Isolierung von Epithelzellen aus dem menschlichen Zahnfollikel

Zusammenfassung

Der Dentalfollikel enthält eine Epithelpopulation und mesenchymale Zellen. Die Epithelpopulation wurde aus der heterogenen Dentalfollikelzellpopulation ausgewählt, indem ein bestimmtes Kulturmedium bereitgestellt wurde. Epithelzellen überlebten und bildeten Kolonien in einem serumfreien Medium.

Zusammenfassung

Der Zahnfollikel (DF) wurde bei der Entfernung eines betroffenen dritten Backenzahns durch einen Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgen geerntet. Die Isolierung der Epithelzellen wurde am Tag der DF-Ernte durchgeführt. Das DF wurde dreimal mit DPBS gewaschen und dann mit einer Gewebeschere seziert, bis das Gewebe eine breiige oder matschige Konsistenz aufwies. Einzelzellpopulationen wurden durch Zentrifugation pelletiert und mit keratinozyten-serumfreiem Medium gewaschen. Heterogene Zellpopulationen wurden in einer Kulturschale verteilt. Keratinozyten-serumfreies Medium wurde verwendet, um die Epithelzellen auszuwählen. Das Kulturmedium wurde täglich gewechselt, bis keine schwimmenden Trümmer oder toten Zellen mehr beobachtet wurden. Epithelzellen erschienen innerhalb von 7-10 Tagen nach der Zellpopulationsverteilung. Epithelzellen überlebten in serumfreiem Medium, während α minimales essentielles Medium mit minimaler Modifikation, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, die Proliferation von mesenchymalen Zellen ermöglichte. Das DF ist eine Gewebequelle zur Isolierung von Zahnepithelzellen.

Der Zweck dieser Studie war es, eine Methode zur Isolierung von Epithelzellen aus menschlicher DF zu etablieren. Das Parodontalband (PDL) wurde zur Isolierung menschlicher Zahnepithelzellen verwendet. Die Beschaffung von Epithelzellen aus menschlicher PDL ist aufgrund des geringen Gewebevolumens nicht immer erfolgreich, was zu einer geringen Anzahl von Epithelzellen führt. DF hat ein größeres Volumen als PDL und enthält mehr Zellen. DF kann eine Gewebequelle für die Primärkultur menschlicher Zahnepithelzellen sein. Dieses Protokoll ist einfacher und effizienter als die Isolationsmethode mit PDL. Die Beschaffung menschlicher Zahnepithelzellen kann weitere Studien zu zahnärztlichen epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen erleichtern.

Einleitung

Die Zahnbildung beginnt mit der Invagination des oralen ^Epithels1. Je nach Entwicklungsstadium des Zahns hat das orale Epithel verschiedene Namen, einschließlich des inneren und äußeren Schmelzepithels, der zervikalen Schleife und der Hertwig-Epithelwurzelscheide (HERS). Die Epithelkompartimente kommunizieren mit den umgebenden mesenchymalen Zellen. Epithelial-mesenchymale Wechselwirkungen regulieren die Zahnbildung und Geweberegeneration. Die Beschaffung von zahnärztlichen Epithelzellen wie oralen Keratinozyten und Hertwigs epithelialen Wurzelscheidenzellen (HERSCs) ist entscheidend für die Untersuchung von zahnärztlichen epithelial-mesenchymalen ^{Interaktionen2}.

Nagetier-abgeleitete dentale Epithelzellen werden aus der Epithelstruktur isoliert, wie z.B. dem HERS. Li und Kollegen isolierten und immortalisierten herSCs aus Rattenmolaren, nachdem sie den apikalen Teil der sich entwickelnden Zahnkeime von 8 Tage alten Ratten geerntet ^hatten3. Das HERS wurde unter Vergrößerung vom apikalen Gewebe getrennt. In Anbetracht des Entwicklungsstadiums und des Alters des Zahnes ist die Ernte des HERS vom Menschen aus ethischen Gründen fast unmöglich: Ein sich entwickelnder Zahnkeim muss von einem kleinen Kind entfernt werden, um das menschliche HERS zu ernten. Unreife Zahnkeime werden selten extrahiert. Menschliche Zahnepithelzellen können aus der Gingiva und dem Parodontalband (PDL) isoliert werden. Epithelstruktur-abgeleitete Zellen sind zusammen mit mesenchymalen Komponenten an der Zahnbildung beteiligt und könnten für die Untersuchung von zahnärztlichen epithelial-mesenchymalen Interaktionen besser geeignet sein als orale Keratinozyten. Epithelzellreste von Malassez (ERM) sind HERS-abgeleitete Epithelreste und befinden sich in geringer Anzahl im ^PDL4. Studien berichten über die Isolierung menschlicher HERSCs von ^PDL5. Die Entnahme menschlicher HERSCs aus PDL-Gewebe ist jedoch aufgrund der Knappheit der Epithelpopulation an diesem Ort nicht immer ^{erfolgreich5,6}.

