Epitel Hücrelerinin İnsan Diş Foliküllerinden İzolasyonu

Özet

Diş folikülleri epitel popülasyonu ve mezenkimal hücreler içerir. Epitel popülasyonu, farklı bir kültür ortamı sağlanarak heterojen diş folikül hücre popülasyonundan seçilmiştir. Epitel hücreleri hayatta kaldı ve serumsuz bir ortamda koloniler oluşturdu.

Özet

Diş kökü (DF), etkilenen üçüncü azı dişinin oral maksillofasiyal bir cerrah tarafından çıkarılması sırasında hasat edildi. Epitel hücre izolasyonu DF hasat gününde gerçekleştirildi. DF, DPBS ile üç kez yıkandı ve daha sonra doku pulpalı veya yumuşak bir kıvama gelene kadar doku makası ile parçalandı. Tek hücreli popülasyonlar santrifüjleme ile peletlendi ve keratinosit serumsuz ortamla yıkandı. Heterojen hücre popülasyonları bir kültür çanağı içinde dağıtıldı. Epitel hücrelerini seçmek için keratinosit serumsuz ortam kullanıldı. Kültür ortamı, yüzen enkaz veya ölü hücre gözlenene kadar günlük olarak değiştirildi. Epitel hücreleri hücre popülasyon dağılımından sonraki 7-10 gün içinde ortaya çıktı. Epitel hücreleri serumsuz ortamda hayatta kalırken, %10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş α modifikasyonlu minimal esansiyel ortam mezenkimal tip hücrelerin çoğalmasını sağladı. DF, dental epitel hücrelerinin izolasyonu için bir doku kaynağıdır.

Bu çalışmanın amacı epitel hücrelerinin insan DF'den izolesi için bir yöntem oluşturmaktı. Periodontal ligament (PDL) insan diş epitel hücrelerinin izolasyonu için kullanıldı. Epitel hücrelerinin insan PDL'sinden temini, küçük doku hacmi nedeniyle her zaman başarılı değildir ve bu da düşük sayıda epitel hücresine yol açmaktadır. DF, PDL'den daha büyük bir hacme sahiptir ve daha fazla hücre içerir. DF, insan diş epitel hücrelerinin birincil kültürü için bir doku kaynağı olabilir. Bu protokol, PDL kullanan yalıtım yönteminden daha kolay ve daha verimlidir. İnsan diş epitel hücrelerinin temini, dental epitel-mezenkimal etkileşimlerin daha fazla çalışmalarını kolaylaştırabilir.

Giriş

Diş oluşumu oral epitelin invaginasyonu ile ^başlar1. Diş gelişim evresine göre, oral epitel iç ve dış emaye epitel, servikal döngü ve Hertwig'in epitel kök kılıfası (HERS) dahil olmak üzere farklı isimlere sahiptir. Epitel bölmeleri çevredeki mezenkimal hücrelerle iletişim kurar. Epitel-mezenkimal etkileşimler diş oluşumunu ve doku yenilenmesini düzenler. Oral keratinositler ve Hertwig'in epitel kök kılıf hücreleri (HERSC' ler) gibi diş epitel hücrelerinin temini, diş epitel-mezenkimal etkileşimlerinin incelenmesi için çok ^önemlidir2.

Kemirgen türevi diş epitel hücreleri, HERS gibi epitel yapısından izole edilir. Li ve meslektaşları, gelişmekte olan diş mikroplarının apikal kısmını 8 günlük sıçanlardan topladıktan sonra fare azı dişi türevi HERSC'leri izole etti ve ^{ölümsüzleştirdi3}. HERS büyütme altında apikal dokudan ayrıldı. Diş gelişim evresi ve yaşı göz önüne alındığında, etik sorunlar nedeniyle HERS'yi insanlardan hasat etmek neredeyse imkansızdır: insan HERS'ini hasat etmek için gelişmekte olan bir diş mikropunun küçük bir çocuktan çıkarılması gerekir. Olgunlaşmamış diş mikropları nadiren çıkarılır. İnsan diş epitel hücreleri diş eti ve periodontal bağdan (PDL) izole edilebilir. Epitel yapıdan türetilmiş hücreler mezenkimal bileşenlerle birlikte diş oluşumuna katılırlar ve ağız keratinositlerine göre diş epitel-mezenkimal etkileşimlerinin incelenmesi için daha uygun olabilir. Malassez'in (ERM) epitel hücre dayanaları HERS türevi epitel kalıntılarıdır ve ^PDL4'te az sayıda bulunmaktadır. Çalışmalar, insan HERSC'lerin ^PDL5'ten izole edilmesini rapor eder. Bununla birlikte, PDL dokusundan insan HERSC'leri toplamak, bu konumdaki epitel popülasyonunun azlığı nedeniyle her zaman başarılı ^değildir5,6.

