القياس الكمي للمعلمات الوعائية في شبكية العين الكاملة للفئران ذات اعتلال الشبكية غير التكاثري والتكاثري

Summary

تصف هذه المقالة فحص بقع اللكتين الراسخ والقابل للتكرار لمستحضرات الشبكية الكاملة والبروتوكولات المطلوبة للقياس الكمي لمعلمات الأوعية الدموية التي يتم تغييرها بشكل متكرر في اعتلال الشبكية التكاثري وغير التكاثري.

Abstract

اعتلال الشبكية هي مجموعة غير متجانسة من الأمراض التي تؤثر على الأنسجة العصبية الحسية للعين. وهي تتميز بالتنكس العصبي والدبقية والتغيير التدريجي في وظيفة الأوعية الدموية وبنيتها. على الرغم من أن بداية اعتلال الشبكية تتميز باضطرابات طفيفة في الإدراك البصري ، إلا أن التعديلات في الضفيرة الوعائية هي العلامات الأولى التي يكتشفها الأطباء. يحدد غياب أو وجود الأوعية الدموية الجديدة ما إذا كان اعتلال الشبكية يصنف على أنه إما غير تكاثري (NPDR) أو تكاثري (PDR). وبهذا المعنى ، حاولت العديد من النماذج الحيوانية محاكاة ميزات الأوعية الدموية المحددة لكل مرحلة لتحديد الآليات الأساسية التي تنطوي عليها تغيرات البطانة ، والموت العصبي وغيرها من الأحداث التي تحدث في شبكية العين. في هذه المقالة ، سنقدم وصفا كاملا للإجراءات المطلوبة لقياس معلمات الأوعية الدموية في شبكية العين لدى البالغين والفئران المبكرة الولادة في يوم ما بعد الولادة (P)17. سنقوم بتفصيل البروتوكولات اللازمة لتنفيذ تلطيخ الأوعية الدموية في الشبكية باستخدام Isolectin GSA-IB4 في حوامل كاملة للتصور المجهري اللاحق. كما يتم توفير الخطوات الرئيسية لمعالجة الصور باستخدام برنامج Image J Fiji ، وبالتالي ، سيتمكن القراء من قياس كثافة الأوعية الدموية وقطرها وتعرجها ، وتفرع الأوعية الدموية ، وكذلك المناطق الوعائية والأوعية الدموية الجديدة. هذه الأدوات مفيدة للغاية لتقييم وقياس التغيرات الوعائية في كل من اعتلال الشبكية غير التكاثري والتكاثري.

Introduction

تتغذى العينان على نظامين شريانيين وريديين: الأوعية الدموية المشيمية ، وهي شبكة أوعية دموية خارجية تروي الظهارة المصطبغة للشبكية والمستقبلات الضوئية. والأوعية الدموية العصبية الشبكية التي تروي طبقة الخلايا العقدية والطبقة النووية الداخلية للشبكية1. الأوعية الدموية الشبكية هي شبكة منظمة من الأوعية التي توصل العناصر الغذائية والأكسجين إلى خلايا الشبكية وتحصد النفايات لضمان نقل الإشارات البصرية المناسبة. هذا الأوعية الدموية له بعض السمات المميزة، بما في ذلك: عدم وجود تعصيب مستقل، وتنظيم لهجة الأوعية الدموية من خلال آليات الشبكية الجوهرية وامتلاك حاجز معقد بين الشبكية ^والدم2. لذلك ، كانت الأوعية الدموية في شبكية العين محور تركيز العديد من الباحثين الذين درسوا على نطاق واسع ليس فقط تكوين الأوعية الدموية أثناء التطور ، ولكن أيضا التغيرات وتكوين الأوعية المرضية التي تخضع لها هذه الأوعية في ^{الأمراض3}. التغيرات الوعائية الأكثر شيوعا التي لوحظت في اعتلال الشبكية هي توسع الأوعية الدموية ، والأوعية الدموية الجديدة ، وفقدان تشجير الأوعية الدموية وتشوه الأوعية الرئيسية في شبكية العين ، مما يجعلها أكثر ^{تعرجا4،5،6}. واحد أو أكثر من التعديلات الموصوفة هي أقدم العلامات التي يتم اكتشافها من قبل الأطباء. يوفر التصور الوعائي طريقة فحص سريعة وغير جراحية وغير ^مكلفة7. ستحدد الدراسة المكثفة للتغيرات التي لوحظت في شجرة الأوعية الدموية ما إذا كان اعتلال الشبكية غير تكاثري أو تكاثري والعلاج الإضافي. يمكن أن تظهر اعتلالات الشبكية غير التكاثرية نفسها مع مورفولوجيا الأوعية الدموية الشاذة ، وانخفاض كثافة الأوعية الدموية ، والشعيرات الدموية اللاخلوية ، وموت الخلايا المحيطة ، والوذمة البقعية ، من بين أمور أخرى. بالإضافة إلى ذلك، تؤدي اعتلالات الشبكية التكاثرية أيضا إلى زيادة نفاذية الأوعية الدموية، وإعادة التشكيل خارج الخلية، وتشكيل خصلات الأوعية الدموية نحو التجويف الزجاجي الذي ينهار بسهولة أو يحفز انفصال ^{الشبكية8}.

