ヒト歯包からの上皮細胞の分離

要約

歯包は上皮集団および間葉細胞を含んでいる。上皮集団は、異なる培養培地を提供することにより異種の歯包細胞集団から選択した。上皮細胞は生き残り、無血清培地でコロニーを形成した。

要約

歯包(DF)は、口腔顎顔面外科医によって影響を受けた第3の臼歯の除去中に収穫された。上皮細胞分離はDF収穫の日に行った。DFをDPBSで3回洗浄し、組織がパルピーまたはスクイーズの一貫性を持つまで組織はさみで解剖した。単細胞集団は遠心分離によってペレット化し、ケラチノサイトを無血清培地で洗浄した。異種細胞集団は培養皿に分布した。ケラチノサイトは、上皮細胞を選択するために無血清培地を用いた。浮遊した破片または死細胞が観察されないまで、培養培地を毎日交換した。上皮細胞は、細胞集団分布後7〜10日以内に出現した。上皮細胞は無血清培地で生存し、α修飾最小必須培地は10%の胎児ウシ血清を添加し、間葉型細胞の増殖を可能にした。DFは、歯科上皮細胞の単離のための組織源である。

本研究の目的は、ヒトDFから上皮細胞を単離する方法を確立することであった。歯周靭帯(PDL)は、ヒトの歯の上皮細胞の単離に使用された。ヒトPDLから上皮細胞を調達することは、組織容積が小さいために必ずしも成功するとは限らず、低い数の上皮細胞を引き起こしうる。DF は PDL よりも大きなボリュームを持ち、セルが多い。DFは、ヒトの歯科上皮細胞の一次培養のための組織源であり得る。このプロトコルは、PDL を使用した分離方法よりも簡単かつ効率的です。ヒトの歯科上皮細胞を調達することは、歯科上皮間葉間葉相互作用のさらなる研究を促進するかもしれない。

概要

歯の形成は、口腔上皮1の開始。歯の発達段階によると、口腔上皮は、内および外側のエナメル質上皮、子宮頸管ループ、およびハートウィグの上皮根鞘(HERS)を含む異なる名前を有する。上皮コンパートメントは、周囲の間葉細胞と通信します。上皮間葉間葉間質相互作用は、歯の形成と組織再生を調節する。口腔角化細胞やヘルトウィグの上皮根鞘細胞(HERSC)などの歯科上皮細胞の調達は、歯科上皮間葉間葉相互作用の研究に不可欠です²。

げっ歯類由来の歯科上皮細胞は、HERSのような上皮構造から分離される。Liたちは、8日前齢のラット^から発達中の歯の細菌の頭蓋部分を収穫した後、ラット臼歯由来HERSCを単離し、不死化した。HERSは、拡大の下で円端組織から分離された。歯の発達段階と年齢を考えると、人間からHERSを収穫することは倫理的な問題のためにほとんど不可能です:発達中の歯の胚芽は、人間のHERSを収穫するために幼い子供から取り除く必要があります。未熟な歯の細菌はめったに抽出されません。ヒトの歯の上皮細胞は、歯肉および歯周靭帯(PDL)から単離することができる。上皮構造由来細胞は間葉系成分と共に歯形成に関与し、口腔角化細胞よりも上皮間葉間葉系の歯の研究に適している可能性がある。マラセゼス(ERM)の上皮細胞残りはHERS由来の上皮残骸であり、^PDL4に少数で存在する。研究は、^PDL5からのヒトHERSCの分離を報告します。しかし、PDL組織からヒトHERSCを採取することは、この場所の上皮集団の不足のために必ずしも成功するとは限らない^5,6。

齧歯類由来HERSCは血清含有培地^3,7に維持されるが、ヒトDF由来上皮細胞は、正常ヒト表皮角化細胞および正常ヒト経口角化細胞などの他のヒト上皮細胞と同様の無血清培地で培養される^8,9。これは、げっ歯類の歯科上皮細胞とヒトの歯科上皮細胞との間の生理学的または機能的な違いを意味する。歯の上皮間葉間質相互作用に関するメカニズムを理解することは、再植え付け時の歯周再付着、歯周病における歯周再生、パルプ-デンチン複合体再生、およびバイオトゥース生成を含む臨床応用の発展に寄与する可能性がある。翻訳研究の特徴を考慮すると、ヒトの歯科上皮細胞は、上皮間葉間葉相互作用の研究にげっ歯類の歯科上皮細胞よりも適切である可能性があります。

