인간 치과 여포에서 상피 세포의 격리

요약

치과 여포에는 상피 인구와 중간 엽 세포가 포함되어 있습니다. 상피 인구는 뚜렷한 배양 배지를 제공함으로써 이질적인 치과 여포 세포 집단으로부터 선택되었다. 상피 세포는 혈청이없는 배지에서 생존하고 식민지를 형성했다.

초록

치과 여포 (DF)는 구강 상악안면 외과 의사에 의해 영향 받은 세 번째 어어를 제거하는 동안 수확되었습니다. 상피 세포 격리는 DF 수확 당일에 수행되었다. DF는 DPBS로 세 번 세척한 다음 조직이 펄프 또는 스퀴시 일관성을 가질 할 때까지 조직 가위로 해부되었습니다. 단세포 인구는 원심분리에 의해 펠렛되었고 각질 세포 혈청이 없는 매체로 세척되었다. 이질적인 세포 인구는 배양 접시에 분포되었다. 각질 세포 혈청 프리 배지는 상피 세포를 선택하는 데 사용되었습니다. 배양 배지는 부동 파편이나 죽은 세포가 관찰되지 않을 때까지 매일 변경되었다. 상피 세포는 세포 인구 분포 후에 7-10 일 안에 나타났습니다. 상피 세포는 혈청이 없는 매체에서 살아남았고, 10%의 태아 소 혈청으로 보충된 α 수정 최소한의 필수 매체는 중간엽 형 세포의 증식을 허용했습니다. DF는 치과 상피 세포의 격리를 위한 조직 원입니다.

이 연구의 목적은 인간 DF로부터 상피 세포의 분리를위한 방법을 확립하는 것이었습니다. 치주 인대 (PDL)는 인간의 치과 상피 세포의 격리를 위해 사용되었다. 인간 PDL에서 상피 세포를 조달하는 것은 상피 세포의 낮은 수로 이끌어 내는 작은 조직 양 때문에 항상 성공적이지 않습니다. DF는 PDL보다 더 큰 부피를 가지며 더 많은 셀을 포함합니다. DF는 인간 치과 상피 세포의 1 차적인 문화에 대한 조직 원이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 PDL을 사용하는 격리 방법보다 쉽고 효율적입니다. 인간의 치과 상피 세포를 조달하는 것은 치과 상피 - 중간 엽 상호 작용의 추가 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

서문

치아 형성은 경구 상피¹의 질로 시작됩니다. 치아 발달 단계에 따르면, 경구 상피는 내부 및 외부 에나멜 상피, 자궁 경부 루프 및 Hertwig의 상피 뿌리 칼집 (HERS)을 포함하여 다른 이름을 가지고 있습니다. 상피 구획은 주변 중간 엽 세포와 통신합니다. 상피 -중간 엽 상호 작용은 치아 형성과 조직 재생을 조절합니다. 구강 각질 세포와 Hertwig의 상피 뿌리 칼집 세포 (HERSC)와 같은 치과 상피 세포를 조달하는 것은 치과 상피 - 중간 엽 상호 작용²의 연구에 매우 중요합니다.

설치류 유래 치과 상피 세포는 HERS와 같은 상피 구조로부터 분리된다. 리와 동료들은 8일 ^{된 쥐3}에서 발달된 치아 세균의 액면 부분을 수확한 후 고립되고 불멸의 쥐 어금니 유래 HERSC를 분리하고 불멸의 HERSC를 수집했다. HERS는 배율 하에서 정연조직으로부터 분리되었다. 치아 발달 단계와 나이를 고려할 때, 인간으로부터 HERS를 수확하는 것은 윤리적 인 문제로 인해 거의 불가능합니다 : 발달치아 세균은 인간 HERS를 수확하기 위해 어린 아이에게서 제거해야합니다. 미숙한 치아 세균은 거의 추출되지 않습니다. 인간의 치과 상피 세포는 치지바 및 치주 인대 (PDL)로부터 분리 될 수있다. 상피 구조 유래 세포는 중간엽 성분과 함께 치아 형성에 참여하고 구강 각질 세포보다 치과 상피 - 중간 엽 상호 작용연구에 더 적합 할 수 있습니다. 말라세즈(ERM)의 상피 세포 받침대는 HERS 유래 상피 잔재이며 ^PDL4에 있는 작은 숫자에 상주한다. 연구 결과는 ^PDL5에서 인간 HERSCs의 격리를 보고합니다. 그러나, PDL 조직에서 인간 HERSC를 수확하는 것은 이 위치에 있는 상피 인구의 부족 때문에 항상 성공적이지 않습니다^5,6.