بمجرد اكتشافه ، يمكن مراقبة اعتلال الشبكية من خلال تغييراته الوعائية9,10. يمكن متابعة تطور علم الأمراض من خلال التغييرات الهيكلية للأوعية ، والتي تحدد بوضوح مراحل ^المرض11. سمح القياس الكمي للتغيرات الوعائية في هذه النماذج بالربط بين تغيرات الأوعية الدموية والموت العصبي واختبار العلاجات الدوائية للمرضى في مراحل مختلفة من المرض.

في ضوء العبارات المذكورة أعلاه ، نعتبر أن التعرف على التغيرات الوعائية وتحديدها كميا أمر أساسي في دراسات اعتلال الشبكية. في هذا العمل ، سنوضح كيفية قياس معلمات الأوعية الدموية المختلفة. للقيام بذلك ، سنستخدم نموذجين حيوانيين. واحد منهم هو نموذج فأر اعتلال الشبكية الناجم عن ^{الأكسجين12} ، الذي يحاكي اعتلال الشبكية الخداجي وبعض جوانب اعتلال الشبكية السكري التكاثري13,14. في هذا النموذج ، سنقيس المناطق اللاوعائية ومناطق الأوعية الدموية الجديدة وتوسع الأوعية الرئيسية وتعرجها. في مختبرنا ، تم تطوير نموذج فأر متلازمة التمثيل الغذائي (MetS) ، والذي يحفز اعتلال الشبكية غير ^{التكاثري15}. هنا ، سنقوم بتقييم كثافة الأوعية الدموية والتفرع.

Protocol

تم التعامل مع الفئران C57BL/6J وفقا للمبادئ التوجيهية لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية. تم تصميم الإجراءات التجريبية والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (CICUAL) التابعة لكلية العلوم الكيميائية بجامعة قرطبة الوطنية (القرار HCD 1216/18).

