Quantification des paramètres vasculaires dans les rétines montagnards entières de souris atteintes de rétinopathies non prolifératives et prolifératives

Résumé

Cet article décrit un test de coloration à la lectine bien établi et reproductible pour l’ensemble des préparations rétiniennes de monture et les protocoles requis pour la mesure quantitative des paramètres vasculaires fréquemment modifiés dans les rétinopathies prolifératives et non prolifératives.

Résumé

Les rétinopathies sont un groupe hétérogène de maladies qui affectent le tissu neurosensoriel de l’œil. Ils sont caractérisés par une neurodégénérescence, une gliose et un changement progressif de la fonction et de la structure vasculaires. Bien que l’apparition des rétinopathies soit caractérisée par de subtiles perturbations de la perception visuelle, les modifications du plexus vasculaire sont les premiers signes détectés par les cliniciens. L’absence ou la présence de néovascularisation détermine si la rétinopathie est classée comme non proliférative (NPDR) ou proliférative (PDR). En ce sens, plusieurs modèles animaux ont tenté d’imiter des caractéristiques vasculaires spécifiques de chaque stade pour déterminer les mécanismes sous-jacents impliqués dans les altérations de l’endothélium, la mort neuronale et d’autres événements se produisant dans la rétine. Dans cet article, nous fournirons une description complète des procédures requises pour la mesure des paramètres vasculaires rétiniens chez les adultes et les souris de naissance précoce au jour postnatal (P) 17. Nous détaillerons les protocoles pour effectuer la coloration vasculaire rétinienne avec Isolectin GSA-IB4 dans des montures entières pour une visualisation microscopique ultérieure. Les étapes clés pour le traitement de l’image avec le logiciel Image J Fiji sont également fournies, par conséquent, les lecteurs seront en mesure de mesurer la densité des vaisseaux, le diamètre et la tortuosité, la ramification vasculaire, ainsi que les zones avasculaires et néovasculaires. Ces outils sont très utiles pour évaluer et quantifier les altérations vasculaires dans les rétinopathies non prolifératives et prolifératives.

Introduction

Les yeux sont nourris par deux systèmes artério-veineux : le système vasculaire choroïdien, un réseau vasculaire externe qui irrigue l’épithélium pigmenté rétinien et les photorécepteurs ; et le système vasculaire neuro-rétinien qui irrigue la couche des cellules ganglionnaires et la couche nucléaire interne de la ^rétine1. Le système vasculaire rétinien est un réseau organisé de vaisseaux qui fournissent des nutriments et de l’oxygène aux cellules rétiniennes et récoltent des déchets pour assurer une transduction de signalisation visuelle appropriée. Cette vascularisation présente des caractéristiques distinctes, notamment : l’absence d’innervation autonome, la régulation du tonus vasculaire par des mécanismes rétiniens intrinsèques et la possession d’une barrière sanguine rétinienne ^complexe2. Par conséquent, le système vasculaire rétinien a été au centre de nombreux chercheurs qui ont étudié de manière approfondie non seulement la vasculogenèse au cours du développement, mais aussi les altérations et l’angiogenèse pathologique que ces vaisseaux subissent dans les ^maladies3. Les changements vasculaires les plus courants observés dans les rétinopathies sont la dilatation des vaisseaux, la néovascularisation, la perte d’arborisation vasculaire et la déformation des vaisseaux principaux de la rétine, ce qui les rend plus ziggaggy4,5,6. Une ou plusieurs des altérations décrites sont les premiers signes détectés par les cliniciens. La visualisation vasculaire fournit une méthode de dépistage rapide, non invasive et peu ^coûteuse7. L’étude approfondie des altérations observées dans l’arbre vasculaire déterminera si la rétinopathie est non proliférative ou proliférative et le traitement ultérieur. Les rétinopathies non prolifératives peuvent se manifester par une morphologie vasculaire aberrante, une diminution de la densité vasculaire, des capillaires acellulaires, la mort des péricytes, un œdème maculaire, entre autres. En outre, les rétinopathies prolifératives développent également une perméabilité vasculaire accrue, un remodelage extracellulaire et la formation de touffes vasculaires vers la cavité vitréenne qui se décomposent facilement ou induisent un décollement de la ^rétine8.