Kemirgen türevi HERSC'ler serum içeren medyada tutulsa ^da3,7, insan DF türevi epitel hücreleri, normal insan epidermal keratinositleri ve normal insan oral keratinositleri8,9 gibi diğer insan epitel hücrelerine benzer serumsuz ortamlarla kültürlenir. Bu, kemirgen diş epitel hücreleri ile insan diş epitel hücreleri arasındaki fizyolojik veya fonksiyonel farklılıkları ima eder. Dental epitel-mezenkimal etkileşimlerle ilgili mekanizmanın anlaşılması, replantasyon sırasında periodontal reattachment, periodontal hastalıkta periodontal rejenerasyon, pulp-dentin kompleks rejenerasyonu ve biyo-diş üretimi dahil olmak üzere klinik uygulamaların gelişimine katkıda bulunabilir. Çevirisel araştırmaların özellikleri göz önüne alındığında, epitel-mezenkimal etkileşimlerin incelenmesi için insan diş epitel hücreleri kemirgen diş epitel hücrelerinden daha uygun olabilir.

İnsan DF gevşek bir bağ dokusudur ve genellikle etkilenen bir dişte bulunur. DF mezenkimal öncüller ^içerir10. Bununla birlikte, bilgimize göre, 2021'den önce hiçbir çalışma epitel hücrelerinin diş köklerinden izole edilmesini bildirmemiştir. Oh ve Yi, 20218'de epitel hücrelerinin insan DF'den izole olduğunu bildirdi. Epitel fenotip batı şişkinliği ve morfolojik analiz ile doğrulandı. DF türevi epitel hücrelerinin kökeninin analizi, diğer çalışmalarla benzer sonuçlar göstermiştir. DF türevi epitel hücreleri ne endotel ne de hematopoetik5,11'di ve Oh ve Yi bu hücreleri DF-HERSC olarak adlandırmayı önerdi. DF, PDL'den daha büyük bir hacme sahiptir ve DF'den daha fazla epitel hücresi yalıtılabilir. Bu, epitel kolonilerinin ortaya çıkışını arttırır ve DF'den epitel hücrelerinin toplanmasında yüksek bir başarı oranı ile sonuçlanır. Bu çalışma, diş epitel hücrelerinin izolasyonu için DF'nin bir doku kaynağı olarak kullanılmasını önermektedir.

Bu çalışmada, daha önce açıklanan prosedürlere göre tek hücreler DF'den izole ^edildi10,12. DF heterojen hücre popülasyonları içerir ve prosedürün erken aşamasında birkaç hücre tipi bulunabilir. Morsczek ve meslektaşları DF türevi mezenkimal kök hücreleri izole ^ettiler10. DF'nin epitel hücreleri içerdiğini ve serumsuz koşullarda sadece epitel hücrelerinin hayatta kalabileceğini vardır diye hipotez ettik. Bu çalışma, epitel popülasyonunun seçimi ve mezenkimal hücrelerin inhibisyonu açısından Morsczek ve ark. Seçim, epitel hücre çoğalmasına izin veren ve mezenkimal hücre çoğalmasını engelleyen keratinosit serumsuz ortam (SFM) kullanılarak gerçekleştirildi. Bu çalışma Oh ve ^Yi8 tarafından hazırlanan bir rapordan kaynaklanmıştır. Bu çalışmanın amacı, epitel hücrelerinin insan DF'den izolesi için bu raporda kullanılan yöntemin ayrıntılarını açıklamaktı.

Protokol

Bu çalışma Gangdong'daki Kyung Hee Üniversite Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır (IRB onayı no. KHNMC 2017-06-009).

1. DF Topla

NOT: Hastalar ameliyattan önce olgun veya olgunlaşmamış etkilenen üçüncü azı dişinin çıkarılması için bilgilendirilmiş onay verdiler. Aşağıdaki hastalığa sahip hastalar hariç tutuldu: diyabet, hipertansiyon, tüberküloz, hepatit, edinilmiş immün yetmezlik sendromu. Hamile kadınlar da dışlandı.