1. إعداد المحاليل العازلة والكواشف

1. تحضير 1x محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS): أضف 8 جم من كلوريد الصوديوم (NaCl) ، و 0.2 جم من كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، و 14.4 جم من ثنائي هيدرات ثنائي الصوديوم والهيدروجين والفوسفات (_{Na2HPO4 2H2O}) و 0.24 جم من فوسفات البوتاسيوم ثنائي الهيدروجين (_KH2PO4) إلى 800 مل من الماء المقطر. حرك المحلول حتى يذوب الأملاح بالكامل. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 مع حمض الكلوريد (HCl) واضبط الحجم على 1 لتر بالماء المقطر الإضافي. قم بتصفية المحلول وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
2. تحضير 4٪ بارافورمالدهيد (PFA): أضف 40 جم من PFA الصلب إلى 800 مل من PBS الطازج. حرك المحلول في لوحة تسخين عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 60 درجة مئوية. أضف 1 مليون هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) حتى يذوب PFA تماما ، مع التحقق من الحفاظ على الرقم الهيدروجيني في نطاق 7.2-7.4. قم بزيادة مستوى الصوت إلى 1000 مل باستخدام PBS واخلطه. أطفئ لوحة التسخين وقم بتصفية المحلول عندما تكون درجة حرارته أقل من 35 درجة مئوية. تخزين الحل في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام.
   تحذير: PFA ضار إذا تم ابتلاعه أو إذا تم استنشاقه وربما يكون مركبا مطفرا. استخدم القفازات وقناع الوجه أثناء العملية برمتها واعمل في كابينة أمان.
3. تحضير 1x محلول ملحي مخزن مؤقتا (TBS): أضف 6.1 جم من Tris و 9 جم من كلوريد الصوديوم إلى 800 مل من الماء المقطر. حرك المحلول حتى يذوب الأملاح بالكامل. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام HCl واضبط الحجم على 1 لتر باستخدام ماء مقطر إضافي. قم بتصفية المحلول وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
4. تحضير TBS - 0.1٪ Triton X-100: أضف 0.1 مل من TritonX-100 إلى 100 مل من TBS. اخلط بلطف وخزنه على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
   ملاحظة: نظرا لأن Triton منظف كثيف للغاية ، فقم بقطع طرف الطرف قليلا لتحسين السحب.
5. تحضير TBS-5٪ - ألبومين مصل البقر (BSA) -0.1٪ Triton-X-100: وزن 5 جم من BSA وإضافة TBS - 0.1٪ محلول triton X-100 حتى الحجم النهائي 100 مل. يحرك بلطف. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
6. Isolectin GSA-IB4 Alexa fluor-488 مترافق (Isolectin GSA-IB4): الوزن 36.75 ملغ من ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم (_CaCl2 · _2H2O) وإضافته إلى 500 مل من PBS الطازجة. حرك المحلول بقضيب تحريك. ماصة 500 ميكرولتر من محلول _CaCl2 / PBS وإضافته إلى القارورة التي تحتوي على 500 ميكروغرام من مسحوق Isolectin GSA-IB4 المجمد بالتجميد. اخلط بلطف وأليكوت المحلول في أنابيب 0.5 مل. قم بتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية محمية من الضوء.
7. بولي (كحول الفينيل) في الجلسرين / تريس: وزن 2.4 غرام من بولي (كحول الفينيل) ، إضافة 6 غرام من الجلسرين ويحرك بلطف. ثم أضف 6 مل من الماء واستمر في التحريك لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة. أضف 12 مل من محلول تريس 0.2 M المسخن مسبقا (الرقم الهيدروجيني: 8.5) وسخن عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق واخلطه من حين لآخر. أخيرا ، قم بطرد المحلول عند 5000 × جم لمدة 15 دقيقة للتوضيح.
   ملاحظة: دع المحلول يبرد في درجة حرارة الغرفة ، وقم بتحريكه وتخزينه عند -20 درجة مئوية.