Une fois détectée, la rétinopathie peut être surveillée par ses changements ^{vasculaires9,10}. La progression de la pathologie peut être suivie à travers les changements structurels des vaisseaux, qui définissent clairement les stades de la ^maladie11. La quantification des altérations vasculaires dans ces modèles a permis de corréler les changements vasculaires et la mort neuronale et de tester des thérapies pharmacologiques pour les patients dans différentes phases de la maladie.

À la lumière des déclarations ci-dessus, nous considérons que la reconnaissance et la quantification des altérations vasculaires sont fondamentales dans les études sur les rétinopathies. Dans ce travail, nous allons montrer comment mesurer différents paramètres vasculaires. Pour ce faire, nous utiliserons deux modèles animaux. L’un d’eux est le modèle murin de rétinopathie induite par ^{l’oxygène12}, qui imite la rétinopathie de prématurité et certains aspects de la rétinopathie diabétique proliférative13,14. Dans ce modèle, nous mesurerons les zones avasculaires, les zones néovasculaires et la dilatation et la tortuosité des vaisseaux principaux. Dans notre laboratoire, un modèle murin de syndrome métabolique (MetS) a été développé, qui induit une rétinopathie non proliférative15. Ici, nous allons évaluer la densité vasculaire et la ramification.

Protocole

Les souris C57BL/6J ont été manipulées conformément aux lignes directrices de la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Les procédures expérimentales ont été conçues et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (CICUAL) de la Faculté des sciences chimiques de l’Université nationale de Cordoue (Rés. HCD 1216/18).

1. Préparation de solutions tampons et de réactifs

1. Préparation de 1x solution saline tampon phosphate (PBS) : Ajouter 8 g de chlorure de sodium (NaCl), 0,2 g de chlorure de potassium (KCl), 14,4 g de dihydrate d’hydrogène-phosphate disodique (_{Na2HPO4 2H2O}) et 0,24 g de phosphate de potassium-dihydrogène (_KH2PO4) à 800 mL d’eau distillée. Remuer la solution jusqu’à dissolution complète des sels. Réglez le pH à 7,4 avec de l’acide chlorure (HCl) et réglez le volume à 1 L avec de l’eau distillée supplémentaire. Filtrer la solution et la conserver à 4 °C.
2. Préparation de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % : Ajouter 40 g de PFA solide à 800 mL de PBS fraîchement préparé. Remuer la solution dans une plaque chauffante à une température constante de 60 °C. Ajouter 1 M d’hydroxyde de sodium (NaOH) jusqu’à ce que le PFA soit complètement dissous, en vérifiant que le pH est maintenu dans une plage de 7,2 à 7,4. Rechargez le volume à 1 000 mL avec DU PBS et mélangez. Éteignez la plaque chauffante et filtrez la solution lorsque sa température est inférieure à 35 °C. Conserver la solution à 4 °C jusqu’à 3 jours.
   ATTENTION : Le PFA est nocif s’il est avalé ou inhalé et est probablement un composé mutagène. Utilisez des gants et un masque facial pendant tout le processus et travaillez dans une cabine de sécurité.
3. Préparation de 1x solution saline tamponnée tris (TBS) : Ajouter 6,1 g de Tris et 9 g de NaCl à 800 mL d’eau distillée. Remuer la solution jusqu’à dissolution complète des sels. Réglez le pH à 7,4 avec HCl et réglez le volume à 1 L avec de l’eau distillée supplémentaire. Filtrer la solution et la conserver à 4 °C.
4. Préparation du TBS- 0,1% Triton X-100: Ajouter 0,1 mL de TritonX-100 à 100 mL de TBS. Mélanger doucement et conserver à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
   REMARQUE: Comme Triton est un détergent très dense, coupez légèrement la borne de la pointe pour un meilleur pipetage.
5. Préparation de TBS-5%-Bovine Serum Albumin (BSA) -0,1% Triton-X-100: Peser 5 g de BSA et ajouter TBS- 0,1% triton X-100 solution jusqu’à un volume final de 100 mL. Remuer doucement. Aliquote et conserver à -20 °C jusqu’à 2 mois.
6. Conjugué Isolectin GSA-IB4 Alexa fluor-488 (Isolectin GSA-IB4): Poids 36,75 mg de chlorure de calcium dihydraté (_CaCl2·_2H2O) et ajoutez-le à 500 mL de PBS fraîchement préparé. Remuer la solution avec une barre de remuage. Pipette 500 μL de la solution de _CaCl2/PBS et ajoutez-la au flacon contenant 500 μg de poudre d’isolectine GSA-IB4 lyophilisée. Mélanger doucement et alipher la solution dans des tubes de 0,5 mL. Conservez-les à -20 °C à l’abri de la lumière.
7. Poly(alcool vinylique) dans le glycérol/Tris : Peser 2,4 g de Poly(alcool vinylique), ajouter 6 g de glycérol et remuer doucement. Ensuite, ajoutez 6 mL d’eau et continuez à remuer pendant plusieurs heures à température ambiante. Ajouter 12 mL de solution de Tris préchauffée de 0,2 M (pH: 8,5) et chauffer à une température constante de 50 °C pendant 10 min et mélanger de temps en temps. Enfin, centrifuger la solution à 5 000 x g pendant 15 min pour clarification.
   REMARQUE: Laissez la solution refroidir à température ambiante, aliquotez-la et conservez-la à -20 ° C.

