Isolamento de Células Epiteliais do Folículo Dental Humano

Resumo

O folículo dentário contém uma população epitelial e células mesenquimais. A população epitelial foi selecionada da população heterogênea de folículos dentário, proporcionando um meio de cultura distinto. As células epiteliais sobreviveram e formaram colônias em um meio livre de soro.

Resumo

O folículo dentário (DF) foi colhido durante a remoção de um terceiro molar impactado por um cirurgião maxilofacial oral. O isolamento das células epiteliais foi realizado no dia da colheita do DF. O DF foi lavado três vezes com DPBS e depois dissecado com tesoura de tecido até que o tecido tivesse uma consistência polpa ou macia. Populações unicelulares foram pelotadas por centrifugação e lavadas com meio sem soro de queratinócito. Populações de células heterogêneas foram distribuídas em um prato de cultura. O meio sem soro de queratinócito foi usado para selecionar as células epiteliais. O meio cultural foi alterado diariamente até que não foram observados detritos flutuantes ou células mortas. As células epiteliais apareceram entre 7 e 10 dias após a distribuição da população celular. As células epiteliais sobreviveram em meio livre de soro, enquanto α meio essencial mínimo complementado com soro bovino fetal de 10% permitiu a proliferação de células do tipo mesenquimal. O DF é uma fonte tecidual para o isolamento de células epiteliais dentárias.

O objetivo deste estudo foi estabelecer um método para o isolamento das células epiteliais do DF humano. O ligamento periodontal (PDL) foi utilizado para o isolamento de células epiteliais dentárias humanas. A aquisição de células epiteliais de PDL humano nem sempre é bem sucedida devido ao pequeno volume tecidual, levando a um baixo número de células epiteliais. O DF tem um volume maior que o PDL e contém mais células. O DF pode ser uma fonte tecidual para a cultura primária das células epiteliais dentárias humanas. Este protocolo é mais fácil e eficiente do que o método de isolamento usando PDL. A aquisição de células epiteliais dentárias humanas pode facilitar estudos adicionais de interações epiteliais-mesenquimais dentárias.

Introdução

A formação dentária começa com a invaginação do epitélio ^oral1. De acordo com o estágio de desenvolvimento dentário, o epitélio oral tem nomes diferentes, incluindo epitélio de esmalte interno e externo, laço cervical e bainha de raiz epitelial de Hertwig (HERS). Os compartimentos epiteliais se comunicam com as células mesenquimais circundantes. Interações epiteliais-mesenquimais regulam a formação dentária e a regeneração tecidual. A aquisição de células epiteliais dentárias, como os queratinócitos orais e as células da baia de raiz epitelial de Hertwig (HERSCs), é crucial para o estudo das interações epiteliais-mesenquimais dentárias2.

As células epiteliais dentárias derivadas de roedores são isoladas da estrutura epitelial, como o HERS. Li e colegas isolaram e imortalizaram HERSCs derivados do molar de rato após a colheita da porção apical dos germes dentários em desenvolvimento de ratos de 8 dias de ^idade3. O HERS foi separado do tecido apical sob ampliação. Considerando o estágio e a idade do desenvolvimento dentário, a colheita do HERS de humanos é quase impossível por causa de questões éticas: um germe dentário em desenvolvimento precisa ser removido de uma criança para colher o HERS humano. Germes dentários imaturos raramente são extraídos. As células epiteliais dentárias humanas podem ser isoladas do ligamento gengiva e periodontal (PDL). As células derivadas da estrutura epitelial participam da formação dentária juntamente com componentes mesenquimais e podem ser mais adequadas para o estudo de interações epiteliais-mesenquimais dentárias do que queratinócitos orais. As células epiteliais de Malassez (ERM) são remanescentes epiteliais derivados do HERS e residem em pequenos números no ^PDL4. Estudos relatam o isolamento de HERSCs humanos do ^PDL5. No entanto, a colheita de HERSCs humanos a partir de tecido PDL nem sempre é bem sucedida devido à escassez da população epitelial neste ^local5,6.