Obwohl aus Nagetieren gewonnene HERSCs in serumhaltigen Medien gehalten ^werden3,7, werden humane DF-abgeleitete Epithelzellen mit serumfreien Medien kultiviert, die anderen menschlichen Epithelzellen ähneln, wie normale menschliche epidermale Keratinozyten und normale menschliche orale Keratinozyten8,9. Dies impliziert physiologische oder funktionelle Unterschiede zwischen Nagetier-Dentalepithelzellen und menschlichen Zahnepithelzellen. Das Verständnis des Mechanismus in Bezug auf zahnärztliche epithelial-mesenchymale Wechselwirkungen könnte zur Entwicklung klinischer Anwendungen beitragen, einschließlich parodontaler Wiederanlagerung während der Replantation, parodontaler Regeneration bei Parodontitis, Pulpa-Dentin-Komplex-Regeneration und Biozahnerzeugung. In Anbetracht der Merkmale der translationalen Forschung können menschliche Zahnepithelzellen für die Untersuchung von epithelial-mesenchymalen Interaktionen besser geeignet sein als Nagetier-Dentalepithelzellen.

Das menschliche DF ist ein lockeres Bindegewebe und befindet sich oft in einem impaktierten Zahn. Das DF enthält mesenchymale ^Vorläufer10. Unseres Wissens hat jedoch keine Studie über die Isolierung von Epithelzellen aus Zahnfollikeln vor 2021 berichtet. Oh und Yi berichteten über die Isolierung von Epithelzellen aus menschlichen DF im Jahr 2028. Der epitheliale Phänotyp wurde durch Western Blotting und morphologische Analyse bestätigt. Die Analyse des Ursprungs von DF-abgeleiteten Epithelzellen zeigte ähnliche Ergebnisse wie andere Studien. DF-abgeleitete Epithelzellen waren weder endothel- noch hämatopoetisch5,11, und Oh und Yi schlugen vor, diese Zellen als DF-HERSCs zu benennen. Das DF hat ein größeres Volumen als das PDL, und mehr Epithelzellen können aus dem DF isoliert werden. Dies verstärkt die Entstehung von Epithelkolonien und führt zu einer hohen Erfolgsrate bei der Gewinnung von Epithelzellen aus DF. Diese Studie schlägt vor, die DF als Gewebequelle für die Isolierung von Zahnepithelzellen zu verwenden.

In der vorliegenden Studie wurden einzelne Zellen aus dem DF nach zuvor beschriebenen Verfahren ^{isoliert10,12}. Das DF enthält heterogene Zellpopulationen, und mehrere Zelltypen könnten im frühen Stadium des Verfahrens vorhanden sein. Morsczek und Kollegen isolierten DF-abgeleitete mesenchymale ^{Stammzellen10}. Wir stellten die Hypothese auf, dass das DF Epithelzellen enthält und dass nur Epithelzellen unter serumfreien Bedingungen überleben können. Diese Studie unterscheidet sich von der von Morsczek et al. hinsichtlich der Selektion der Epithelpopulation und der Hemmung mesenchymaler Zellen. Die Selektion erfolgte unter Verwendung keratinocyte serum-free media (SFM), die die Proliferation von Epithelzellen ermöglichen und die mesenchymale Zellproliferation hemmen. Diese Studie entstand aus einem Bericht von Oh und ^Yi8. Ziel dieser Studie war es, Details der in diesem Bericht verwendeten Methode zur Isolierung von Epithelzellen aus menschlicher DF zu beschreiben.

Protokoll

Diese Studie wurde vom Institutional Review Board des Kyung Hee University Hospital in Gangdong (IRB-Zulassung Nr. KHNMC 2017-06-009).

1. DF sammeln

HINWEIS: Die Patienten gaben vor der Operation die Einverständniserklärung für die Entfernung eines reifen oder unreifen betroffenen dritten Backenzahns. Patienten mit der folgenden Erkrankung wurden ausgeschlossen: Diabetes, Bluthochdruck, Tuberkulose, Hepatitis, erworbenes Immunschwächesyndrom. Schwangere Frauen wurden ebenfalls ausgeschlossen.