2. تلطيخ الليكتين الفلورسنت

1. عند تضحية الفئران باستنشاق ثاني أكسيد الكربون (_CO2) ، قم باستئصال العينين ^{بالمقص16}. قم بإصلاح العيون المشقوقة باستخدام PFA 4٪ طازج لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
   ملاحظة: يمكن أيضا إجراء التثبيت عن طريق احتضان العينين في 4٪ PFA بين عشية وضحاها (ON) عند 4 درجات مئوية. تم التضحية بالفئران وفقا للمبادئ التوجيهية لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية واللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (CICUAL) التابعة لكلية العلوم الكيميائية بجامعة قرطبة الوطنية (Res. HCD 1216/18).
2. تحت المجهر التشريحي ، قم بإزالة القرنيات بالمقص عن طريق قطع على طول الحافة وتشريح الشبكية بأكملها. تخلص من الجزء الأمامي من العين، ثم افصل الشبكية عن RPE-Choroid.
   ملاحظة: تأكد من إزالة الحطام المتبقي والأوعية الهيالويد من شبكية العين باستخدام الملقط.
3. ضع الشبكية في أنابيب 200 ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بحظر ونفاذية شبكية العين في 100 ميكرولتر من محلول محلول ملحي مخزن مؤقتا من تريس (TBS) يحتوي على 5٪ من ألبومين مصل البقر (BSA) و 0.1٪ Triton-X-100 خلال 6 ساعات عند 4 درجات مئوية مع إثارة لطيفة في الخلاط.
   ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة لمدة 2 ساعة في RT.
4. ثم ، عكس الأنبوب لوضع شبكية العين في الغطاء وإزالة محلول الحجب باستخدام ماصة.
5. أضف 100 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على 0.01 ميكروغرام/ميكرولتر من إيزوليكتين GSA-IB4 (GSA-IB4). لف الأنابيب بورق الألومنيوم لحماية العينات من الضوء. احتضن الشبكية بمحلول اللكتين ON عند 4 درجات مئوية أو لمدة 2 ساعة في RT مع إثارة لطيفة في الخلاط.
6. اغسل شبكية العين ب 100 ميكرولتر من TBS التي تحتوي على 0.1٪ Triton-X-100 لمدة 20 دقيقة مع إثارة لطيفة في الخلاط. للغسيل السليم ، ضع شبكية العين في غطاء الأنبوب عن طريق عكسها. أعد الأنبوب إلى وضع الوقوف وقم بإزالة الوسط المتبقي في الحاوية. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
7. ضع شبكية العين في شريحة وأضف قطرة من PBS. تحت المجهر التشريحي ، قم بإجراء أربعة جروح بعيدة بالتساوي من حواف الشبكية نحو العصب البصري.
8. لكشف بتلات الشبكية، استخدم ملقط أو قطع صغيرة من ورق الترشيح. تأكد من أن جانب المستقبلات الضوئية متجه لأسفل.
9. قم بإزالة PBS المتبقي من الشريحة باستخدام ورق التصفية. ثم ، أضف وسيط تركيب (بولي (كحول الفينيل) في الجلسرين / تريس) وغطاء الغطاء. اتركه يجف لمدة 1 ساعة في RT.
10. قم بتخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
    ملاحظة: يمكن أيضا تخزين شبكية العين في PBS عند 4 درجات مئوية حتى التصور المجهري البؤري.

3. التصور المجهري البؤري واكتساب التصوير المجهري

1. قبل التصور، قم باحتضان الشرائح لمدة 10 دقائق في RT مغطاة من الضوء.
2. عند المجهر البؤري ، ضع الشريحة في اللوحة وجها لأسفل.
3. ركز الضفيرة الفائقة للأوعية الدموية في الشبكية وحدد منطقة لبدء الحصول على الصورة.
4. تعيين معلمات الليزر العامة في البرنامج: الطول الموجي: 488 نانومتر. كثافة الليزر; فيروس التهاب الكبد الوبائي. الإزاحة. كسب.
   ملاحظة: قد تختلف شدة الليزر وPMT والإزاحة والكسب حسب الظروف واستخدام المصباح. توفر الإعدادات المثلى صورة واضحة للأوعية التي تتجنب التشبع في حساسية أنبوب المضاعف الضوئي ليكون لها علاقة خطية مع إشارة التألق.
5. تعيين معلمات الاستحواذ الأخرى: الوضع; الحجم; الهدف ، دون التكبير / التصغير ؛ لا كالمان. حجم الخطوة.
   ملاحظة: يجب استخدام شروط اكتساب متطابقة لتصوير العينات الضابطة والتجريبية.
6. تعيين الإحداثيات في المحور x و y: امسح الشبكية ضوئيا في التركيز البؤري 2x. إذا كانت المنطقة تعرض السفن، فحددها بالنقر فوق ضعف المساحة من أجل وضع علامة عليها للحصول على صورة لاحقا.
   ملاحظة: يوصى بشدة بتحديد منطقة الشبكية باتباع الضفيرة الوعائية العليا لأن تألق الأوعية الأكبر أعلى.
7. انتقل في الشبكة إلى مربع مجاور، وركز شبكية العين، وحدد المنطقة إذا كانت متوافقة. كرر هذه الخطوة حتى تضم المنطقة المحددة شبكية العين بأكملها.
8. حدد منطقة واحدة واضبط الإحداثيات في المحور z لتحديد مدى سمك المسح الضوئي. للقيام بذلك ، تصور شبكية العين في التركيز البؤري 2x ؛ باستخدام الميكرومتر ، انتقل إلى أعلى شبكية العين وانقر فوق تعيين في موضع البدء. ثم انتقل إلى أسفل شبكية العين وانقر على تعيين في موضع النهاية.
9. كرر الخطوة 3.8 في كل منطقة محددة في الشبكة.
   ملاحظة: للتحقق من عمق المنطقة الممسوحة ضوئيا، اضغط على انتقال في موضع البدء. إذا كانت الأوعية لا تزال مرئية ، فأعد ضبط الموضع عن طريق تحريك الميكرومتر ، ثم انقر فوق تعيين. كرر العملية في موضع النهاية.
10. تهيئة المسح الضوئي التلقائي.
11. بمجرد انتهاء عملية المسح الضوئي، افتح الصورة.
12. حدد تنسيق السلسلة لتسجيل الصورة كفسيفساء وحفظها بالامتداد المفضل. أخيرا ، سيتم عرض الصورة المخيطة على الشاشة.