2. Coloration fluorescente à la lectine

1. Lors du sacrifice de souris par inhalation de dioxyde de carbone (_CO2), énucléez les yeux avec des ^ciseaux16. Fixez les yeux énucléés avec du PFA fraîchement préparé à 4% pendant 1 h à température ambiante (RT).
   REMARQUE: La fixation peut également être effectuée en incubant les yeux dans 4% PFA pendant la nuit (ON) à 4 ° C. Les souris ont été sacrifiées conformément aux directives de la Déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (CICUAL) de la Faculté des sciences chimiques de l’Université nationale de Cordoue (Rés. HCD 1216/18).
2. Sous le microscope à dissection, retirez les cornées avec des ciseaux en coupant le long des limbes et disséquez toute la rétine. Jetez le segment antérieur de l’œil, puis séparez la rétine de la choroïde RPE.
   REMARQUE: Assurez-vous d’enlever les débris restants et les vaisseaux hyaloïdes de la rétine avec une pince.
3. Placez les rétines dans des tubes de 200 μL. Ensuite, bloquez et perméabilisez les rétines dans 100 μL de solution saline tamponnée Tris (TBS) contenant 5% d’albumine sérique bovine (BSA) et 0,1% de triton-X-100 pendant 6 h à 4 °C avec une légère agitation dans le shaker.
   REMARQUE: Cette étape peut être effectuée pendant 2 h à RT.
4. Ensuite, inversez le tube pour placer la rétine dans le capuchon et retirez la solution bloquante avec une pipette.
5. Ajouter 100 μL de la solution contenant 0,01 μg/μL d’isolectine GSA-IB4 (GSA-IB4). Enveloppez les tubes avec du papier d’aluminium pour protéger les échantillons de la lumière. Incuber les rétines avec la solution de lectine ON à 4 °C ou pendant 2 h à RT avec une légère agitation dans le shaker.
6. Lavez la rétine avec 100 μL de TBS contenant 0,1% de Triton-X-100 pendant 20 min avec une légère agitation dans le shaker. Pour un lavage correct, placez la rétine dans le capuchon du tube en l’inversant. Remettre le tube en position debout et retirer le milieu restant dans le récipient. Répétez cette étape trois fois.
7. Placez la rétine dans une lame et ajoutez une goutte de PBS. Sous le microscope à dissection, effectuez quatre coupes également éloignées des bords de la rétine vers le nerf optique.
8. Pour déplier les pétales de la rétine, utilisez des pinces ou de petits morceaux de papier filtre. Assurez-vous que le côté photorécepteur est orienté vers le bas.
9. Retirez le PBS restant de la diapositive avec du papier filtre. Ensuite, ajoutez un support de montage (Poly(alcool vinylique) dans le glycérol/Tris) et le couvercle. Laissez sécher pendant 1 h à RT.
10. Rangez les glissières à 4 °C à l’abri de la lumière.
    REMARQUE: Les rétines peuvent également être stockées dans PBS à 4 ° C jusqu’à la visualisation par microscopie confocale.

