Isolement des cellules épithéliales du follicule dentaire humain

Résumé

Le follicule dentaire contient une population épithéliale et des cellules mésenchymateuses. La population épithéliale a été sélectionnée parmi la population hétérogène de cellules folliculaires dentaires en fournissant un milieu de culture distinct. Les cellules épithéliales ont survécu et ont formé des colonies dans un milieu sans sérum.

Résumé

Le follicule dentaire (DF) a été prélevé lors de l’ablation d’une troisième molaire impactée par un chirurgien maxillo-facial buccal. L’isolement des cellules épithéliales a été effectué le jour de la récolte de DF. Le DF a été lavé trois fois avec du DPBS, puis disséqué avec des ciseaux à tissu jusqu’à ce que le tissu ait une consistance pulpeuse ou squishy. Les populations unicellulaires ont été granulées par centrifugation et lavées avec un milieu sans sérum de kératinocytes. Des populations cellulaires hétérogènes ont été distribuées dans une boîte de culture. Un milieu sans sérum de kératinocytes a été utilisé pour sélectionner les cellules épithéliales. Le milieu de culture a été modifié quotidiennement jusqu’à ce qu’aucun débris flottant ou cellules mortes n’ait été observé. Les cellules épithéliales sont apparues dans les 7 à 10 jours suivant la distribution de la population cellulaire. Les cellules épithéliales ont survécu dans un milieu sans sérum, tandis que le milieu essentiel minimal α-modification complété par 10% de sérum bovin fœtal a permis la prolifération de cellules de type mésenchymateux. Le DF est une source tissulaire pour l’isolement des cellules épithéliales dentaires.

Le but de cette étude était d’établir une méthode pour l’isolement des cellules épithéliales de la DF humaine. Le ligament parodontal (PDL) a été utilisé pour l’isolement des cellules épithéliales dentaires humaines. L’obtention de cellules épithéliales à partir de PDL humaine n’est pas toujours efficace en raison du petit volume de tissu, ce qui entraîne un faible nombre de cellules épithéliales. DF a un volume plus grand que PDL et contient plus de cellules. Le DF peut être une source tissulaire pour la culture primaire de cellules épithéliales dentaires humaines. Ce protocole est plus facile et plus efficace que la méthode d’isolement utilisant PDL. L’obtention de cellules épithéliales dentaires humaines peut faciliter d’autres études sur les interactions épithéliales-mésenchymateuses dentaires.

Introduction

La formation des dents commence par l’invagination de l’épithélium ^buccal1. Selon le stade de développement de la dent, l’épithélium buccal a différents noms, y compris l’épithélium de l’émail interne et externe, l’anse cervicale et la gaine de la racine épithéliale de Hertwig (HERS). Les compartiments épithéliaux communiquent avec les cellules mésenchymateuses environnantes. Les interactions épithéliales-mésenchymateuses régulent la formation des dents et la régénération des tissus. L’obtention de cellules épithéliales dentaires, telles que les kératinocytes oraux et les cellules de la gaine de la racine épithéliale de Hertwig (HERSC), est cruciale pour l’étude des interactions épithéliales-mésenchymateuses ^dentaires2.

Les cellules épithéliales dentaires dérivées de rongeurs sont isolées de la structure épithéliale, comme le HERS. Li et ses collègues ont isolé et immortalisé des HERSC dérivés de molaires de rat après avoir récolté la partie apicale des germes dentaires en développement de rats âgés de 8 ^jours3. Le HERS a été séparé du tissu apical sous grossissement. Compte tenu du stade de développement et de l’âge des dents, il est presque impossible de prélever le HERS sur les humains en raison de problèmes éthiques: un germe dentaire en développement doit être retiré d’un jeune enfant pour récolter le HERS humain. Les germes dentaires immatures sont rarement extraits. Les cellules épithéliales dentaires humaines peuvent être isolées de la gencive et du ligament parodontal (PDL). Les cellules dérivées de la structure épithéliale participent à la formation des dents avec des composants mésenchymateux et pourraient être plus appropriées pour l’étude des interactions épithéliales-mésenchymateuses dentaires que les kératinocytes oraux. Les restes épithéliaux de Malassez (ERM) sont des restes épithéliaux dérivés de HERS et résident en petit nombre dans le ^PDL4. Des études font état de l’isolement des HERSC humains de ^PDL5. Cependant, la récolte de HERSC humains à partir de tissu PDL n’est pas toujours couronnée de succès en raison de la rareté de la population épithéliale à cet ^endroit5,6.

