בידוד תאי אפיתל מזקיקי השיניים האנושיים

Summary

זקיק השיניים מכיל אוכלוסייה אפיתל ותאים mesenchymal. אוכלוסיית האפיתל נבחרה מתוך אוכלוסיית תאי הזקיק הדנטליים ההטרוגניים על ידי מתן מדיום תרבותי מובהק. תאי אפיתל שרדו ויצרו מושבות במדיום נטול סרום.

Abstract

זקיק השיניים (DF) נקצר במהלך הסרת שפונחת שלישית שהושפעה על ידי מנתח מקסילופסיאלי אוראלי. בידוד תאי אפיתל בוצע ביום קציר DF. DF נשטף שלוש פעמים עם DPBS ולאחר מכן נותח עם מספריים רקמה עד הרקמה היה עקביות מעופשת או מעוך. אוכלוסיות חד-תאיות הושמטו על ידי צנטריפוגה ונשטפו עם מדיום נטול סרום קרטינוציטים. אוכלוסיות תאים הטרוגניות חולקו בצלחת תרבות. קרטינוציטים ללא סרום מדיום שימש לבחירת תאי האפיתל. מדיום התרבות השתנה מדי יום עד שלא נצפו פסולת צפה או תאים מתים. תאי אפיתל הופיעו בתוך 7-10 ימים לאחר התפלגות אוכלוסיית התאים. תאי אפיתל שרדו במדיום נטול סרום, בעוד α שינוי בינוני חיוני מינימלי בתוספת 10% סרום בקר עוברי אפשר את התפשטותם של תאים מסוג mesenchymal. DF הוא מקור רקמה לבידוד של תאי אפיתל שיניים.

מטרת המחקר הייתה ליצור שיטה לבידוד תאי אפיתל מ-DF אנושי. רצועה חניכיים (PDL) שימש לבידוד של תאי אפיתל שיניים אנושיים. רכישת תאי אפיתל מ- PDL אנושי אינה תמיד מוצלחת בשל נפח הרקמות הקטן, מה שמוביל למספרים נמוכים של תאי אפיתל. ל-DF יש אמצעי אחסון גדול יותר מ-PDL והוא מכיל יותר תאים. DF יכול להיות מקור רקמה לתרבות העיקרית של תאי אפיתל שיניים אנושיים. פרוטוקול זה קל ויעיל יותר משיטת הבידוד המשתמשת ב-PDL. רכישת תאי אפיתל שיניים אנושיים עשויה להקל על מחקרים נוספים של אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות שיניים.

Introduction

היווצרות השן מתחילה עם ההשתנות של האפיתל ^{האוראלי1}. על פי השלב ההתפתחותי של השן, לאפיתל הפה יש שמות שונים, כולל אפיתל אמייל פנימי וחיצוני, לולאת צוואר הרחם, ונדן השורש האפיתל של הרטוויג (HERS). תאי האפיתל מתקשרים עם התאים המנשימליים שמסביב. אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות לווסת היווצרות שיניים והתחדשות רקמות. רכישת תאי אפיתל דנטליים, כגון קרטינוציטים אוראליים ותאי נדן השורש האפיתל של Hertwig (HERSCs), חיונית לחקר אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות ^{דנטליות2}.

תאי אפיתל דנטליים שמקורם במכרסמים מבודדים ממבנה האפיתל, כגון HERS. לי ועמיתיו בודדו והנציחו את ה-HERSCs שמקורם בחולדות לאחר שקצרו את החלק האפירי של חיידקי השיניים המתפתחים מעכברושים בני 8 ^ימים3. ה-HERS הופרד מרקמה אפית תחת הגדלה. בהתחשב בשלב התפתחותי השן ובגיל, קצירת HERS מבני אדם היא כמעט בלתי אפשרית בגלל בעיות אתיות: חיידק שן מתפתח צריך להיות מוסר מילד צעיר כדי לקצור את HERS האנושי. חיידקי שיניים לא בוגרים מופקים לעתים רחוקות. תאי אפיתל שיניים אנושיים יכולים להיות מבודדים מן הגינגיבה ואת הרצועה חניכיים (PDL). תאים שמקורם במבנה אפיתל משתתפים בהיווצרות שיניים יחד עם רכיבים מזנכימליים ועשויים להתאים יותר לחקר אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות דנטליות מאשר קרטינוציטים אוראליים. שאריות תא אפיתל של Malassez (ERM) הם שרידי אפיתל שמקורם HERS ושוכנים במספרים קטנים ב- ^PDL4. מחקרים מדווחים על בידוד של HERSCs אנושי מ ^PDL5. עם זאת, קצירת HERSCs אנושי מרקמת PDL לא תמיד מוצלח בגלל המחסור של האוכלוסייה האפיתלית במיקום ^זה5,6.