1. Ernte DF während der chirurgischen Extraktion von impaktierten dritten Molaren (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Die Operation wurde von einem Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgen durchgeführt. Für die Gewebeentnahme ist die Zusammenarbeit mit einem Zahnarzt erforderlich.
2. VOR GEBRAUCH DF in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) mit 3 % Penicillin-Streptomycin bei 4 °C lagern. Führen Sie isolationsprozeduren am Tag der DF-Ernte durch (Abbildung 1B).

2. Isolieren Sie Einzelzellpopulationen aus DF

1. Brühlösungen von Kollagenase Typ I und Protease in DPBS so heraufbereiten, dass die Endkonzentrationen der Kollagenase Typ I und der Protease 1 mg/ml bzw. 2,4 mg/ml betragen.
2. Bereiten Sie drei 50-ml-Waschröhrchen mit 20 ml DPBS pro Röhrchen vor. Beschriften Sie die Tuben mit 1, 2 und 3.
3. Waschen Sie den DF nacheinander in den Waschschläuchen. Halten Sie den DF mit einer Pinzette fest und legen Sie den DF in Röhre 1. Nehmen Sie den DF aus Röhre 1 und legen Sie ihn in Röhre 2. Nehmen Sie den DF aus Röhre 2 und legen Sie ihn in Röhre 3. Schütteln Sie DF vorsichtig 10-15 Mal in jedem Röhrchen. Nach dreimaligem Waschen den DF in eine 60-mm-Kulturschale geben (Abbildung 2A).
4. Zerkleinern Sie das DF mit einer Gewebeschere (Abbildung 2B). Übertragen Sie nur eine kleine Portion in die Kulturschale, um den Gewebeverlust zu minimieren. Wiederholen Sie den Schnitt, bis der DF breiig oder matschig aussieht (Abbildung 2C).
5. Mischen Sie 1 ml Kollagenase Typ I und 1 ml Proteaselösung in einem 15 ml konischen Röhrchen, um Endkonzentrationen von 1 mg/ml bzw. 2,4 mg/ml zu erhalten.
6. Das zerkleinerte DF aus Schritt 2.5 in das konische 15-ml-Rohr überführen. Schütteln und inkubieren Sie das Röhrchen vorsichtig für 1 h bei 37 °C.
7. 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA in das Röhrchen geben, schütteln und das Röhrchen 15 min bei 37 °C inkubieren.
8. Herstellung eines Keratinozytenmediums, das Keratinozyten SFM 10% fötales Rinderserum (FBS) enthält. Fügen Sie 3 ml Keratinozytenmedium in ein neues 50 ml konisches Röhrchen hinzu. Legen Sie ein 40-μm-Sieb auf dieses Röhrchen und verwenden Sie eine 10 ml serologische Pipette, um den Überstand aus Schritt 2,6 abzusaugen und durch das Sieb zu leiten.
   HINWEIS: Minimieren Sie den Einbau von verdauten Geweberesten während der Einnahme des Überstandes. Entfernen Sie die Gewebereste mit einem 40 μm-Sieb, um ein Versagen zu minimieren. Gewebereste können 70 μm-Schmutzfänger passieren und die Koloniebildung behindern. FBS im Keratinozytenmedium inaktiviert die Enzyme.
9. Wiederholen Sie die Schritte 2.7 und 2.8.
10. Die gesammelte Suspension wird in ein konisches 15-ml-Rohr gegeben.
11. Zentrifugieren Sie das 15 mL konische Rohr bei 288 × g für 3 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, eine versehentliche Entfernung von pelletierten Zellen zu vermeiden, die meist unsichtbar sind.
12. 3 ml Keratinozyten-SFM zugeben und die Zellen zweimal mit einer 1-ml-Pipette mit Zentrifugation gemäß Schritt 2.11 waschen.
13. Die Einzelzellpopulation wird mit Keratinozyten-SFM in eine 60-mm-Kulturschale gekeltert. Bewahren Sie die Kulturschale mit einem Endvolumen von 5 ml in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% _CO2 bei 37 °C auf. Wechseln Sie das Kulturmedium täglich, bis keine Gewebe- oder Zelltrümmer mehr beobachtet werden.
    HINWEIS: Entfernen Sie schwimmende Ablagerungen im Kulturmedium, indem Sie das Medium wechseln. Die verzögerte Entfernung von Gewebetrümmern oder abgestorbenen Zellen wirkt sich ungünstig auf die Primärkultur aus.
14. Untersuchen Sie die Platte aus Schritt 2.13, um das Wachstum von Epithelzellen zu überprüfen (Abbildung 3A).
    HINWEIS: Epithelzellen wachsen innerhalb von 7-10 Tagen nach der Plattierung von Einzelzellpopulationen.
15. Erweitern Sie die Epithelkolonien und subkulturieren Sie die Zellen.
    1. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie den Boden der Kulturplatte einmal mit 3 ml Keratinozyten-SFM.
    2. 2 ml Zelldissoziationsprotease zugeben und in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% _CO2 bei 37 °C für 3 min inkubieren.
       HINWEIS: Wiederholen Sie Schritt 2.15.2, wenn die Zellablösung nicht wirksam ist.
    3. Geben Sie 2 ml Keratinozytenmedium in die Kulturplatte und übertragen Sie den Inhalt in ein 15 mL konisches Röhrchen.
       HINWEIS: Die Zugabe von mehr Keratinozytenmedium ist nicht erforderlich, wenn Schritt 2.15.2 wiederholt wird.
    4. Zentrifugieren Sie das 15 mL konische Rohr bei 288 × g für 3 min bei 4 °C.
    5. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Zellpellet zweimal mit 3 ml Keratinozyten-SFM.
    6. Die Zellen werden in einer 100-mm-Kulturschale mit Keratinozyten-SFM (Endvolumen von 10 mL pro 100-mm-Schale) plattiert.
16. Bereiten Sie Zellbestände vor und lagern Sie sie in einem Flüssigstickstofftank.
    1. Ernten Sie Zellen wie in den Schritten 2.15.1-2.15.5 beschrieben.
    2. Verteilen Sie die Zellen in Kryovolen in 1 ml Gefriermedium (80% Keratinozyten SFM, 10% Dimethylsulfoxid, 10% FBS).
    3. Legen Sie die Durchstechflaschen in einen Gefrierbehälter und lagern Sie sie bei -80 °C für 24 h.
    4. Die Fläschchen aus der Tiefkühltruhe in einen Flüssigstickstofftank überführen.