설치류 유래 HERSC는 혈청 함유 ^media3,7에서 유지되지만, 인간 DF 유래 상피 세포는 정상적인 인간 표피 각질 세포 및 정상 인간 구강 각질 세포^8,9과 같은 다른 인간 상피 세포와 유사한 혈청 없는 배지로 배양된다. 이것은 설치류 치과 상피 세포와 인간 치과 상피 세포 사이의 생리학적 또는 기능적 차이를 의미합니다. 치과 상피-중간엽 상호 작용에 관한 메커니즘을 이해하면 재농중치재부착, 치주질환의 치주재생, 펄프 덴틴 복합재생 및 바이오 치아 생성을 포함한 임상 응용 분야의 개발에 기여할 수 있다. 번역 연구의 특성을 고려, 인간의 치과 상피 세포는 상피 - 중간 엽 상호 작용의 연구를위한 설치류 치과 상피 세포보다 더 적합 할 수있다.

인간 DF는 느슨한 결합 조직이며 종종 영향을받은 치아에 상주합니다. DF에는 중간엽 전구체¹⁰이 포함되어 있습니다. 그러나, 우리의 지식에, 어떤 연구 도 전에 치과 여포에서 상피 세포의 격리를 보고 했다 2021. 아와 이총재는 20218년 인간 DF로부터 상피세포의 고립을 보고했다. 상피 표현형은 서양 블로팅 및 형태 분석에 의해 확인되었다. DF 유래 상피 세포의 기원에 대한 분석은 다른 연구와 유사한 결과를 입증했다. DF 유래 상피 세포는 내피나 조혈^5,11도 아니었으며, 오씨와 이종은 이러한 세포를 DF-HERSC로 명명할 것을 제안했다. DF는 PDL보다 더 큰 부피를 가지며, 더 많은 상피 세포는 DF로부터 분리될 수 있다. 이것은 상피 식민지의 출현을 강화하고 DF에서 상피 세포를 수확에 높은 성공률을 초래한다. 이 연구는 치과 상피 세포의 격리를 위한 조직 근원으로 DF를 사용하여 건의합니다.

본 연구에서, 단일 세포는 이전에 설명된 절차에 따라 DF로부터 분리되었다^10,12. DF는 이질적인 세포 집단을 포함하고, 몇몇 세포 모형은 절차의 초기 단계에서 존재할 수 있었습니다. Morsczek 및 동료는 DF 유래 중간엽 줄기 세포를 격리¹⁰. 우리는 DF가 상피 세포를 포함하고 만 상피 세포가 혈청없는 조건하에서 살아남을 수 있다고 가설. 이 연구는 상피 집단의 선택과 중간 엽 세포의 억제의 관점에서 Morsczek 외. 것과 다릅니다. 선택은 상피 세포 증식을 허용하고 중간 엽 세포 증식을 억제하는 각질 세포 혈청 없는 매체 (SFM)를 사용하여 수행되었다. 이 연구는 오씨와 ^Yi8의 보고서에서 유래했다. 이 연구의 목적은 인간 DF에서 상피 세포의 격리를 위해 그 보고에서 사용된 방법의 세부 사항을 기술하는 것이었습니다.

프로토콜

이 연구는 강동경희대학병원 기관검토위원회의 승인을 받았다(IRB 승인 안부) KHNMC 2017-06-009).

1. DF 수집

참고 : 환자는 성숙하거나 미숙한 영향 세 번째 어어의 제거에 대한 수술 전에 통보 된 동의를했다. 당뇨병, 고혈압, 결핵, 간염, 면역결핍 증후군 등 다음과 같은 질환을 가진 환자는 제외되었다. 임산부도 제외되었다.

1. 영향 받은 세 번째 어금니의 수술 추출 중 DF를 수확하십시오 (그림 1A).
   참고 : 수술은 구강 상악안면 외과 의사에 의해 수행되었다. 조직 수집을 위해 치과 의사와 협력이 필요합니다.
2. DULBEcco의 인산염 완충식식(DPBS)에 DF를 저장하여 사용 전에 4°C에서 페니실린-연쇄 절제술을 3% 저장합니다. DF 수확 당일 격리 절차를 수행합니다(그림 1B).