4. معالجة الصور

1. في برنامج ImageJ FIJI ، انتقل إلى شريط القوائم وانقر فوق ملف > فتح. حدد الصورة المراد معالجتها. في نافذة خيارات استيراد التنسيقات الحيوية ، حدد عرض البيانات الوصفية OME-XML وانقر فوق موافق.
   ملاحظة: يجب حفظ الصور التي تحمل اسما مشابها في مجلدات منفصلة.
2. في نافذة بيانات تعريف OME ، ابحث عن معلومات حجم البكسل، المسماة PhysicalSizeX و PhysicalSizeY و PhysicalSizeZ. انسخ هذه البيانات.
3. لمعايرة الصور، انتقل إلى شريط القوائم وحدد خصائص > الصورة. انسخ معلومات الصورة في الخطوة 4.2 وانقر فوق موافق. تفتح الصورة كنافذة تحتوي على عدة صور ، حيث تمثل كل صورة الصور المصغرة التي تم الحصول عليها في محور z.
4. قم بتعيين لوت مفضل للصورة من أجل إرسال لون إلى ملصق الفلورسنت. للقيام بذلك ، انتقل إلى شريط القوائم وانقر فوق رمز LUT .
5. لتصور كل المكدسات في صورة واحدة، انتقل إلى شريط القوائم وحدد صورة > مكدسات > Z Project.
6. في نافذة العرض Z، حدد جميع المكدسات حيث يتم تصور الأوعية. في نوع الإسقاط، اختر متوسط الكثافة وانقر على موافق.
   ملاحظة: سيتم عرض نتيجة مجموع المكدسات في صورة جديدة تسمى AVG (اسم الصورة).
7. اضبط السطوع والتباين في الصورة الناتجة لتقليل الخلفية وتمييز الأوعية. انتقل إلى شريط القوائم وانقر على صورة> ضبط > السطوع / التباين. في النوافذ B و C ، حرك القضبان حتى يتم ملاحظة كثافة أفضل. انقر فوق تطبيق واحفظ التغييرات.
8. نسخ المعلمات المحددة للسطوع / التباين ؛ يجب أن تكون هذه متطابقة لجميع الصور.
9. قبل القياس الكمي للصورة، حدد المعلمات التي سيتم قياسها. في شريط القوائم، انتقل إلى تحليل > تعيين القياسات. في الإجراءات الموضحة هنا ، سيكون من الضروري الحصول على المساحة والمحيط (وهذا ضروري أيضا في النهاية لقياس المسافات). انقر فوق موافق.
10. قم بتنزيل المكون الإضافي المطلوب لقياس كثافة ^{الوعاء17} واتبع إرشادات التثبيت التي يوفرها المكون الإضافي.
11. استمر في القياس الكمي لمعلمة وعائية محددة.