3. Visualisation par microscopie confocale et acquisition de microphotographies

1. Avant la visualisation, incuber les diapositives pendant 10 min à RT couvertes de lumière.
2. Au microscope confocal, placez la lame dans la plaque face vers le bas.
3. Focalisez le plexus supérieur du système vasculaire rétinien et sélectionnez une zone pour commencer l’acquisition de l’image.
4. Définissez les paramètres généraux du laser dans le logiciel: Longueur d’onde: 488 nm; Intensité du laser; HV; Décalage; Gagner.
   REMARQUE: L’intensité du laser, PMT, décalage et gain peuvent varier en fonction des conditions et de l’utilisation de la lampe. Les réglages optimaux fournissent une image claire des vaisseaux évitant la saturation dans la sensibilité du tube photomultiplicateur pour avoir une relation linéaire avec le signal de fluorescence.
5. Définissez d’autres paramètres d’acquisition : Mode ; Taille; Objectif, sans zoom; Pas de Kalman; Taille de l’étape.
   REMARQUE : Des conditions d’acquisition identiques doivent être utilisées pour l’imagerie des échantillons témoins et expérimentaux.
6. Définir les coordonnées sur les axes x et y : Scannez la rétine dans le focus 2x. Si la zone montre des navires, sélectionnez-la en cliquant deux fois sur la zone afin de la marquer pour une acquisition d’image ultérieure.
   REMARQUE: Il est fortement recommandé de sélectionner la région rétinienne en suivant le plexus vasculaire supérieur car la fluorescence des plus gros vaisseaux est plus élevée.
7. Déplacez-vous dans la grille vers un carré voisin, concentrez la rétine et sélectionnez la zone si elle correspond. Répétez cette étape jusqu’à ce que la zone sélectionnée comprenne toute la rétine.
8. Sélectionnez une zone et définissez les coordonnées dans l’axe z pour définir l’étendue de l’épaisseur à numériser. Pour ce faire, visualisez la rétine au point 2x; avec le micromètre, allez en haut de la rétine et cliquez sur Définir en position de départ. Ensuite, déplacez-vous vers le bas de la rétine et cliquez sur Définir à la position De fin.
9. Répétez l’étape 3.8 dans chaque zone sélectionnée dans la grille.
   REMARQUE: Pour vérifier la zone numérisée en profondeur, appuyez sur Aller à la position de démarrage. Si les vaisseaux sont toujours visualisés, réajustez la position en déplaçant le micromètre, puis cliquez sur Définir. Répétez le processus à la position Fin.
10. Initialisez l’analyse automatisée.
11. Une fois le processus de numérisation terminé, ouvrez l’image.
12. Sélectionnez le format Série pour enregistrer l’image en mosaïque et enregistrez-la avec l’extension préférée. Enfin, l’image cousue sera affichée à l’écran.

4. Traitement d’image

1. Dans le logiciel ImageJ FIJI, allez dans la barre de menus et cliquez sur Fichier > Ouvrir. Sélectionnez l’image à traiter. Dans la fenêtre Options d’importation des bioformats , sélectionnez Afficher les métadonnées OME-XML et cliquez sur OK.
   REMARQUE: Les images avec un nom similaire doivent être enregistrées dans des dossiers séparés.
2. Dans la fenêtre Métadonnées OME , recherchez les informations de taille de pixel, nommées PhysicalSizeX, PhysicalSizeY et PhysicalSizeZ. Copiez ces données.
3. Pour l’étalonnage de l’image, accédez à la barre de menus et sélectionnez Propriétés de l’image >. Copiez les informations de l’image à l’étape 4.2 et cliquez sur OK. L’image s’ouvre sous la forme d’une fenêtre avec plusieurs photos, où chacune représente les microphotographies acquises sur un axe z.
4. Attribuez un lut préféré à l’image afin de consigner une couleur sur l’étiquette fluorescente. Pour ce faire, allez dans la barre de menus et cliquez sur l’icône LUT .
5. Pour visualiser toutes les piles d’une seule image, accédez à la barre de menus et sélectionnez Piles d’images > > projet Z.
6. Dans la fenêtre Projection Z affichée, sélectionnez toutes les piles où les navires sont visualisés. Dans Type de projection, choisissez Intensité moyenne et cliquez sur OK.
   REMARQUE: Le résultat de la somme des piles sera affiché dans une nouvelle image nommée AVG (nom de l’image).
7. Ajustez la luminosité et le contraste de l’image résultante pour réduire l’arrière-plan et mettre en surbrillance les vaisseaux. Allez dans la barre de menus et cliquez sur Image> Réglage> Luminosité / Contraste. Dans les fenêtres B et C, déplacez les barres jusqu’à ce qu’une meilleure intensité soit observée. Cliquez sur Appliquer et enregistrez les modifications.
8. Copiez les paramètres sélectionnés pour Luminosité/Contraste ; celles-ci doivent être identiques pour toutes les images.
9. Avant la quantification de l’image, définissez les paramètres qui vont être mesurés. Dans la barre de menus, accédez à Analyser > Définir les mesures. Dans les procédures décrites ici, il sera nécessaire d’obtenir la zone et le périmètre (cela est finalement également nécessaire pour mesurer les distances). Cliquez sur OK.
10. Téléchargez le plugin requis pour la quantification de la densité du ^récipient17 et suivez les instructions d’installation fournies par le plugin.
11. Continuer avec la quantification d’un paramètre vasculaire spécifique.