2. DF에서 단세포 인구 격리

1. 콜라게나아제 타입 I와 프로테아제의 스톡 솔루션을 DPBS에 준비하여 콜라게나아제 타입 I와 프로테아제의 최종 농도는 각각 1 mg/mL 및 2.4 mg/mL입니다.
2. 튜브당 DPBS 20mL로 50mL 세정튜브 3개준비. 튜브를 1, 2 및 3로 레이블을 지정합니다.
3. 세탁튜브에 DF를 순차적으로 세척합니다. 핀셋으로 DF를 잡고 DF를 튜브 1에 배치합니다. 튜브 1에서 DF를 꺼내 튜브 2에 놓습니다. 튜브 2에서 DF를 꺼내 튜브 3에 놓습니다. 각 튜브에서 DF를 10-15번 부드럽게 흔들어 줍니다. 세 번 세척한 후 DF를 60mm 배양 접시에 놓습니다(그림 2A).
4. 조직 가위로 DF를 다진다(그림 2B). 조직 손실을 최소화하기 위해 배양 접시에 작은 부분만 옮김합니다. DF가 펄피 또는 스퀴시 모양이 될 때까지 절단을 반복합니다(그림 2C).
5. 콜라게나아제 타입 I와 프로테아제 용액 1mL을 15mL 원판 튜브에 혼합하여 1 mg/mL 및 2.4 mg/mL의 최종 농도를 각각 얻습니다.
6. 다진 DF를 2.5단계에서 15mL 원문 튜브로 옮기다. 튜브를 37°C에서 1시간 동안 부드럽게 흔들고 배양합니다.
7. 튜브에 0.05% 트립신-EDTA의 5mL를 추가하고, 37°C에서 15분 동안 튜브를 배양한다.
8. 각질 세포 SFM을 함유한 각질 세포 배지를 준비하여 10% 태아 소 혈청(FBS)을 준비한다. 새로운 50mL 원추형 튜브에 3mL의 각질 세포 매질을 추가합니다. 이 튜브 위에 40 μm 스트레이너를 놓고 10mL 세로지학적 파이펫을 사용하여 2.6 단계에서 초판을 흡인하고 여과기를 통과합니다.
   참고: 상퍼를 복용하는 동안 소화된 조직 잔재의 통합을 최소화합니다. 실패를 최소화하기 위해 40 μm 여과기로 조직 잔해를 제거합니다. 조직 잔해는 70 μm 스트레이너를 통과하고 식민지 형성을 방해할 수 있습니다. 각질 세포 배지의 FBS는 효소를 비활성화합니다.
9. 2.7 및 2.8 단계를 반복합니다.
10. 수집된 서스펜션을 15mL 원문 튜브로 옮는다.
11. 원심분리기는 4°C에서 3분 동안 288 × g 에서 15mL 원원형 튜브를 원심분리합니다. 상부체를 제거합니다.
    참고: 대부분 보이지 않는 펠릿 세포의 우발적인 제거를 피하십시오.
12. 각질 세포 SFM3 mL을 추가하고 단계 2.11에서와 같이 원심분리가있는 1 mL 파이펫으로 세포를 두 번 씻으세요.
13. 각질 세포 SFM을 사용하여 단세포 인구를 60mm 배양 접시에 접시로 플레이트. 37°C에서 5% _CO2 의 가습된 분위기에서 5mL의 최종 부피로 배양 접시를 유지한다. 조직이나 세포 이물질이 관찰되지 않는 때까지 매일 배양 배지를 변경합니다.
    참고: 배지를 변경하여 배양 매체에 부동 이물질을 제거합니다. 조직 파편 또는 죽은 세포의 지연 제거는 1 차 문화에 불리한 영향을 미칩니다.
14. 2.13 단계에서 플레이트를 검사하여 상피 세포의 성장을 확인합니다(그림 3A).
    참고: 상피 세포는 단세포 인구를 도금한 후에 7-10 일 안에 증가합니다.
15. 상피 식민지를 확장하고 세포를 하위 배양한다.
    1. 매질을 흡기하고 각질 세포 SFM의 3mL로 배양 판의 바닥을 한 번 씻는다.
    2. 세포 해리 프로테아제 2mL를 넣고 37°C에서 5% _CO2 의 가습된 분위기에서 3분 동안 배양한다.
       참고: 세포 분리가 효과적이지 않으면 2.15.2 단계를 반복합니다.
    3. 컬쳐 플레이트에 2mL의 각질 세포 매질을 추가하고 15mL 원추형 튜브로 내용을 전달합니다.
       참고: 2.15.2 단계를 반복하는 경우 더 많은 각질 세포 매질을 추가할 필요가 없습니다.
    4. 원심분리기는 288mL원관에서 4°C에서 3 분 동안 × .
    5. 상체를 제거하고 각질 세포 SFM의 3mL로 셀 펠릿을 두 번 세척합니다.
    6. 각질 세포 SFM (100mm 접시 당 10mL의 최종 부피)를 사용하여 100mm 배양 접시에 세포를 접시.
16. 액체 질소 탱크에 셀 스톡을 준비하고 저장합니다.
    1. 단계 2.15.1-2.15.5에 설명된 바와 같이 셀을 수확한다.
    2. 동결 배지의 1 mL에서 극저온으로 세포를 분배 (80% 각질 세포 SFM, 10% 디메틸설프리산화물, 10% FBS).
    3. 유리병을 냉동 용기에 넣고 24시간 동안 -80°C에 보관합니다.
    4. 깊은 냉동고에서 액체 질소 탱크로 바이알을 옮춥시다.