1. Etkilenen üçüncü azı dişlerinin cerrahi ekstraksiyonu sırasında hasat DF (Şekil 1A).
   NOT: Cerrahi oral maksillofasiyal cerrah tarafından yapıldı. Doku toplanması için bir diş hekimi ile işbirliği gereklidir.
2. DF'i kullanmadan önce 4 °C'de %3 penisilin-streptomisin içeren Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) saklayın. DF hasat gününde izolasyon prosedürleri gerçekleştirin (Şekil 1B).

2. Tek hücreli popülasyonları DF'den izole edin

1. DPBS'de kollajenaz tip I ve proteaz stok çözeltileri hazırlayın, böylece kollajenaz tipi I ve proteazın son konsantrasyonları sırasıyla 1 mg/mL ve 2,4 mg/mL'dir.
2. Tüp başına 20 mL DPBS ile üç adet 50 mL yıkama tüpü hazırlayın. Tüpleri 1, 2 ve 3 olarak etiketle.
3. DF'yi yıkama tüplerinde sırayla yıkayın. DF'yi cımbızla tutun ve DF'yi tüp 1'e yerleştirin. DF'yi tüp 1'den çıkar ve tüp 2'ye yerleştirin. DF'yi tüp 2'den çıkar ve tüp 3'e yerleştirin. DF'i her tüpte 10-15 kez hafifçe sallayın. Üç kez yıkadıktan sonra, DF'yi 60 mm'lik bir kültür kabına yerleştirin (Şekil 2A).
4. DF'nin doku makası ile kıyması (Şekil 2B). Doku kaybını en aza indirmek için kültür çanasına sadece küçük bir kısmını aktarın. DF hamurlu veya yumuşak bir görünüme sahip olana kadar kesimi tekrarlayın (Şekil 2C).
5. Sırasıyla 1 mg/mL ve 2,4 mg/mL'lik son konsantrasyonları elde etmek için 15 mL konik tüpte 1 mL kollajenaz tip I ve 1 mL proteaz çözeltisini karıştırın.
6. Kıyılmış DF'i adım 2.5'ten 15 mL konik tüpe aktarın. Tüpü 37 °C'de 1 saat boyunca hafifçe çalkalayın ve kuluçkaya yatırın.
7. Tüpe% 0.05 trypsin-EDTA'nın 5 mL'sini ekleyin, sallayın ve tüpü 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
8. Keratinosit SFM%10 fetal sığır serumu (FBS) içeren keratinosit ortamı hazırlayın. Yeni bir 50 mL konik tüpe 3 mL keratinosit ortamı ekleyin. Bu tüpün üzerine 40 μm süzgeç yerleştirin ve 2.6 adımdan itibaren süpernatantı aspire etmek ve süzgeçten geçirmek için 10 mL serolojik pipet kullanın.
   NOT: Süpernatant alırken sindirilmiş doku kalıntılarının birleştirilmesini en aza indirin. Başarısızlığı en aza indirmek için doku kalıntılarını 40 μm süzgeçle çıkarın. Doku kalıntıları 70 μm süzgeçlerden geçebilir ve koloni oluşumunu engelleyebilir. Keratinosit ortamındaki FBS enzimleri devre dışı bırakacaktır.
9. 2.7 ve 2.8.
10. Toplanan süspansiyonu 15 mL konik bir tüpe aktarın.
11. 15 mL konik tüpü 288 × g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüj edin. Üsttekini çıkarın.
    NOT: Çoğunlukla görünmez olan peletlenmiş hücrelerin yanlışlıkla çıkarılmasını önlemeye dikkat edin.
12. 3 mL keratinosit SFM ekleyin ve hücreleri adım 2.11'de olduğu gibi santrifüjlü 1 mL pipetle iki kez yıkayın.
13. Tek hücreli popülasyonu keratinosit SFM kullanarak 60 mm'lik bir kültür kabına yerleştirin. Kültür çanağini 37 °C'de %5 _CO2'lik nemli bir atmosferde 5 mL'lik son hacimde saklayın. Doku veya hücre döküntümü gözlenene kadar kültürü günlük olarak değiştirin.
    NOT: Ortamı değiştirerek kültür ortamındaki kayan kalıntıları kaldırın. Doku kalıntılarının veya ölü hücrelerin gecikmeli olarak çıkarılması birincil kültür üzerinde elverişsiz bir etkiye sahiptir.
14. Epitel hücrelerinin büyümesini kontrol etmek için plakayı adım 2.13'ten inceleyin (Şekil 3A).
    NOT: Epitel hücreleri tek hücreli popülasyonları kaplatma sonrasında 7-10 gün içinde büyür.
15. Epitel kolonilerini genişletin ve hücreleri alt kültüre edin.
    1. Ortamı aspire edin ve kültür plakasının altını bir kez 3 mL keratinosit SFM ile yıkayın.
    2. 2 mL hücre ayrışması proteaz ekleyin ve 3 dakika boyunca 37 °C'de% 5 _CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde kuluçkaya yatırın.
       NOT: Hücre ayırma etkili değilse 2.15.2 adımlarını yineleyin.
    3. Kültür plakasına 2 mL keratinosit ortamı ekleyin ve içeriği 15 mL konik bir tüpe aktarın.
       NOT: Adım 2.15.2 yinelenirse daha fazla keratinosit ortamı eklemek gerekli değildir.
    4. 15 mL konik tüpü 288 × g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüj edin.
    5. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 3 mL keratinosit SFM ile iki kez yıkayın.
    6. Hücreleri keratinosit SFM (100 mm çanak başına 10 mL son hacim) kullanarak 100 mm'lik bir kültür çanağında plakalayın.
16. Hücre stoklarını sıvı bir azot tankında hazırlayın ve saklayın.
    1. 2.15.1-2.15.5 adımlarında açıklandığı gibi hücreleri hasat edin.
    2. Hücreleri 1 mL donma ortamında cryovials'a dağıtın (%80 keratinosit SFM, %10 dimetilsüllfoksit, %10 FBS).
    3. Şişeleri dondurucu bir kaba yerleştirin ve 24 saat boyunca -80 °C'de saklayın.
    4. Şişeleri derin dondurucudan sıvı bir azot tankına aktarın.

