非增殖性和增殖性视网膜病变小鼠整个视网膜血管参数的定量

摘要

本文介绍了一种成熟且可重复的凝集素染色测定，用于整个支架视网膜制剂，以及定量测量增殖性和非增殖性视网膜病变中经常改变的血管参数所需的方案。

摘要

视网膜病变是一组影响眼睛神经感觉组织的异质性疾病。它们的特征是神经变性，胶质病和血管功能和结构的进行性变化。虽然视网膜病变的发病以视觉感知的微妙障碍为特征，但血管丛中的修饰是临床医生检测到的第一个迹象。新生血管形成的缺失或存在决定了视网膜病变是被归类为非增殖性 （NPDR） 还是增殖性 （PDR）。从这个意义上说，一些动物模型试图模仿每个阶段的特定血管特征，以确定内皮改变，神经元死亡和视网膜中发生的其他事件所涉及的潜在机制。在本文中，我们将提供在产后一天测量成人和早产小鼠视网膜血管参数所需的程序的完整描述（P）17。我们将详细介绍在整个支架中使用Isolectin GSA-IB4进行视网膜血管染色的方案，以便以后进行显微镜观察。还提供了使用Image J Fiji软件进行图像处理的关键步骤，因此，读者将能够测量血管密度，直径和曲折度，血管分支以及缺血和新生血管区域。这些工具对于评估和量化非增殖性和增殖性视网膜病变中的血管改变非常有帮助。

引言

眼睛由两个动脉 - 静脉系统滋养:脉络膜脉管系统，一种灌溉视网膜色素上皮和光感受器的外部血管网络;以及灌溉神经节细胞层和视网膜内核层的神经视网膜脉管系统¹。视网膜脉管系统是一个有组织的血管网络，将营养物质和氧气输送到视网膜细胞并收集废物，以确保适当的视觉信号转导。这种脉管系统具有一些明显的特征，包括:缺乏自主神经支配，通过内在视网膜机制调节血管张力以及拥有复杂的视网膜 - 血液屏障²。因此，视网膜脉管系统一直是许多研究人员关注的焦点，他们不仅广泛研究了发育过程中的血管生成，还研究了这些血管在疾病中经历的改变和病理血管生成³。在视网膜病变中观察到的最常见的血管变化是血管扩张，新生血管形成，血管乔木化丧失和视网膜主血管变形，这使它们更加之字形^4，5，6。所描述的一种或多种改变是临床医生最早发现的体征。血管可视化提供了一种快速、无创且价格低廉的筛查方法⁷。对在血管树中观察到的改变的广泛研究将确定视网膜病变是非增殖性的还是增殖性的，并进一步治疗。非增殖性视网膜病变可表现为血管形态异常，血管密度降低，无细胞毛细血管，包细胞死亡，黄斑水肿等。此外，增殖性视网膜病变还会导致血管通透性增加、细胞外重塑以及向玻璃体腔形成血管簇，这些簇容易分解或诱导视网膜脱离⁸。

一旦检测到，可以通过其血管变化来监测视网膜病变^9，10。病理学的进展可以通过血管的结构变化来跟踪，这清楚地定义了疾病的阶段¹¹。这些模型中血管改变的量化允许将血管变化和神经元死亡相关联，并测试疾病不同阶段患者的药物治疗。

鉴于上述陈述，我们认为血管改变的识别和定量是视网膜病变研究的基础。在这项工作中，我们将展示如何测量不同的血管参数。为此，我们将采用两种动物模型。其中之一是氧气诱导的视网膜病变小鼠模型¹²，它模仿早产儿视网膜病变和增殖性糖尿病视网膜病变的某些方面^13，14。在这个模型中，我们将测量缺血区，新生血管区域以及主血管的扩张和弯曲。在我们的实验室中，已经开发了代谢综合征（MetS）小鼠模型，该模型可诱导非增殖性视网膜病变¹⁵。在这里，我们将评估血管密度和分支。