ヒトDFは緩い結合組織であり、しばしば影響を受けた歯に存在する。DFには間葉前駆体¹⁰が含まれています。しかし、我々の知る限りでは、2021年以前に上皮細胞が歯嚢から単離されたことは報告されていない。OhとYiは、20218年にヒトDFからの上皮細胞の単離を報告^した。上皮表現型は、ウェスタンブロッティングおよび形態解析によって確認された。DF由来上皮細胞の起源の分析は、他の研究と同様の結果を示した。DF由来の上皮細胞は内皮性も造血細胞でもない^5,11個であり、OhとYiはこれらの細胞をDF-HERSCと命名することを提案した。DFはPDLよりも大きな体積を有し、より多くの上皮細胞をDFから単離することができる。これは上皮コロニーの出現を増強し、DFから上皮細胞を収穫する際に高い成功率をもたらす。この研究は、歯科上皮細胞の単離のための組織源としてDFを使用することを示唆している。

本研究では、先に説明した手順^10,12に従って単一細胞をDFから単離した。DFには異種細胞集団が含まれ、いくつかの細胞型が手順の初期段階に存在する可能性がある。Morsczekたちは、DF由来間葉系幹細胞¹⁰を単離した。我々は、DFには上皮細胞が含まれ、上皮細胞だけが無血清状態で生き残ることができると仮定した。この研究は、上皮集団の選択と間葉系細胞の阻害の点でモルシェクらとは異なる。この選択は、上皮細胞増殖を可能にし、間葉系細胞増殖を阻害するケラチノサイト無血清培地(SFM)を用いて行った。この研究は、Ohと^Yi8のレポートに由来します。本研究の目的は、ヒトDFからの上皮細胞の単離に関する報告書で用いる方法の詳細を説明することであった。

プロトコル

この研究は、江東の慶平大学病院の機関審査委員会によって承認されました (IRB承認なし.KHNMC 2017-06-009)。

1. DF を収集する

注:患者は、成熟したまたは未熟な影響を受けた第三の臼歯の除去のために手術前にインフォームド・コンセントを与えました。糖尿病、高血圧、結核、肝炎、後天性免疫不全症候群を除いた患者。妊婦も除外された。

1. 影響を受けた第三大臼歯の外科的抽出中にDFを収穫する(図1A)。
   注:手術は顎顔面外科医によって行われました。組織の収集のために歯科医との協力が必要です。
2. 使用前に4 °Cで3%ペニシリンストレプトマイシンとダルベッコのリン酸緩衝生理食塩(DPBS)にDFを保存してください。DF収穫日に分離手順を実行します(図1B)。

2. DF から単一細胞集団を分離する

1. コラゲターゼタイプI型とプロテアーゼのストック溶液をDPBSで準備し、コラゲターゼタイプI型とプロテアーゼの最終濃度がそれぞれ1mg/mLと2.4mg/mLになるようにします。
2. チューブあたり20 mLのDPBSを用いた3本の50 mL洗浄チューブを用意します。チューブに 1、2、および 3 のラベルを付けます。
3. DFを洗い流しチューブで順次洗います。ピンセットでDFを保持し、チューブ1にDFを配置します。チューブ1からDFを取り出し、チューブ2に入れ。チューブ2からDFを取り出し、チューブ3に入れ。各チューブでDFを10~15回軽く振ります。3回洗浄した後、DFを60mm培養皿に入れます(図2A)。
4. DFをティッシュハサミでミンチする(図2B)。組織損失を最小限に抑えるために培養皿にほんの一部だけ移す。DFがパルピーまたはスクイーズな外観になるまで切断を繰り返します(図2C)。
5. コラゲアーゼタイプI型1mLとプロテアーゼ溶液1mLを15mL円錐管に混合し、それぞれ1mg/mLと2.4mg/mLの最終濃度を得る。
6. ステップ2.5から15 mL円錐形の管にひきずみDFを移します。37°Cでチューブを1時間軽く振ってインキュベートします。
7. 5 mLの 0.05% トリプシン-EDTAをチューブに加え、37°Cで15分間チューブを振ってインキュベートします。
8. ケラチノサイトSFM10%胎児ウシ血清(FBS)を含むケラチノサイト培地を調製する。ケラチノサイト培地を新しい50 mL円錐管に3 mL加えます。このチューブの上に40 μmのストレーナーを置き、10 mL血清ピペットを使用してステップ2.6から上清を吸引し、ストレーナーを通します。
   注:上清を服用しながら消化された組織残骸の組み込みを最小限に抑えます。40 μmのストレーナーで組織残骸を取り除き、故障を最小限に抑えます。組織残骸は70 μmのストレーナーを通過し、コロニー形成を妨げる可能性があります。角化細胞培地中のFBSは、酵素を不活性化する。
9. ステップ 2.7 と 2.8 を繰り返します。
10. 集めた懸濁液を15mLの円錐形チューブに移します。
11. 遠心分離288 で円 錐管を288 ×gで4°Cで3分間用いた。 上清を取り除く。
    注:ほとんど見えないペレットセルの偶発的な除去を避けるように注意してください。
12. ケラチノサイトSFMを3 mL加え、ステップ2.11のように遠心分離を伴う1mLピペットで細胞を2回洗浄します。
13. ケラチノサイトSFMを使用して、単一細胞集団を60mm培養皿にプレートします。37°Cで5%_CO2 の加湿雰囲気で5mLの最終容積で培養皿を維持します。 組織または細胞の破片が観察されないまで、培養培地を毎日変更する。
    注:培地を変更して、培養液中の浮遊破片を取り除きます。組織の破片または死細胞の遅延除去は、一次培養物に好ましくない影響を及ぼす。
14. ステップ2.13からプレートを調べて、上皮細胞の増殖を確認する(図3A)。
    注:上皮細胞は、単一細胞集団をめっきしてから7〜10日以内に増殖する。
15. 上皮コロニーを拡大し、細胞をサブ培養します。
    1. 培地を吸引し、培養プレートの底部をケラチノサイトSFMの3mLで1回洗浄する。
    2. 2 mLの細胞解離プロテアーゼを加え、37°Cで5%_CO2 の加湿雰囲気で3分間インキュベートします。
       メモ:セルの取り外しが有効でない場合は、ステップ2.15.2を繰り返します。
    3. 培養プレートにケラチノサイト培地を2mL添加し、15mL円錐管に内容物を移す。
       注: ステップ 2.15.2 を繰り返す場合、ケラチノサイト培地の追加は不要です。
    4. 遠心分離288× g で4°Cで3分間円錐形チューブ。
    5. 上清を取り除き、細胞ペレットを3mLの角化細胞SFMで2回洗浄します。
    6. ケラチノサイトSFM(100mm皿あたり10mLの最終容積)を使用して、細胞を100mm培養皿に入れます。
16. 液体窒素タンクにセルストックを準備して保管します。
    1. ステップ 2.15.1-2.15.5 で説明されているように細胞を収穫する。
    2. 凍結培地(80%角化細胞SFM、10%ジメチルスルホキシド、10%FBS)で細胞を1mLの凍結に分配する。
    3. バイアルを冷凍容器に入れ、-80°Cで24時間保管します。
    4. 深い冷凍庫から液体窒素タンクにバイアルを移します。