Bien que les HERSC dérivés de rongeurs soient maintenus dans des milieux contenant du ^sérum3,7, les cellules épithéliales humaines dérivées du DF sont cultivées avec des milieux sans sérum similaires à d’autres cellules épithéliales humaines, telles que les kératinocytes épidermiques humains normaux et les kératinocytes oraux humains ^normaux8,9. Cela implique des différences physiologiques ou fonctionnelles entre les cellules épithéliales dentaires des rongeurs et les cellules épithéliales dentaires humaines. La compréhension du mécanisme concernant les interactions épithéliales-mésenchymateuses dentaires pourrait contribuer au développement d’applications cliniques, y compris la réattachement parodontal pendant la replantation, la régénération parodontale dans les maladies parodontales, la régénération du complexe pulpe-dentine et la génération de bio-dent. Compte tenu des caractéristiques de la recherche translationnelle, les cellules épithéliales dentaires humaines peuvent être plus appropriées que les cellules épithéliales dentaires de rongeurs pour l’étude des interactions épithéliales-mésenchymateuses.

Le DF humain est un tissu conjonctif lâche et réside souvent dans une dent touchée. Le DF contient des précurseurs mésenchymateux10. Cependant, à notre connaissance, aucune étude n’a rapporté l’isolement des cellules épithéliales des follicules dentaires avant 2021. Oh et Yi ont rapporté l’isolement des cellules épithéliales de la DF humaine en 20218. Le phénotype épithélial a été confirmé par transfert occidental et analyse morphologique. L’analyse de l’origine des cellules épithéliales dérivées du DF a montré des résultats similaires avec d’autres études. Les cellules épithéliales dérivées du DF n’étaient ni endothéliales ni hématopoïétiques5,11, et Oh et Yi ont suggéré de nommer ces cellules comme DF-HERSC. Le DF a un volume plus important que le PDL, et plus de cellules épithéliales peuvent être isolées du DF. Cela favorise l’émergence de colonies épithéliales et se traduit par un taux de réussite élevé dans la récolte des cellules épithéliales à partir de DF. Cette étude suggère d’utiliser le DF comme source tissulaire pour l’isolement des cellules épithéliales dentaires.

Dans la présente étude, des cellules individuelles ont été isolées du DF selon les procédures décrites ^{précédemment10,12}. Le DF contient des populations cellulaires hétérogènes, et plusieurs types de cellules pourraient être présents au début de la procédure. Morsczek et ses collègues ont isolé des cellules souches mésenchymateuses dérivées du ^DF10. Nous avons émis l’hypothèse que le DF contient des cellules épithéliales et que seules les cellules épithéliales peuvent survivre dans des conditions sans sérum. Cette étude diffère de celle de Morsczek et al. en termes de sélection de la population épithéliale et d’inhibition des cellules mésenchymateuses. La sélection a été réalisée à l’aide de milieux sans sérum kératinocytes (SFM), qui permettent la prolifération des cellules épithéliales et inhibent la prolifération des cellules mésenchymateuses. Cette étude provient d’un rapport de Oh et ^Yi8. L’objectif de cette étude était de décrire les détails de la méthode utilisée dans ce rapport pour isoler les cellules épithéliales de la DF humaine.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité d’examen institutionnel de l’hôpital universitaire Kyung Hee de Gangdong (approbation de la CISR no. KHNMC 2017-06-009).

1. Collecter DF

REMARQUE: Les patients ont donné leur consentement éclairé avant la chirurgie pour l’ablation d’une troisième molaire touchée mature ou immature. Les patients atteints de la maladie suivante ont été exclus: diabète, hypertension, tuberculose, hépatite, syndrome d’immunodéficience acquise. Les femmes enceintes ont également été exclues.