Sonuçlar

DF hasadı
Ameliyat oral maksillofasiyal cerrah tarafından yapıldı. Diş parçası, diş eti dokusu ve DF dahil olmak üzere insan kaynaklı malzemeler bir cerrah tarafından toplanmıştır (Şekil 1A). DF diş parçasına bağlı olabilir. Oral maksillofasiyal cerrah DF'yi tanımlayabilecektir. Doku toplanması için cerrahla işbirliği ve iletişim gereklidir. DF düzensiz şekilli membran benzeri bir dokudur. Diş eti dokusu keratinize bir yüzeye sahiptir ve DF'd...

Tartışmalar

Bu protokol kritik adımları içerir. Tek hücreli popülasyonların toplanması, epitel hücrelerinin DF'den başarılı bir şekilde izole edilmesinin olmazsa olmazıdır. DF'de daha fazla epitel hücresi olduğu hipotezimize dayanarak epitel hücrelerini DF'den izole etmeye çalıştık. Kıyma prosedürü, hücrelerin DF'den ayrılarak salınmalarını artırır. Kıyma prosedürü geliştirildi ve DF tek hücrelerin salınımını kolaylaştırmak için hamurlu görünene kadar kıyma tekrarlandı. Maksimum tek hü...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol	EMD millipore Co., MA, USA	1096341011	1 L
0.05% trypsin-EDTA	Gibco, Grand island, NY, USA	25300054	100 mL
40 μm cell strainer	Falcon, NC, USA	352340
Cell culture dish (100 x 20 mm)	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	172958	Discontinued
Cell culture dish (60 x 15 mm)	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	150326
Collagenase type 1	Gibco, Grand island, NY, USA	17100017	1 g
Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge	Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea	CB-514R
Conical tube	SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea	50015 50050	15 mL 50 mL
Cryogenic vial	Corning Inc., NY, US	430488	2 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Missouri, US	D2650-100ml	100 mL
Dispase	Gibco, Grand island, NY, USA	17105041	1 g
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea	LB 001-02	500 mL
Fetal bovine serum	Gibco, Grand island, NY, USA	16000044	500 mL
Heraeus BB 15 / CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	51023121
Keratinocyte serum-free medium	Gibco, Grand island, NY, USA	10724-011	500 mL
MVE CryoSystem 2000	MVE Biological Solutions Co., GA, USA	CryoSystem 2000
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	5100-0001	for 1.2-2 mL CryoVials
Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope	Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts	22-00723-01	Discontinued
Penicillin-Streptomycin Strep	Gibco, Grand island, NY, USA	15140122	100 mL (10,000 U/mL)
Pipet aid XP	Drummond scientific Co., PA, USA	HDR-4-000-201
Pipetman Classic P1000	Gilson, Villiers le Bel, France	F123602	100-1000 µL
Refrigerant	Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan	CLN 540U	~-80 °C / Discontinued
Serological pipet	SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea	91010	10ml
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	12605010	cell dissociation protease