5. Quantification des zones avasculaires

1. Dans la barre de menus, choisissez l’outil Baguette. Sélectionnez la zone rétinienne qui manque de vaisseaux.
   REMARQUE: Des zones plus grandes ou plus petites peuvent être sélectionnées en fonction de la tolérance. Pour ajuster la tolérance, cliquez deux fois sur l’icône de l’outil baguette. Mode utilisé : Legacy.
2. Appuyez sur la lettre T du clavier pour enregistrer la zone sélectionnée dans le Gestionnaire de retour sur investissement. Répétez les étapes 5.1 et 5.2 avec toutes les zones avasculaires de la rétine.
3. Cliquez sur Mesurer dans le gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir les informations de la zone avasculaire. Le programme affichera une nouvelle fenêtre avec les informations requises. Copiez les données dans un autre programme ou enregistrez le fichier.
   REMARQUE: Dans certaines images, on peut préférer sélectionner les zones avasculaires manuellement. Dans ce cas, choisissez l’outil Sélection de polygones, dessinez de courtes distances autour de la zone avasculaire et cliquez sur l’image lorsqu’une nouvelle distance est sur le point de commencer. Fermez la zone sélectionnée en cliquant sur le premier point.
4. Répétez les étapes 5.1, 5.2 et 5.3 pour mesurer la surface totale de la rétine.
5. Calculer l’aire avasculaire de la rétine comme la somme de toutes les zones avasculaires mesurées divisée par la surface totale de la rétine.

6. Quantification des zones néovasculaires

1. Dans la barre de menus, choisissez l’outil Baguette.
2. Zoomez sur l’image pour mieux visualiser les néovassels. Sélectionnez les neovessels un par un avec l’outil baguette.
   REMARQUE: Ajustez la tolérance ne dépassant pas 20 pour assurer la sélection d’un seul neovessel. Ce niveau de tolérance doit rester constant lors de toutes les quantifications d’images.
3. Appuyez sur la lettre T du clavier pour enregistrer la zone sélectionnée dans le Gestionnaire de retour sur investissement. Répétez les étapes 6.1 et 6.2 avec toutes les zones néovasculaires de la rétine.
4. Cliquez sur Mesurer dans le gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir les données de la zone. Le programme affichera une nouvelle fenêtre avec les informations requises. Copiez les données dans un autre programme ou enregistrez le fichier.
5. Répétez les étapes 6.1, 6.2 et 6.3 pour quantifier la surface totale de la rétine.
6. Calculez l’aire néovasculaire de la rétine comme la somme de toutes les zones de néovasétal mesurées divisée par la surface totale de la rétine.

7. Quantification du diamètre du récipient

1. Dans la barre de menus, sélectionnez l’outil Ligne droite.
2. Zoomez sur l’image pour mieux visualiser la paroi du navire. Effectuez trois lignes transversales jusqu’au navire principal avant la première branche. Cela doit être fait en traçant une ligne de la limite d’un mur du navire à l’opposé.
   REMARQUE: La ligne doit être parfaitement perpendiculaire au récipient mural pour éviter les erreurs de quantification.
3. Appuyez sur la lettre T du clavier pour enregistrer la zone sélectionnée dans le Gestionnaire de retour sur investissement. Répétez les étapes 7.1 et 7.2 dans tous les récipients qui doivent être quantifiés.
4. Cliquez sur Mesurer dans le gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir les données de distance. Le programme affichera une nouvelle fenêtre avec les informations requises. Copiez les données dans un autre programme ou enregistrez le fichier.