Ergebnisse

DF-Ernte
Die Operation wurde von einem Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgen durchgeführt. Menschliche Materialien, einschließlich des Zahnfragments, des Zahnfleischgewebes und der DF, wurden von einem Chirurgen gesammelt (Abbildung 1A). Der DF könnte am Zahnfragment befestigt sein. Ein Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurg wird in der Lage sein, die DF zu identifizieren. Die Zusammenarbeit und Kommunikation mit dem Chirurgen sind für die Gewebeentnahme erforderlich. Das ...

Diskussion

Dieses Protokoll enthält kritische Schritte. Die Entnahme von Einzelzellpopulationen ist für die erfolgreiche Isolierung von Epithelzellen aus DF unerlässlich. Wir versuchten, Epithelzellen aus dem DF zu isolieren, basierend auf unserer Hypothese, dass es mehr Epithelzellen im DF gibt. Das Zerkleinerungsverfahren verbessert die Ablösung und Freisetzung von Zellen aus dem DF. Das Zerkleinerungsverfahren wurde verbessert und das Zerkleinern wurde wiederholt, bis das DF breiig erschien, um die Freisetzung einzelner Zell...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol	EMD millipore Co., MA, USA	1096341011	1 L
0.05% trypsin-EDTA	Gibco, Grand island, NY, USA	25300054	100 mL
40 μm cell strainer	Falcon, NC, USA	352340
Cell culture dish (100 x 20 mm)	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	172958	Discontinued
Cell culture dish (60 x 15 mm)	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	150326
Collagenase type 1	Gibco, Grand island, NY, USA	17100017	1 g
Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge	Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea	CB-514R
Conical tube	SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea	50015 50050	15 mL 50 mL
Cryogenic vial	Corning Inc., NY, US	430488	2 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Missouri, US	D2650-100ml	100 mL
Dispase	Gibco, Grand island, NY, USA	17105041	1 g
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea	LB 001-02	500 mL
Fetal bovine serum	Gibco, Grand island, NY, USA	16000044	500 mL
Heraeus BB 15 / CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	51023121
Keratinocyte serum-free medium	Gibco, Grand island, NY, USA	10724-011	500 mL
MVE CryoSystem 2000	MVE Biological Solutions Co., GA, USA	CryoSystem 2000
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	5100-0001	for 1.2-2 mL CryoVials
Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope	Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts	22-00723-01	Discontinued
Penicillin-Streptomycin Strep	Gibco, Grand island, NY, USA	15140122	100 mL (10,000 U/mL)
Pipet aid XP	Drummond scientific Co., PA, USA	HDR-4-000-201
Pipetman Classic P1000	Gilson, Villiers le Bel, France	F123602	100-1000 µL
Refrigerant	Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan	CLN 540U	~-80 °C / Discontinued
Serological pipet	SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea	91010	10ml
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	12605010	cell dissociation protease