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研究方案

C57BL / 6J小鼠根据ARVO声明在眼科和视力研究中使用动物的指南进行处理。实验程序由科尔多瓦国立大学化学科学学院的机构动物护理和使用委员会（CICUAL）设计和批准（Res. HCD 1216/18）。

1. 缓冲液和试剂的制备

1. 制备1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）:将8克氯化钠（NaCl），0.2克氯化钾（KCl），14.4克磷酸氢二钠二水合物（_{Na2HPO4 2H2O}）和0.24克磷酸钾（_KH2PO4）加入800毫升蒸馏水中。搅拌溶液，直到盐完全溶解。用氯化物酸（HCl）将pH值调节至7.4，并用额外的蒸馏水将体积调节至1L。过滤溶液并将其储存在4°C。
2. 制备4%多聚甲醛（PFA）:将40克固体PFA加入800毫升新鲜制备的PBS中。在恒温60°C的加热板中搅拌溶液。 加入1M氢氧化钠（NaOH），直到PFA完全溶解，检查pH值是否保持在7.2-7.4的范围内。用 PBS 将容量充至 1，000 mL 并混合。关闭加热板，当溶液温度低于35°C时过滤溶液。 将溶液在4°C下储存长达3天。
   注意:吞咽或吸入PFA是有害的，可能是一种致突变化合物。在整个过程中使用手套和口罩，并在安全舱内工作。
3. 制备1x Tris缓冲盐水（TBS）:将6.1gTris和9gNaCl加入800mL蒸馏水中。搅拌溶液，直到盐完全溶解。用HCl调节pH至7.4，并用额外的蒸馏水将体积调节至1升。过滤溶液并将其储存在4°C。
4. TBS-0.1%Triton X-100的制备:加入0.1毫升TritonX-100至100毫升TBS。轻轻混合并将其储存在4°C下长达1周。
   注意:由于Triton是一种非常致密的洗涤剂，因此请稍微切开吸头的末端，以便更好地移液。
5. TBS-5%-牛血清白蛋白（BSA）-0.1%Triton-X-100的制备:称取5gBSA，加入TBS-0.1%triton X-100溶液至最终体积为100 mL。轻轻搅拌。等分试样并在-20°C下储存长达2个月。
6. 异凝集素GSA-IB4 Alexa fluor-488偶联物（Isolectin GSA-IB4）:重量为36.75mg氯化钙二水合物（_CaCl2·_2H2 O），并将其添加到500 mL新鲜制备的PBS中。用搅拌棒搅拌溶液。移取500μLCaCl2 / PBS溶液，并将其加入含有500μg冻干异凝素GSA-IB4粉末的小瓶中。轻轻混合并将溶液等分到0.5mL管中。将它们储存在-20°C，避光。
7. 甘油/Tris中的聚乙烯醇:称取2.4克聚乙烯醇，加入6克甘油，轻轻搅拌。然后，加入6毫升水，并在室温下继续搅拌数小时。加入12mL预热的0.2M Tris溶液（pH:8.5），并在50°C的恒温下加热10分钟，偶尔混合。最后，将溶液以5，000× g 离心15分钟进行澄清。
   注意:让溶液在室温下冷却，等分并储存在-20°C。