5. القياس الكمي للمناطق اللاوعائية

1. في شريط القوائم، اختر أداة العصا. حدد منطقة الشبكية التي تفتقر إلى الأوعية.
   ملاحظة: يمكن تحديد مساحات أكبر أو أصغر اعتمادا على التفاوت. لضبط التسامح ، انقر فوق رمز أداة العصا مرتين. الوضع المستخدم: الإرث.
2. اضغط على الحرف T على لوحة المفاتيح لتسجيل المنطقة المحددة في إدارة عائد الاستثمار. كرر الخطوتين 5.1 و5.2 مع جميع المناطق اللاوعائية في شبكية العين.
3. انقر فوق قياس في مدير عائد الاستثمار للحصول على معلومات منطقة الأوعية الدموية. سيعرض البرنامج نافذة جديدة تحتوي على المعلومات المطلوبة. انسخ البيانات في برنامج آخر أو احفظ الملف.
   ملاحظة: في بعض الصور، قد يفضل المرء تحديد المناطق اللاوعائية يدويا. في هذه الحالة ، اختر أداة تحديد المضلع ، وارسم مسافات قصيرة حول المنطقة الوعائية ، وانقر فوق الصورة عندما تكون مسافة جديدة على وشك البدء. أغلق المنطقة المحددة بالنقر فوق النقطة الأولى.
4. كرر الخطوات 5.1 و5.2 و5.3 لقياس المساحة الكلية لشبكية العين.
5. احسب المساحة اللاوعائية للشبكية كمجموع جميع المناطق اللاوعائية المقاسة مقسوما على المساحة الكلية للشبكية.

6. القياس الكمي للمناطق الوعائية الجديدة

1. في شريط القوائم، اختر أداة العصا.
2. قم بتكبير الصورة لتصور الأوعية الجديدة بشكل أفضل. حدد الأوعية الجديدة واحدة تلو الأخرى باستخدام أداة العصا.
   ملاحظة: اضبط التسامح الذي لا يزيد عن 20 لضمان اختيار سفينة جديدة واحدة. يجب أن يظل مستوى التسامح هذا ثابتا أثناء جميع عمليات القياس الكمي للصورة.
3. اضغط على الحرف T على لوحة المفاتيح لتسجيل المنطقة المحددة في إدارة عائد الاستثمار. كرر الخطوتين 6.1 و6.2 مع جميع مناطق الأوعية الدموية الجديدة في شبكية العين.
4. انقر فوق قياس في مدير عائد الاستثمار للحصول على بيانات المنطقة. سيعرض البرنامج نافذة جديدة تحتوي على المعلومات المطلوبة. انسخ البيانات في برنامج آخر أو احفظ الملف.
5. كرر الخطوات 6.1 و6.2 و6.3 لتحديد المساحة الكلية لشبكية العين.
6. احسب المساحة الوعائية الجديدة للشبكية كمجموع جميع مناطق الأوعية الدموية الجديدة المقاسة مقسوما على المساحة الكلية للشبكية.

7. القياس الكمي لقطر السفينة

1. في شريط القوائم، حدد أداة الخط المستقيم.
2. قم بتكبير الصورة لتصور جدار الوعاء بشكل أفضل. قم بإجراء ثلاثة خطوط عرضية إلى الوعاء الرئيسي قبل الفرع الأول. يجب أن يتم ذلك عن طريق رسم خط من حدود جدار واحد من السفينة إلى العكس.
   ملاحظة: يجب أن يكون الخط عموديا تماما على وعاء الحائط لتجنب أخطاء القياس الكمي.
3. اضغط على الحرف T على لوحة المفاتيح لتسجيل المنطقة المحددة في إدارة عائد الاستثمار. كرر الخطوتين 7.1 و 7.2 في كافة السفن التي تحتاج إلى تحديد كمي.
4. انقر فوق قياس في مدير عائد الاستثمار للحصول على بيانات المسافة. سيعرض البرنامج نافذة جديدة تحتوي على المعلومات المطلوبة. انسخ البيانات في برنامج آخر أو احفظ الملف.

8. القياس الكمي للالتواء السفينة

1. في شريط القوائم ، انقر فوق أيقونة أداة الخط المستقيم بالزر الأيمن من الماوس وحدد خطا مجزأ أو خطا حرا. ارسم خطا داخل الوعاء من العصب البصري حتى يتشعب الوعاء الأول بعد شكل الأوعية الدموية.
   ملاحظة: يجب أن يتبع الخط شكل الأوعية الدموية لتجنب أخطاء القياس الكمي.
2. اضغط على الحرف T على لوحة المفاتيح لتسجيل المنطقة المحددة في إدارة عائد الاستثمار.
3. في شريط القوائم، حدد أداة الخط المستقيم. ارسم خطا من العصب البصري حتى تشعب الوعاء الأول.
4. اضغط على الحرف T على لوحة المفاتيح لتسجيل المنطقة المحددة في إدارة عائد الاستثمار.
5. انقر فوق قياس في مدير عائد الاستثمار للحصول على بيانات المسافات. سيعرض البرنامج نافذة جديدة تحتوي على المعلومات المطلوبة. انسخ البيانات في برنامج آخر أو احفظ الملف.
6. احسب مؤشر الالتواء على النحو التالي: المسافة التي تم الحصول عليها باستخدام الخط المجزأ مقسوما على المسافة التي تم الحصول عليها باستخدام الخط المستقيم.

