلطف DF 10-15 مرات في كل أنبوب. بعد غسل ثلاث مرات، ضع DF في طبق ثقافة 60 ملم (الشكل 2A).
4. فرم DF مع مقص الأنسجة (الشكل 2B). نقل جزء صغير فقط إلى طبق الثقافة لتقليل فقدان الأنسجة. كرر القطع حتى DF له مظهر اللب أو اسفنجي (الشكل 2C).
5. مزيج 1 مل من الكولاجين من النوع الأول و 1 مل من محلول بروتياز في أنبوب مخروطي 15 مل للحصول على تركيزات نهائية من 1 ملغم / مل و 2.4 ملغم / مل ، على التوالي.
6. نقل DF المفروم في أنبوب مخروطي 15 مل من الخطوة 2.5. هزة برفق واحتضان أنبوب لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
7. إضافة 5 مل من 0.05٪ تريبسين-EDTA إلى الأنبوب، يهز، واحتضان أنبوب لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية.
8. إعداد الخلايا الكيراتينية المتوسطة التي تحتوي على keratinocyte SFM 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS). إضافة 3 مل من الكيراتينوسي المتوسطة في أنبوب مخروطي جديد 50 مل. ضع مصفاة 40 ميكرومتر فوق هذا الأنبوب واستخدم ماصة مصلية سعة 10 مل لتنشق الناطور من الخطوة 2.6 وتمريرها عبر المصفى.
   ملاحظة: تقليل دمج بقايا الأنسجة المهضومة أثناء تناول supernatant. إزالة بقايا الأنسجة مع مصفاة 40 ميكرومتر للحد من الفشل. بقايا الأنسجة قد تمر عبر 70 ميكرومتر مصفاة وتعوق تشكيل المستعمرة. سوف FBS في المتوسط keratinocyte تعطيل الإنزيمات.
9. كرر الخطوتين 2.7 و 2.8.
10. نقل تعليق جمعها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
11. الطرد المركزي أنبوب مخروطي 15 مل في 288 × غرام لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية. أزل الناتنات الفائق.
    ملاحظة: كن حذرا لتجنب أي إزالة عرضي للخلايا الكريات، والتي هي في معظمها غير مرئية.
12. إضافة 3 مل من الخلايا الكيراتينية SFM وغسل الخلايا مرتين مع ماصة 1 مل مع الطرد المركزي كما هو الحال في الخطوة 2.11.
13. لوحة السكان خلية واحدة في طبق ثقافة 60 ملم باستخدام الكيراتينوسي SFM. حافظ على طبق الثقافة بحجم نهائي يبلغ 5 مل في جو رطب من _{ثاني أكسيد الكربون} بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. تغيير متوسطة الثقافة يوميا حتى لا يلاحظ وجود حطام الأنسجة أو الخلايا.
    ملاحظة: إزالة debris العائمة في الوسط الثقافة عن طريق تغيير الوسيطة. تأخر إزالة حطام الأنسجة أو الخلايا الميتة له تأثير غير موات على الثقافة الأولية.
14. فحص لوحة من الخطوة 2.13 للتحقق من نمو الخلايا الظهارية (الشكل 3A).
    ملاحظة: تنمو الخلايا الظهارية في غضون 7-10 أيام بعد طلاء مجموعات خلايا مفردة.
15. توسيع المستعمرات الظهارية والثقافة الفرعية للخلايا.
    1. يستنشق المتوسط ويغسل الجزء السفلي من لوحة الثقافة مرة واحدة مع 3 مل من keratinocyte SFM.
    2. أضف 2 مل من بروتياز فصامية الخلية واحتضنها في جو رطب من _{ثاني أكسيد الكربون} بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
       ملاحظة: كرر الخطوة 2.15.2 إذا انفصال الخلية غير فعالة.
    3. إضافة 2 مل من الكيراتينوسي المتوسطة إلى لوحة الثقافة ونقل محتويات في أنبوب مخروطي 15 مل.
       ملاحظة: إضافة المزيد من الكيراتينوسيوسي المتوسطة غير مطلوب إذا كرر الخطوة 2.15.2.
    4. الطرد المركزي أنبوب مخروطي 15 مل في 288 × غرام لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية.
    5. إزالة supernatant وغسل بيليه الخلية مرتين مع 3 مل من الكيراتينوسيت SFM.
    6. لوحة الخلايا في طبق ثقافة 100 ملم باستخدام الكيراتينوسي SFM (الحجم النهائي من 10 مل لكل طبق 100 ملم).
16. إعداد وتخزين مخزونات الخلايا في خزان النيتروجين السائل.
    1. حصاد الخلايا كما هو موضح في الخطوات 2.15.1-2.15.5.
    2. توزيع الخلايا في cryovials في 1 مل من تجميد المتوسطة (80٪ keratinocyte SFM، 10٪ ديميثيل سلفكسيد، 10٪ FBS).
    3. ضع القنينات في حاوية تجميد وخزنها عند -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    4. نقل قوارير من الفريزر العميق إلى خزان النيتروجين السائل.

النتائج

DF الحصاد
تم إجراء الجراحة من قبل جراح الوجه والفكين عن طريق الفم. تم جمع المواد المشتقة من الإنسان، بما في ذلك جزء الأسنان، والأنسجة الغنجية، وDF، من قبل جراح (الشكل 1A). قد تكون مرفقة DF إلى جزء الأسنان. جراح الوجه والفكين عن طريق الفم سوف تكون قادرة على تحديد DF. التع?...

Discussion

يتضمن هذا البروتوكول خطوات هامة. حصاد مجموعات وحيدة الخلية أمر ضروري للعزل الناجح للخلايا الظهارية من DF. سعينا لعزل الخلايا الظهارية من DF على أساس فرضيتنا أن هناك المزيد من الخلايا الظهارية في DF. يعزز إجراء الألغام انفصال الخلايا وإطلاقها من DF. تم تحسين إجراء الفتك ، وتكرار الألغام حتى ظهر...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol	EMD millipore Co., MA, USA	1096341011	1 L
0.05% trypsin-EDTA	Gibco, Grand island, NY, USA	25300054	100 mL
40 μm cell strainer	Falcon, NC, USA	352340
Cell culture dish (100 x 20 mm)	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	172958	Discontinued
Cell culture dish (60 x 15 mm)	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	150326
Collagenase type 1	Gibco, Grand island, NY, USA	17100017	1 g
Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge	Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea	CB-514R
Conical tube	SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea	50015 50050	15 mL 50 mL
Cryogenic vial	Corning Inc., NY, US	430488	2 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Missouri, US	D2650-100ml	100 mL
Dispase	Gibco, Grand island, NY, USA	17105041	1 g
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea	LB 001-02	500 mL
Fetal bovine serum	Gibco, Grand island, NY, USA	16000044	500 mL
Heraeus BB 15 / CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	51023121
Keratinocyte serum-free medium	Gibco, Grand island, NY, USA	10724-011	500 mL
MVE CryoSystem 2000	MVE Biological Solutions Co., GA, USA	CryoSystem 2000
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	5100-0001	for 1.2-2 mL CryoVials
Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope	Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts	22-00723-01	Discontinued
Penicillin-Streptomycin Strep	Gibco, Grand island, NY, USA	15140122	100 mL (10,000 U/mL)
Pipet aid XP	Drummond scientific Co., PA, USA	HDR-4-000-201
Pipetman Classic P1000	Gilson, Villiers le Bel, France	F123602	100-1000 µL
Refrigerant	Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan	CLN 540U	~-80 °C / Discontinued
Serological pipet	SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea	91010	10ml
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	12605010	cell dissociation protease