1. Récolter le DF lors de l’extraction chirurgicale des troisièmes molaires touchées (Figure 1A).
   REMARQUE: La chirurgie a été effectuée par un chirurgien maxillo-facial buccal. Une coopération est nécessaire avec un dentiste pour la collecte de tissus.
2. Conserver le DF dans la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco avec 3 % de pénicilline-streptomycine à 4 °C avant utilisation. Effectuer des procédures d’isolement le jour de la récolte du DF (Figure 1B).

2. Isoler les populations unicellulaires de DF

1. Préparer des solutions mères de collagénase de type I et de protéase dans du DPBS de sorte que les concentrations finales de collagénase de type I et de protéase soient respectivement de 1 mg/mL et de 2,4 mg/mL.
2. Préparez trois tubes de lavage de 50 mL avec 20 mL de DPBS par tube. Étiquetez les tubes comme 1, 2 et 3.
3. Lavez le DF dans les tubes de lavage séquentiellement. Tenez le DF avec une pince à épiler et placez le DF dans le tube 1. Sortez le DF du tube 1 et placez-le dans le tube 2. Sortez le DF du tube 2 et placez-le dans le tube 3. Agiter doucement DF 10-15 fois dans chaque tube. Après trois lavages, placez le DF dans une boîte de culture de 60 mm (Figure 2A).
4. Hachez le DF avec des ciseaux à tissu (Figure 2B). Ne transférez qu’une petite partie dans le plat de culture pour minimiser la perte de tissu. Répétez la coupe jusqu’à ce que le DF ait un aspect pulpeux ou squishy (Figure 2C).
5. Mélanger 1 mL de collagénase de type I et 1 mL de solution de protéase dans un tube conique de 15 mL pour obtenir des concentrations finales de 1 mg/mL et 2,4 mg/mL, respectivement.
6. Transférer le DF haché dans le tube conique de 15 mL à partir de l’étape 2.5. Agiter doucement et incuber le tube pendant 1 h à 37 °C.
7. Ajouter 5 mL de 0,05 % de trypsine-EDTA dans le tube, agiter et incuber le tube pendant 15 min à 37 °C.
8. Préparer un milieu kératinocyte contenant du Kératinocyte SFM 10% de sérum fœtal bovin (FBS). Ajouter 3 mL de milieu kératinocyte dans un nouveau tube conique de 50 mL. Placez une passoire de 40 μm sur le dessus de ce tube et utilisez une pipette sérologique de 10 mL pour aspirer le surnageant de l’étape 2.6 et le faire passer à travers la passoire.
   REMARQUE: Minimiser l’incorporation des restes de tissu digérés pendant la prise du surnageant. Retirez les restes de tissu avec une passoire de 40 μm pour minimiser la défaillance. Les restes tissulaires peuvent passer à travers des passoires de 70 μm et entraver la formation de colonies. FBS dans le milieu kératinocytes va inactiver les enzymes.
9. Répétez les étapes 2.7 et 2.8.
10. Transférer la suspension collectée dans un tube conique de 15 mL.
11. Centrifuger le tube conique de 15 mL à 288 × g pendant 3 min à 4 °C. Retirez le surnageant.
    REMARQUE: Veillez à éviter tout retrait accidentel des cellules granulées, qui sont pour la plupart invisibles.
12. Ajouter 3 mL de MFM kératinocytes et laver les cellules deux fois avec une pipette de 1 mL avec centrifugation comme à l’étape 2.11.
13. Plaquer la population unicellulaire dans une boîte de culture de 60 mm à l’aide de SFM kératinocytes. Maintenir la boîte de culture avec un volume final de 5 mL dans une atmosphère humidifiée de 5% de _CO2 à 37 °C. Changer le milieu de culture quotidiennement jusqu’à ce qu’aucun débris tissulaire ou cellulaire ne soit observé.
    REMARQUE: Enlevez les débris flottants dans le milieu de culture en changeant le milieu. L’élimination tardive des débris tissulaires ou des cellules mortes a un effet défavorable sur la culture primaire.
14. Examinez la plaque à partir de l’étape 2.13 pour vérifier la croissance des cellules épithéliales (Figure 3A).
    REMARQUE: Les cellules épithéliales se développent dans les 7 à 10 jours suivant le placage des populations unicellulaires.
15. Développer les colonies épithéliales et sous-cultiver les cellules.
    1. Aspirer le milieu et laver le fond de la plaque de culture une fois avec 3 mL de MDF kératinocytes.
    2. Ajouter 2 mL de protéase de dissociation cellulaire et incuber dans une atmosphère humidifiée de 5% de _CO2 à 37 °C pendant 3 min.
       REMARQUE : Répétez l’étape 2.15.2 si le détachement de cellule n’est pas efficace.
    3. Ajouter 2 mL de milieu kératinocyte à la plaque de culture et transférer le contenu dans un tube conique de 15 mL.
       REMARQUE: L’ajout de plus de milieu kératinocyte n’est pas nécessaire si l’étape 2.15.2 est répétée.
    4. Centrifuger le tube conique de 15 mL à 288 × g pendant 3 min à 4 °C.
    5. Retirez le surnageant et lavez la pastille cellulaire deux fois avec 3 mL de MDF kératinocyte.
    6. Plaquer les cellules dans une boîte de culture de 100 mm à l’aide de SFM kératinocytes (volume final de 10 mL par boîte de 100 mm).
16. Préparez et stockez les stocks de cellules dans un réservoir d’azote liquide.
    1. Récolter les cellules comme décrit aux étapes 2.15.1 à 2.15.5.
    2. Distribuer les cellules en cryoviales dans 1 mL de milieu de congélation (80% de SFM de kératinocytes, 10% de diméthylsulfoxyde, 10% de FBS).
    3. Placer les flacons dans un récipient congelé et les conserver à -80 °C pendant 24 h.
    4. Transférer les flacons du congélateur dans un réservoir d’azote liquide.