למרות HERSCs נגזר מכרסמים נשמרים ב ^media3,7 המכיל סרום, תאי אפיתל אנושיים נגזר DF הם תרבית עם מדיה ללא סרום דומה לתאי אפיתל אנושיים אחרים, כגון קרטינוציטים אפידרמיס אנושי נורמלי וקרטינוציטים אוראליים אנושי ^{נורמלי8,9}. זה מרמז על הבדלים פיזיולוגיים או תפקודיים בין תאי אפיתל שיניים מכרסמים ותאי אפיתל שיניים אנושיים. הבנת המנגנון לגבי אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות שיניים עשויה לתרום להתפתחות יישומים קליניים, כולל חיבור חניכיים במהלך נטיעה מחדש, התחדשות חניכיים במחלת חניכיים, התחדשות קומפלקס עיסת-דנטין, ויצירת ביו-שן. בהתחשב במאפייני המחקר התרגומי, תאי אפיתל שיניים אנושיים עשויים להיות מתאימים יותר מתאי אפיתל דנטלי מכרסמים לחקר אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות.

DF האנושי הוא רקמת חיבור רופפת ולעתים קרובות שוכן בשן מושפעת. DF מכיל מבשרים mesenchymal10. עם זאת, למיטב ידיעתנו, אף מחקר לא דיווח על בידוד של תאי אפיתל מזקיקי שיניים לפני 2021. הו ויי דיווחו על בידוד תאי אפיתל מ-DF אנושי בשנת 20218. הפנוטיפ האפיתל אושר על ידי ניתוח סופג ומורפולוגי מערבי. ניתוח מקורם של תאי אפיתל שמקורם ב-DF הדגים תוצאות דומות עם מחקרים אחרים. תאי אפיתל שמקורם ב-DF לא היו אנדותל ולא hematopoietic5,11, ו-Oh ו-Yi הציעו לקרוא לתאים אלה כ-DF-HERSCs. ל- DF יש נפח גדול יותר מה- PDL, וניתן לבודד תאים אפיתל יותר מה- DF. זה משפר את הופעתם של מושבות אפיתל ותוצאות שיעור הצלחה גבוה בקציר תאי אפיתל מ- DF. מחקר זה מציע להשתמש ב- DF כמקור רקמה לבידוד של תאי אפיתל דנטליים.

במחקר הנוכחי, תאים בודדים היו מבודדים מן DF על פי נהלים שתוארו ^{בעבר10,12}. ה- DF מכיל אוכלוסיות תאים הטרוגניים, ומספר סוגי תאים עשויים להיות נוכחים בשלב המוקדם של ההליך. מורצ'ק ועמיתיו בודדו תאי גזע מזנכימליים שמקורם ^ב-DF10. שיערנו כי DF מכיל תאי אפיתל וכי רק תאי אפיתל יכולים לשרוד בתנאים ללא סרום. מחקר זה שונה מזה של מורצ'ק ואח ' במונחים של בחירת האוכלוסייה האפיתלית ועיכוב של תאים mesenchymal. הבחירה בוצעה באמצעות מדיה נטולת סרום קרטינוציט (SFM), המאפשרת התפשטות תאי אפיתל ומעכבת את התפשטות התאים המנשימליים. מחקר זה מקורו בדו"ח של Oh ו- ^Yi8. מטרת מחקר זה הייתה לתאר פרטים על השיטה המשמשת בדו"ח זה לבידוד תאי אפיתל מ- DF אנושי.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית של בית החולים האוניברסיטאי קיונג הי בגנגדונג (אישור IRB לא. KHNMC 2017-06-009).

1. איסוף DF

הערה: המטופלים נתנו הסכמה מדעת לפני הניתוח להסרת טוחנת שלישית בוגרת או לא בוגרת. חולים עם המחלה הבאה הוחרגו: סוכרת, יתר לחץ דם, שחפת, הפטיטיס, תסמונת חיסונית נרכשת. נשים בהריון גם הוחרגו.

1. קציר DF במהלך החילוץ הכירורגי של טחנות שלישיות שהושפעו (איור 1A).
   הערה: הניתוח בוצע על ידי מנתח מקסילופסיאלי אוראלי. שיתוף פעולה נדרש עם רופא שיניים לאיסוף רקמות.
2. יש לאחסן את DF בתמצית מלח עם אגירת פוספט (DPBS) של Dulbecco עם 3% פניצילין-סטרפטומיצין ב-4 °C (70 °F) לפני השימוש. בצעו הליכי בידוד ביום קציר DF (איור 1B).