Embora os HERSCs derivados de roedores sejam mantidos em mídias contendo ^soro3,7, as células epiteliais derivadas do DF são cultivadas com mídia livre de soro semelhante a outras células epiteliais humanas, como queratinócitos epidérmicos normais e queratinócitos orais humanos ^normais8,9. Isso implica diferenças fisiológicas ou funcionais entre células epiteliais dentárias de roedores e células epiteliais dentárias humanas. A compreensão do mecanismo relativo às interações epiteliais-mesenquimais dentárias pode contribuir para o desenvolvimento de aplicações clínicas, incluindo recolocação periodontal durante replantação, regeneração periodontal em doença periodontal, regeneração complexa de celulose e geração biodestina. Considerando as características da pesquisa translacional, as células epiteliais dentárias humanas podem ser mais apropriadas do que as células epiteliais de roedores para o estudo de interações epiteliais-mesenquimais.

O DF humano é um tecido conjuntivo solto e muitas vezes reside em um dente impactado. O DF contém precursores ^{mesenquimais10}. No entanto, até onde sabemos, nenhum estudo relatou o isolamento de células epiteliais de folículos dentários antes de 2021. Oh e Yi relataram o isolamento das células epiteliais do DF humano em 20218. O fenótipo epitelial foi confirmado por manchas ocidentais e análise morfológica. A análise da origem das células epiteliais derivadas do DF demonstrou resultados semelhantes com outros estudos. As células epiteliais derivadas do DF não eram nem endoteliais nem hematopoiéticas5,11, e Oh e Yi sugeriram nomear essas células como DF-HERSCs. O DF tem um volume maior que o PDL, e mais células epiteliais podem ser isoladas do DF. Isso aumenta o surgimento de colônias epiteliais e resulta em uma alta taxa de sucesso na colheita de células epiteliais do DF. Este estudo sugere o uso do DF como fonte tecidual para o isolamento de células epiteliais dentárias.

No presente estudo, as células únicas foram isoladas do DF de acordo com os procedimentos descritos ^{anteriormente10,12}. O DF contém populações de células heterogêneas, e vários tipos de células podem estar presentes na fase inicial do procedimento. Morsczek e colegas isolaram células-tronco mesenquimais derivadas do ^DF10. Nós imaginamos que o DF contém células epiteliais e que apenas células epiteliais podem sobreviver sob condições livres de soro. Este estudo difere do de Morsczek et al. em termos da seleção da população epitelial e da inibição das células mesenquimais. A seleção foi realizada utilizando-se uma mídia sem soro de queratinócito (SFM), que permite a proliferação de células epiteliais e inibe a proliferação de células mesenquimais. Este estudo teve origem em um relatório de Oh e ^Yi8. O objetivo deste estudo foi descrever detalhes do método utilizado nesse relatório para o isolamento de células epiteliais do DF humano.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Hospital Universitário Kyung Hee em Gangdong (aprovação do IRB nº. KHNMC 2017-06-009).

1. Recolher DF

NOTA: Os pacientes deram consentimento informado antes da cirurgia para a remoção de um terceiro molar maduro ou imaturo impactado. Foram excluídos pacientes com a seguinte doença: diabetes, hipertensão, tuberculose, hepatite, síndrome da imunodeficiência adquirida. As gestantes também foram excluídas.

1. Colheita DF durante a extração cirúrgica de terceiro molares impactados (Figura 1A).
   NOTA: A cirurgia foi realizada por um cirurgião maxilofacial oral. A cooperação é necessária com um dentista para coleta de tecidos.
2. Armazene DF na solução salina tamponada de fosfato (DPBS) de Dulbecco com 3% de penicilina-estreptomicina a 4 °C antes do uso. Realizar procedimentos de isolamento no dia da colheita do DF (Figura 1B).