2. 荧光凝集素染色

1. 在小鼠通过吸入二氧化碳（_CO2）处死后，用剪刀修饰眼睛¹⁶。用新鲜制备的4%PFA在室温（RT）下固定去核的眼睛1小时。
   注意:固定也可以通过在4°C下将眼睛在4%PFA中孵育过夜（ON）来进行。 根据ARVO关于在眼科和视力研究中使用动物的声明以及科尔多瓦国立大学化学科学学院机构动物护理和使用委员会（CICUAL）的指南（Res. HCD 1216/18），处死小鼠。
2. 在解剖显微镜下，用剪刀沿着边缘切除角膜，并解剖整个视网膜。丢弃眼睛的前段，然后将视网膜与RPE-脉络膜分开。
   注意:确保用镊子将剩余的碎屑和舌骨血管从视网膜中取出。
3. 将视网膜置于200μL管中。然后，在100μL含有5%牛血清白蛋白（BSA）和0.1%Triton-X-100的Tris缓冲盐水（TBS）溶液中阻断和透化视网膜，在4°C下6小时内在摇摇杯中轻轻搅拌。
   注意:此步骤可以在室温下执行2小时。
4. 然后，倒置管子将视网膜置于盖子中，并用移液管取出阻塞溶液。
5. 加入100μL含有0.01μg/ μL异凝集素GSA-IB4（GSA-IB4）的溶液。用铝箔包裹管子，以保护样品免受光照。用凝集素溶液ON在4°C或在室温下孵育视网膜2小时，并在摇摇杯中轻轻搅拌。
6. 用100μL含有0.1%Triton-X-100的TBS洗涤视网膜20分钟，在摇摇杯中轻轻搅拌。为了正确清洗，将视网膜倒置在管帽中。将管子放回其站立位置，并取出容器中剩余的介质。重复此步骤三次。
7. 将视网膜放入载玻片中，然后添加一滴PBS。在解剖显微镜下，从视网膜边缘向视神经进行四次等距离的切口。
8. 要展开视网膜的花瓣，请使用镊子或小块滤纸。确保感光器侧朝下。
9. 用滤纸取出幻灯片的剩余 PBS。然后，加入安装介质（甘油/Tris中的聚乙烯醇）和盖玻片。在室温下晾干1小时。
10. 将载玻片存放在4°C，避光。
    注意:视网膜也可以储存在4°C的PBS中，直到共聚焦显微镜可视化。

3. 共聚焦显微镜可视化和显微照片采集

1. 在可视化之前，将载玻片在光照覆盖的RT下孵育10分钟。
2. 在共聚焦显微镜下，将载玻片面朝下放在板中。
3. 聚焦视网膜脉管系统的上神经丛，然后选择一个区域开始图像采集。
4. 在软件中设置一般激光参数:波长:488nm;激光强度;高压;偏移;获得。
   注:激光强度、PMT、偏移和增益可能因条件和灯泡的使用情况而异。最佳设置提供了血管的清晰图像，避免了光电倍增管灵敏度的饱和，从而与荧光信号呈线性关系。
5. 设置其他采集参数:模式;尺寸;客观，无缩放;没有卡尔曼;步长。
   注:必须使用相同的采集条件对照和实验样品进行成像。
6. 以 x 轴和 y 轴设置坐标:扫描聚焦 2 倍的视网膜。如果该区域显示船只，请通过单击该区域的两倍来选择它，以便将其标记为以后的图像采集。
   注意:强烈建议通过跟随上血管丛来选择视网膜区域，因为较大血管的荧光更高。
7. 在网格中移动到相邻正方形，聚焦视网膜，然后选择相对应的区域。重复此步骤，直到所选区域包含整个视网膜。
8. 选择一个区域并设置 z 轴坐标以定义要扫描的厚度范围。为此，将视网膜对焦2倍;使用千分尺，转到视网膜的顶部，然后单击"开始"位置的" 设置 "。然后，移动到视网膜的底部，然后单击" 设置 "在"结束"位置。
9. 在网格中选择的每个区域重复步骤 3.8。
   注:要验证扫描区域的深度，请按"开始"位置的" 转到 "。如果船只仍然可视化，请通过移动千分尺重新调整位置，然后单击" 设置"。在"结束"位置重复该过程。
10. 初始化自动扫描。
11. 扫描过程完成后，打开图像。
12. 选择 系列 格式以将图像录制为马赛克，并使用首选扩展名保存。最后，拼接的图像将显示在屏幕上。