2. לבודד אוכלוסיות חד-תאיות מ-DF

1. הכן פתרונות מלאי מסוג קולגנאז I ופרוטאז ב- DPBS כך שריכוזים סופיים של סוג קולגנאז I ופרוטאז הם 1 מ"ג / מ"ל ו 2.4 מ"ג / מ"ל, בהתאמה.
2. הכן שלושה צינורות כביסה 50 מ"ל עם 20 מ"ל של DPBS לכל צינור. תייג את הצינורות כ- 1, 2 ו- 3.
3. לשטוף את DF בצינורות הכביסה ברצף. החזק את DF עם פינצטה ומניחים את DF בצינור 1. קח את DF מתוך צינור 1 ומניח אותו בצינור 2. קח את DF מתוך צינור 2 ומניח אותו בצינור 3. יש לנער בעדינות את DF 10-15 פעמים בכל שפופרת. לאחר הכביסה שלוש פעמים, הניחו את ה-DF בצלחת תרבות של 60 מ"מ (איור 2A).
4. טחון את ה-DF במספריים של רקמות (איור 2B). מעבירים רק חלק קטן לצלחת התרבות כדי למזער את אובדן הרקמות. חזרו על החיתוך עד של-DF יהיה מראה נוצץ או מעוך (איור 2C).
5. לערבב 1 מ"ל של קולגנאז סוג I ו 1 מ"ל של פתרון פרוטאז בצינור חרוט 15 מ"ל כדי להשיג ריכוזים סופיים של 1 מ"ג / מ"ל ו 2.4 מ"ג / מ"ל, בהתאמה.
6. העבר את DF טחון לתוך צינור חרוט 15 מ"ל מ שלב 2.5. לנער בעדינות לדגור על הצינור במשך 1 שעה ב 37 °C (7 °F).
7. הוסף 5 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לצינור, לנער, ולדגירה את הצינור במשך 15 דקות ב 37 °C (50 °F).
8. הכן קרטינוציט בינוני המכיל קרטינוציט SFM 10% סרום בקר עוברי (FBS). הוסף 3 מ"ל של מדיום קרטינוציטים לתוך צינור חרוט חדש 50 מ"ל. מניחים מסננת 40 מיקרומטר על גבי צינור זה ולהשתמש פיפטה סרולוגית 10 מ"ל כדי לשאוף את supernatant מ שלב 2.6 ולהעביר אותו דרך מסננת.
   הערה: מזער את שילובם של שרידי רקמות מעוכלות תוך כדי נטילת supernatant. הסר את שרידי הרקמה עם מסננת 40 מיקרומטר כדי למזער את הכישלון. שרידי רקמות עשויים לעבור דרך מסנני 70 מיקרומטר ולעכב היווצרות המושבה. FBS במדיום קרטינוציט ינטרל את האנזימים.
9. חזור על שלבים 2.7 ו- 2.8.
10. העבר את ההשעיה שנאספו לצינור חרוט 15 מ"ל.
11. צנטריפוגה צינור חרוט 15 מ"ל ב 288 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (5 °F). הסר את סופר-טבעי.
    הערה: היזהר כדי למנוע הסרה מקרית של תאים כדוריים, שהם בעיקר בלתי נראים.
12. הוסף 3 מ"ל של קרטינוציט SFM ולשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל pipette עם centrifugation כמו בשלב 2.11.
13. צלחת האוכלוסייה של תא יחיד לתוך צלחת תרבות 60 מ"מ באמצעות קרטינוציט SFM. לשמור על צלחת התרבות עם נפח סופי של 5 מ"ל באווירה לחה של 5% _CO2 ב 37 °C (5 °F). לשנות את המדיום התרבות מדי יום עד אין רקמה או פסולת התא נצפים.
    הערה: הסר פסולת צפה במדיום התרבות על-ידי שינוי המדיום. הסרה מאוחרת של פסולת רקמות או תאים מתים יש השפעה שלילית על התרבות העיקרית.
14. בדקו את הלוחית החל מ-2.13 כדי לבדוק את הצמיחה של תאי האפיתל (איור 3A).
    הערה: תאי אפיתל לגדול בתוך 7-10 ימים לאחר ציפוי אוכלוסיות תא יחיד.
15. להרחיב את מושבות האפיתל ותת-תרבות התאים.
    1. לשאוף את המדיום ולשטוף את החלק התחתון של צלחת התרבות פעם אחת עם 3 מ"ל של קרטינוציט SFM.
    2. הוסף 2 מ"ל של פרוטאז דיסוציאציה לתא ודגרה באטמוספירה לחה של 5% _CO2 ב 37 °C (7 °F) במשך 3 דקות.
       הערה: חזור על שלב 2.15.2 אם ניתוק התא אינו יעיל.
    3. מוסיפים 2 מ"ל של קרטינוציט בינוני לצלחת התרבות ומעבירים את התוכן בצינור חרוטי 15 מ"ל.
       הערה: אין צורך להוסיף אמצעי קרטינוציטים נוסף אם שלב 2.15.2 חוזר על עצמו.
    4. צנטריפוגה צינור חרוט 15 מ"ל ב 288 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (5 °F).
    5. הסר את supernatant ולשטוף את גלולה התא פעמיים עם 3 מ"ל של קרטינוציט SFM.
    6. צלחת התאים בצלחת תרבית 100 מ"מ באמצעות קרטינוציט SFM (נפח סופי של 10 מ"ל לכל צלחת 100 מ"מ).
16. הכן ולאחסן מלאי תאים במיכל חנקן נוזלי.
    1. תאי קציר כמתואר בשלבים 2.15.1-2.15.5.
    2. להפיץ את התאים לתוך cryovials ב 1 מ"ל של בינוני מקפיא (80% קרטינוציט SFM, 10% דימתילסולפוקסיד, 10% FBS).
    3. מניחים את הבקבוקונים במיכל הקפאה ומאחסנים אותם ב -80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
    4. מעבירים את הבקבוקונים מהמקפיא העמוק למיכל חנקן נוזלי.