결과

DF 수확
수술은 구강 상악안면 외과 의사에 의해 수행되었다. 치아 단편, 치지발 조직 및 DF를 포함한 인간 유래 물질은 외과 의사에 의해 수집되었다(도 1A). DF는 치아 조각에 부착될 수 있습니다. 구강 상악안면 외과 의사는 DF를 식별 할 수 있습니다. 조직 수집을 위해서는 외과 의사와의 협력과 의사소통이 필요합니다. DF는 불규칙하게 모양의 막 과 같은 조직?...

토론

이 프로토콜에는 중요한 단계가 포함됩니다. 단일 세포 집단을 수확하는 것은 DF에서 상피 세포의 성공적인 격리를 위해 필수적입니다. 우리는 DF에 더 많은 상피 세포가 있다는 우리의 가설에 근거하여 DF에서 상피 세포를 격리하기 위하여 노력했습니다. 다진 절차는 DF에서 세포의 분리 및 방출을 향상시킵니다. 미칭 절차가 개선되었고, DF가 단일 세포의 방출을 용이하게 하기 위해 펄프가 나타났...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol	EMD millipore Co., MA, USA	1096341011	1 L
0.05% trypsin-EDTA	Gibco, Grand island, NY, USA	25300054	100 mL
40 μm cell strainer	Falcon, NC, USA	352340
Cell culture dish (100 x 20 mm)	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	172958	Discontinued
Cell culture dish (60 x 15 mm)	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	150326
Collagenase type 1	Gibco, Grand island, NY, USA	17100017	1 g
Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge	Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea	CB-514R
Conical tube	SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea	50015 50050	15 mL 50 mL
Cryogenic vial	Corning Inc., NY, US	430488	2 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Missouri, US	D2650-100ml	100 mL
Dispase	Gibco, Grand island, NY, USA	17105041	1 g
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea	LB 001-02	500 mL
Fetal bovine serum	Gibco, Grand island, NY, USA	16000044	500 mL
Heraeus BB 15 / CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	51023121
Keratinocyte serum-free medium	Gibco, Grand island, NY, USA	10724-011	500 mL
MVE CryoSystem 2000	MVE Biological Solutions Co., GA, USA	CryoSystem 2000
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	5100-0001	for 1.2-2 mL CryoVials
Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope	Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts	22-00723-01	Discontinued
Penicillin-Streptomycin Strep	Gibco, Grand island, NY, USA	15140122	100 mL (10,000 U/mL)
Pipet aid XP	Drummond scientific Co., PA, USA	HDR-4-000-201
Pipetman Classic P1000	Gilson, Villiers le Bel, France	F123602	100-1000 µL
Refrigerant	Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan	CLN 540U	~-80 °C / Discontinued
Serological pipet	SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea	91010	10ml
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	12605010	cell dissociation protease