結果

DFハーベスティング
手術は顎顔面外科医によって行われた。人由来の物質は、歯片、歯肉組織、およびDFを含む、外科医によって収集された(図1A)。DFは、歯の断片に取り付けられている可能性があります。口腔顎顔面外科医はDFを識別することができる。組織の収集には、外科医との協力とコミュニケーションが必要です。DFは不規則な形の膜状組織であ?...

ディスカッション

このプロトコルには、重要な手順が含まれています。単一細胞集団の収穫は、DFからの上皮細胞の正常な分離のために不可欠である。我々は、DFに上皮細胞が多いという仮説に基づいて、DFから上皮細胞を単離しようとした。切り取り手順は、DFからの細胞の剥離および放出を増強する。このミンチの手順が改善され、単一細胞の放出を容易にするためにDFがパルピーが現れるまで繰り返した。...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol	EMD millipore Co., MA, USA	1096341011	1 L
0.05% trypsin-EDTA	Gibco, Grand island, NY, USA	25300054	100 mL
40 μm cell strainer	Falcon, NC, USA	352340
Cell culture dish (100 x 20 mm)	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	172958	Discontinued
Cell culture dish (60 x 15 mm)	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	150326
Collagenase type 1	Gibco, Grand island, NY, USA	17100017	1 g
Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge	Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea	CB-514R
Conical tube	SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea	50015 50050	15 mL 50 mL
Cryogenic vial	Corning Inc., NY, US	430488	2 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Missouri, US	D2650-100ml	100 mL
Dispase	Gibco, Grand island, NY, USA	17105041	1 g
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea	LB 001-02	500 mL
Fetal bovine serum	Gibco, Grand island, NY, USA	16000044	500 mL
Heraeus BB 15 / CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	51023121
Keratinocyte serum-free medium	Gibco, Grand island, NY, USA	10724-011	500 mL
MVE CryoSystem 2000	MVE Biological Solutions Co., GA, USA	CryoSystem 2000
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	5100-0001	for 1.2-2 mL CryoVials
Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope	Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts	22-00723-01	Discontinued
Penicillin-Streptomycin Strep	Gibco, Grand island, NY, USA	15140122	100 mL (10,000 U/mL)
Pipet aid XP	Drummond scientific Co., PA, USA	HDR-4-000-201
Pipetman Classic P1000	Gilson, Villiers le Bel, France	F123602	100-1000 µL
Refrigerant	Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan	CLN 540U	~-80 °C / Discontinued
Serological pipet	SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea	91010	10ml
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	12605010	cell dissociation protease