9. القياس الكمي لتفرع الأوعية الدموية

1. باستخدام الأداة البيضاوية لشريط القوائم، حدد مساحة مطبقة بالتساوي على جميع الظروف التجريبية. يجب أن تكون المنطقة المحددة دائرة متحدة المركز مرسومة حول العصب البصري.
2. اضغط على الحرف T على لوحة المفاتيح لتسجيل المنطقة المحددة في إدارة عائد الاستثمار.
   ملاحظة: في هذه الحالة، يوصى بحفظ عائد الاستثمار لأن القياس الكمي بطيء ويجب استخدام عائد الاستثمار المطابق في جميع الصور. للقيام بذلك ، في مدير عائد الاستثمار ، انقر فوق MORE > حفظ.
3. يدويا ، عد عدد الفروع الأولية الناشئة عن الأوعية الرئيسية داخل منطقة الاختيار.
4. كرر الخطوتين 9.2 و9.3 في المناطق المجاورة، مع الحفاظ على معايير محيط العصب البصري.

10. القياس الكمي لكثافة الأوعية الدموية

1. قم بتحويل الصورة إلى وضع 8 بت.
2. انتقل إلى المكونات الإضافية في شريط القوائم ، وحدد تحليل الوعاء > كثافة الأوعية الدموية.
3. حدد مساحة باستخدام الأداة المربعة لشريط القوائم، حيث يلزم قياس كثافة الوعاء. انقر فوق موافق.
4. سيعرض البرنامج نافذة جديدة تحتوي على المعلومات المطلوبة. انسخ البيانات في برنامج آخر أو احفظ الملف.
5. كرر الخطوات 10.2 و 10.3 و 10.4 في المناطق المجاورة ، مع الحفاظ على عائد الاستثمار ولكن وضعه تسع مرات يشمل محيط ومركز شبكية العين بأكملها.

النتائج

كما هو موضح في قسم البروتوكول ، من فحص تلطيخ الفلورسنت واحد ، يمكنك الحصول على مورفولوجيا الأوعية الدموية وتقييم العديد من المعلمات ذات الأهمية كميا. يعتمد البحث عن تغيير معين على نوع اعتلال الشبكية الذي تمت دراسته. في هذه المقالة ، تم تقييم المناطق الوعائية والأوعية الدموية الجديدة ، وال...

Discussion

النماذج الحيوانية لاعتلال الشبكية هي أدوات قوية لدراسة تطور الأوعية الدموية أو إعادة تشكيلها أو تكوين الأوعية الدموية المرضية. يعتمد نجاح هذه الدراسات في هذا المجال على سهولة الوصول إلى الأنسجة التي تسمح بإجراء مجموعة واسعة من التقنيات ، مما يوفر بيانات من الفئران في الجسم الحي وبع?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminuim foil
Bovine Serum Albumin	Merck	A4503	quality
Calcium chloride dihydrate	Merck	C3306
Hydrochloric acid	Biopack	9632.08
Confocal Microscope FV1200	Olympus	FV1200	with motorized plate
Covers	Paul Marienfeld GmnH & Co.	111520
Dissecting Microscope	NIKON	SMZ645
Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate	Merck	119753
200 µL  tube	Merck	Z316121
Filter paper	Merck	WHA5201090
Incubator shaker GyroMini	LabNet International	S0500
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate	Invitrogen	I21411
Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)	Merck	475904
Paraformaldehyde	Merck	158127
pHmeter	SANXIN	PHS-3D-03
Potassium chloride	Merck	P9541
Potassium-dihydrogen phosphate	Merck	1,04,873
Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Sodium chloride	Merck	S3014
Sodium hydroxide	Merck	S5881
Tris	Merck	GE17-1321-01
Triton X-100	Merck	X100-1GA
Vessel Analysis Fiji software	Mai Elfarnawany		https://imagej.net/Vessel_Analysis