2. Isole populações unicelulares do DF

1. Prepare as soluções de estoque de colagenase tipo I e protease em DPBS para que as concentrações finais de colagenase tipo I e protease sejam de 1 mg/mL e 2,4 mg/mL, respectivamente.
2. Prepare três tubos de lavagem de 50 mL com 20 mL de DPBS por tubo. Rotule os tubos como 1, 2 e 3.
3. Lave o DF nos tubos de lavagem sequencialmente. Segure o DF com pinças e coloque o DF no tubo 1. Tire o DF do tubo 1 e coloque-o no tubo 2. Tire o DF do tubo 2 e coloque-o no tubo 3. Agite suavemente o DF 10-15 vezes em cada tubo. Depois de lavar três vezes, coloque o DF em um prato de cultura de 60 mm (Figura 2A).
4. Pique o DF com tesoura de tecido (Figura 2B). Transfira apenas uma pequena porção para o prato de cultura para minimizar a perda de tecido. Repita o corte até que o DF tenha uma aparência polpírica ou macia (Figura 2C).
5. Misture 1 mL de colagenase tipo I e 1 mL de solução protease em um tubo cônico de 15 mL para obter concentrações finais de 1 mg/mL e 2,4 mg/mL, respectivamente.
6. Transfira o DF picado para o tubo cônico de 15 mL a partir da etapa 2.5. Agite suavemente e incubar o tubo por 1h a 37 °C.
7. Adicione 5 mL de 0,05% trypsin-EDTA ao tubo, agite e incuba o tubo por 15 min a 37 °C.
8. Prepare o meio queratinócito contendo queratinócito SFM 10% de soro bovino fetal (FBS). Adicione 3 mL de meio de queratinócito em um novo tubo cônico de 50 mL. Coloque um coador de 40 μm em cima deste tubo e use uma pipeta sorológica de 10 mL para aspirar o supernatante a partir do passo 2.6 e passá-lo através do coador.
   NOTA: Minimizar a incorporação de restos de tecido digerido ao tomar o supernante. Remova os restos de tecido com um coador de 40 μm para minimizar a falha. Os restos de tecido podem passar por 70 μm de coador e dificultar a formação de colônias. FBS no meio queratinócito inativará as enzimas.
9. Repita as etapas 2.7 e 2.8.
10. Transfira a suspensão coletada para um tubo cônico de 15 mL.
11. Centrifugar o tubo cônico de 15 mL a 288 × g por 3 min a 4 °C. Remova o supernatante.
    NOTA: Tenha cuidado para evitar qualquer remoção acidental de células pelleted, que são em sua maioria invisíveis.
12. Adicione 3 mL de queratinócito SFM e lave as células duas vezes com uma pipeta de 1 mL com centrifugação como na etapa 2.11.
13. Emplaque a população unicelular em um prato de cultura de 60 mm usando queratinócito SFM. Mantenha o prato de cultura com um volume final de 5 mL em uma atmosfera umidificada de 5% de _CO2 a 37 °C. Mude o meio de cultura diariamente até que nenhum tecido ou detritos celulares sejam observados.
    NOTA: Remova detritos flutuantes no meio de cultura alterando o meio. A remoção retardada de detritos teciduais ou células mortas tem um efeito desfavorável na cultura primária.
14. Examine a placa da etapa 2.13 para verificar o crescimento das células epiteliais (Figura 3A).
    NOTA: As células epiteliais crescem entre 7 e 10 dias após o revestimento de populações unicelulares.
15. Expanda as colônias epiteliais e subcultura as células.
    1. Aspire o meio e lave o fundo da placa de cultura uma vez com 3 mL de queratinócito SFM.
    2. Adicione 2 mL de protease de dissociação celular e incuba em uma atmosfera umidificada de 5% de _CO2 a 37 °C por 3 min.
       NOTA: Repita o passo 2.15.2 se o destacamento celular não for eficaz.
    3. Adicione 2 mL de meio queratincyte à placa de cultura e transfira o conteúdo em um tubo cônico de 15 mL.
       NOTA: A adição de mais meio de queratinócito não é necessária se a etapa 2.15.2 for repetida.
    4. Centrifugar o tubo cônico de 15 mL a 288 × g por 3 min a 4 °C.
    5. Remova o supernatário e lave a pelota celular duas vezes com 3 mL de queratinócito SFM.
    6. Emplaque as células em um prato de cultura de 100 mm usando queratinócito SFM (volume final de 10 mL por prato de 100 mm).
16. Prepare e armazene estoques de células em um tanque de nitrogênio líquido.
    1. Células colhidas descritas nas etapas 2.15.1-2.15.5.
    2. Distribua as células em criovias em 1 mL de meio de congelamento (80% de queratinócito SFM, 10% dimetilsulfoxida, 10% FBS).
    3. Coloque os frascos em um recipiente de congelamento e armazene-os a -80 °C por 24 h.
    4. Transfira os frascos do congelador profundo para um tanque de nitrogênio líquido.