8. Quantification de la tortuosité du navire

1. Dans la barre de menus, cliquez sur l’icône Outil en ligne droite avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Ligne segmentée ou Ligne à main levée. Tracez une ligne à l’intérieur du vaisseau à partir du nerf optique jusqu’à la ramification du premier vaisseau suivant la forme vasculaire.
   REMARQUE: La ligne doit suivre la forme vasculaire pour éviter les erreurs de quantification.
2. Appuyez sur la lettre T du clavier pour enregistrer la zone sélectionnée dans le Gestionnaire de retour sur investissement.
3. Dans la barre de menus, sélectionnez l’outil Ligne droite. Tracez une ligne à partir du nerf optique jusqu’à la première ramification du vaisseau.
4. Appuyez sur la lettre T du clavier pour enregistrer la zone sélectionnée dans le Gestionnaire de retour sur investissement.
5. Cliquez sur Mesurer dans le gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir les données de distances. Le programme affichera une nouvelle fenêtre avec les informations requises. Copiez les données dans un autre programme ou enregistrez le fichier.
6. Calculez l’indice de tortuosité comme suit : distance obtenue avec la ligne segmentée divisée par la distance obtenue avec la ligne droite.

9. Quantification de la ramification vasculaire

1. Avec l’outil ovale de la barre de menus, définissez une zone appliquée de manière égale à toutes les conditions expérimentales. La zone sélectionnée doit être un cercle concentrique dessiné autour du nerf optique.
2. Appuyez sur la lettre T du clavier pour enregistrer la zone sélectionnée dans le Gestionnaire de retour sur investissement.
   REMARQUE: Dans ce cas, il est recommandé d’enregistrer le retour sur investissement car la quantification est lente et le même retour sur investissement doit être utilisé dans toutes les images. Pour ce faire, dans le gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur PLUS > Enregistrer.
3. Comptez manuellement le nombre de branches primaires provenant des navires principaux à l’intérieur de la zone de sélection.
4. Répétez les étapes 9.2 et 9.3 dans les zones voisines, en maintenant les critères nerf optique-périphérie.

10. Quantification de la densité vasculaire

1. Transformez l’image en mode 8 bits.
2. Allez dans Plugins dans la barre de menus, sélectionnez Analyse des vaisseaux > densité vasculaire.
3. Définissez une zone avec l’outil Carré de la barre de menus, où la densité du récipient doit être mesurée. Cliquez sur OK.
4. Le programme affichera une nouvelle fenêtre avec les informations requises. Copiez les données dans un autre programme ou enregistrez le fichier.
5. Répétez les étapes 10.2, 10.3 et 10.4 dans les zones voisines, en maintenant le retour sur investissement mais en le plaçant neuf fois englobant la périphérie et le centre de toute la rétine.

Résultats

Comme décrit dans la section du protocole, à partir d’un seul test de coloration fluorescente, vous pouvez obtenir la morphologie vasculaire et évaluer quantitativement plusieurs paramètres d’intérêt. La recherche d’une altération spécifique dépendra du type de rétinopathie étudié. Dans cet article, les zones avasculaires et néovasculaires, la tortuosité et la dilatation ont été évaluées dans un modèle murin de rétinopathie proliférative, tandis que la ramification vasculaire et la densité ont...

Discussion

Les modèles animaux de rétinopathies sont des outils puissants pour étudier le développement vasculaire, le remodelage ou l’angiogenèse pathologique. Le succès de ces études sur le terrain repose sur la facilité d’accès au tissu qui permet d’effectuer une grande variété de techniques, fournissant des données provenant de souris in vivo et post-mortem26,27. De plus, une grande corrélation a été trouvée entre les études ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminuim foil
Bovine Serum Albumin	Merck	A4503	quality
Calcium chloride dihydrate	Merck	C3306
Hydrochloric acid	Biopack	9632.08
Confocal Microscope FV1200	Olympus	FV1200	with motorized plate
Covers	Paul Marienfeld GmnH & Co.	111520
Dissecting Microscope	NIKON	SMZ645
Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate	Merck	119753
200 µL  tube	Merck	Z316121
Filter paper	Merck	WHA5201090
Incubator shaker GyroMini	LabNet International	S0500
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate	Invitrogen	I21411
Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)	Merck	475904
Paraformaldehyde	Merck	158127
pHmeter	SANXIN	PHS-3D-03
Potassium chloride	Merck	P9541
Potassium-dihydrogen phosphate	Merck	1,04,873
Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Sodium chloride	Merck	S3014
Sodium hydroxide	Merck	S5881
Tris	Merck	GE17-1321-01
Triton X-100	Merck	X100-1GA
Vessel Analysis Fiji software	Mai Elfarnawany		https://imagej.net/Vessel_Analysis