תוצאות

קצירת DF
הניתוח בוצע על ידי מנתח מקסילופסיאלי אוראלי. חומרים שמקורם בבני אדם, כולל שבר השן, רקמת חניך ו-DF, נאספו על ידי מנתח (איור 1A). ייתכן שהמו"ר מחובר לרסיס השן. מנתח מקסילופסיאלי אוראלי יוכל לזהות את DF. שיתוף פעולה ותקשורת עם המנתח נדרשים לאיסוף רקמות. DF הוא רקמה ד...

Discussion

פרוטוקול זה כולל שלבים קריטיים. קצירת אוכלוסיות חד-תאיות חיונית לבידוד מוצלח של תאי אפיתל מ-DF. ביקשנו לבודד תאי אפיתל מה-DF בהתבסס על ההשערה שלנו שיש יותר תאי אפיתל ב-DF. הליך הכרייה משפר את הניתוק והשחרור של תאים מה- DF. הליך הכרייה שופר, וכרייה חוזרת על עצמה עד DF נראה pulpy כדי להקל על שחרור של תאי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol	EMD millipore Co., MA, USA	1096341011	1 L
0.05% trypsin-EDTA	Gibco, Grand island, NY, USA	25300054	100 mL
40 μm cell strainer	Falcon, NC, USA	352340
Cell culture dish (100 x 20 mm)	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	172958	Discontinued
Cell culture dish (60 x 15 mm)	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	150326
Collagenase type 1	Gibco, Grand island, NY, USA	17100017	1 g
Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge	Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea	CB-514R
Conical tube	SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea	50015 50050	15 mL 50 mL
Cryogenic vial	Corning Inc., NY, US	430488	2 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Missouri, US	D2650-100ml	100 mL
Dispase	Gibco, Grand island, NY, USA	17105041	1 g
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea	LB 001-02	500 mL
Fetal bovine serum	Gibco, Grand island, NY, USA	16000044	500 mL
Heraeus BB 15 / CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	51023121
Keratinocyte serum-free medium	Gibco, Grand island, NY, USA	10724-011	500 mL
MVE CryoSystem 2000	MVE Biological Solutions Co., GA, USA	CryoSystem 2000
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	5100-0001	for 1.2-2 mL CryoVials
Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope	Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts	22-00723-01	Discontinued
Penicillin-Streptomycin Strep	Gibco, Grand island, NY, USA	15140122	100 mL (10,000 U/mL)
Pipet aid XP	Drummond scientific Co., PA, USA	HDR-4-000-201
Pipetman Classic P1000	Gilson, Villiers le Bel, France	F123602	100-1000 µL
Refrigerant	Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan	CLN 540U	~-80 °C / Discontinued
Serological pipet	SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea	91010	10ml
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	12605010	cell dissociation protease