Resultados

Colheita do DF
A cirurgia foi realizada por um cirurgião maxilofacial oral. Materiais derivados do homem, incluindo o fragmento dentário, tecido gengival e DF, foram coletados por um cirurgião (Figura 1A). O DF pode estar preso ao fragmento de dente. Um cirurgião maxilofacial oral será capaz de identificar o DF. A cooperação e a comunicação com o cirurgião são necessárias para a coleta de tecidos. O DF é um tecido de membrana em forma irregular. O tecido geng...

Discussão

Este protocolo inclui etapas críticas. A colheita de populações unicelulares é essencial para o isolamento bem sucedido das células epiteliais do DF. Procuramos isolar células epiteliais do DF com base em nossa hipótese de que há mais células epiteliais no DF. O procedimento de picar aumenta o desprendimento e a liberação de células do DF. O procedimento de picar foi melhorado, e o picar se repetiu até que o DF apareceu polpa para facilitar a liberação de células únicas. A obtenção do número máximo d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol	EMD millipore Co., MA, USA	1096341011	1 L
0.05% trypsin-EDTA	Gibco, Grand island, NY, USA	25300054	100 mL
40 μm cell strainer	Falcon, NC, USA	352340
Cell culture dish (100 x 20 mm)	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	172958	Discontinued
Cell culture dish (60 x 15 mm)	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	150326
Collagenase type 1	Gibco, Grand island, NY, USA	17100017	1 g
Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge	Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea	CB-514R
Conical tube	SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea	50015 50050	15 mL 50 mL
Cryogenic vial	Corning Inc., NY, US	430488	2 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Missouri, US	D2650-100ml	100 mL
Dispase	Gibco, Grand island, NY, USA	17105041	1 g
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea	LB 001-02	500 mL
Fetal bovine serum	Gibco, Grand island, NY, USA	16000044	500 mL
Heraeus BB 15 / CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	51023121
Keratinocyte serum-free medium	Gibco, Grand island, NY, USA	10724-011	500 mL
MVE CryoSystem 2000	MVE Biological Solutions Co., GA, USA	CryoSystem 2000
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	5100-0001	for 1.2-2 mL CryoVials
Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope	Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts	22-00723-01	Discontinued
Penicillin-Streptomycin Strep	Gibco, Grand island, NY, USA	15140122	100 mL (10,000 U/mL)
Pipet aid XP	Drummond scientific Co., PA, USA	HDR-4-000-201
Pipetman Classic P1000	Gilson, Villiers le Bel, France	F123602	100-1000 µL
Refrigerant	Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan	CLN 540U	~-80 °C / Discontinued
Serological pipet	SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea	91010	10ml
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	12605010	cell dissociation protease