Résultats

Récolte de DF
La chirurgie a été réalisée par un chirurgien maxillo-facial buccal. Les matériaux d’origine humaine, y compris le fragment de dent, le tissu gingival et le DF, ont été recueillis par un chirurgien (Figure 1A). Le DF peut être attaché au fragment de dent. Un chirurgien maxillo-facial buccal sera en mesure d’identifier le DF. La coopération et la communication avec le chirurgien sont nécessaires pour la collecte de tissus. Le DF est un tissu m...

Discussion

Ce protocole comprend des étapes critiques. La récolte de populations unicellulaires est essentielle à l’isolement réussi des cellules épithéliales de la DF. Nous avons cherché à isoler les cellules épithéliales du DF en nous basant sur notre hypothèse qu’il y a plus de cellules épithéliales dans le DF. La procédure de hachage améliore le détachement et la libération des cellules du DF. La procédure de hachage a été améliorée et le hachage a été répété jusqu’à ce que le DF apparaisse pul...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol	EMD millipore Co., MA, USA	1096341011	1 L
0.05% trypsin-EDTA	Gibco, Grand island, NY, USA	25300054	100 mL
40 μm cell strainer	Falcon, NC, USA	352340
Cell culture dish (100 x 20 mm)	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	172958	Discontinued
Cell culture dish (60 x 15 mm)	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	150326
Collagenase type 1	Gibco, Grand island, NY, USA	17100017	1 g
Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge	Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea	CB-514R
Conical tube	SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea	50015 50050	15 mL 50 mL
Cryogenic vial	Corning Inc., NY, US	430488	2 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Missouri, US	D2650-100ml	100 mL
Dispase	Gibco, Grand island, NY, USA	17105041	1 g
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea	LB 001-02	500 mL
Fetal bovine serum	Gibco, Grand island, NY, USA	16000044	500 mL
Heraeus BB 15 / CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	51023121
Keratinocyte serum-free medium	Gibco, Grand island, NY, USA	10724-011	500 mL
MVE CryoSystem 2000	MVE Biological Solutions Co., GA, USA	CryoSystem 2000
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	5100-0001	for 1.2-2 mL CryoVials
Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope	Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts	22-00723-01	Discontinued
Penicillin-Streptomycin Strep	Gibco, Grand island, NY, USA	15140122	100 mL (10,000 U/mL)
Pipet aid XP	Drummond scientific Co., PA, USA	HDR-4-000-201
Pipetman Classic P1000	Gilson, Villiers le Bel, France	F123602	100-1000 µL
Refrigerant	Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan	CLN 540U	~-80 °C / Discontinued
Serological pipet	SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea	91010	10ml
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	12605010	cell dissociation protease