4. 图像处理

1. 在ImageJ FIJI软件中，转到 菜单栏 ，然后单击 "文件>打开"。选择要处理的图像。在 "生物格式导入选项" 窗口中，选择" 显示 OME-XML 元数据 "，然后单击" 确定"。
   注意:具有相似名称的图像应保存在单独的文件夹中。
2. 在 "OME 元数据" 窗口中，搜索名为 PhysicalSizeX、PhysicalSizeY 和 PhysicalSizeZ 的像素大小信息。复制此数据。
3. 对于图像校准，请转到 菜单栏 ，然后选择 图像>属性。复制步骤 4.2 中的图像信息，然后单击 "确定"。图像将作为包含多张照片的窗口打开，其中每张照片都表示在 z 轴上拍摄的缩微照片。
4. 为图像指定首选的色谱，以便将颜色委托给荧光标签。为此，请转到 菜单栏 ，然后单击 LUT 图标。
5. 要在单个图像中可视化所有堆栈，请转到 菜单栏 ，然后选择 "图像>堆栈> Z Project"。
6. 在显示的 Z 投影 窗口中，选择可视化船只的所有堆栈。在投影类型中，选择 平均强度 ，然后单击 确定。
   注意:堆栈总和的结果将显示在名为 AVG（映像名称）的新映像中。
7. 调整生成的图像中的亮度和对比度，以减少背景并突出显示容器。转到 菜单栏 ，然后单击 图像>调整>亮度/对比度。在 B 和 C 窗口中，移动条形，直到观察到更好的强度。单击 应用 并保存更改。
8. 复制为 亮度/对比度选择的参数;对于所有图像，这些图像必须相同。
9. 在图像量化之前，定义要测量的参数。在 菜单栏中，转到 分析>设置测量值。在此处描述的过程中，有必要获取面积和周长（最终也需要测量距离）。单击 "确定"。
10. 下载容器密度量化所需的插件¹⁷，并按照插件提供的安装说明进行操作。
11. 继续定量特定的血管参数。

5. 缺血区的定量

1. 在 菜单栏中，选择 "魔杖工具"。选择没有血管的视网膜区域。
   注意:根据公差，可以选择更大或更小的区域。要调整公差，请单击魔杖工具图标两次。采用的模式:旧版。
2. 按键盘上的 T 字母以在 ROI 管理器中记录所选区域。对视网膜的所有缺血区域重复步骤5.1和5.2。
3. 单击 ROI 管理器中的 "测量 "以获取缺血区域信息。程序将显示一个新窗口，其中包含所需的信息。在另一个程序中复制数据或保存文件。
   注意:在某些图像中，人们可能更喜欢手动选择缺血区域。在这种情况下，请选择"多边形选择"工具，在缺血区域周围绘制短距离，然后在新距离即将开始时单击图像。通过单击第一个点关闭所选区域。
4. 重复步骤5.1，5.2和5.3以测量视网膜的总面积。
5. 计算视网膜的缺血面积，即测量的所有缺血区的总和除以视网膜的总面积。

6. 新生血管区域的定量

1. 在菜单栏中，选择 "魔杖"工具。
2. 放大图像以更好地可视化新血管。使用魔杖工具逐个选择新卫星。
   注:调整公差不高于20，以确保选择单个新血管。在所有图像量化过程中，该公差水平必须保持不变。
3. 按键盘上的 T 字母以在 ROI 管理器中记录所选区域。对视网膜的所有新生血管区域重复步骤6.1和6.2。
4. 单击 ROI 管理器中的 测量 以获取面积数据。程序将显示一个新窗口，其中包含所需的信息。在另一个程序中复制数据或保存文件。
5. 重复步骤6.1，6.2和6.3以量化视网膜的总面积。
6. 计算视网膜的新生血管面积，即测量的所有新血管区域的总和除以视网膜的总面积。

7. 容器直径的定量

1. 在 菜单栏中，选择直线 工具。
2. 放大图像以更好地可视化容器壁。在第一个分支之前对主容器执行三条横向线。这必须通过从容器的一面墙的边界到相反的边界画一条线来完成。
   注意:该线必须完全垂直于壁容器，以避免量化误差。
3. 按键盘上的 T 字母以在 ROI 管理器中记录所选区域。对所有需要量化的容器重复步骤 7.1 和 7.2。
4. 单击 ROI 管理器中的 测量 以获取距离数据。程序将显示一个新窗口，其中包含所需的信息。在另一个程序中复制数据或保存文件。

8. 船舶曲折度的量化

1. 在 菜单栏中，用鼠标右键单击直线 工具 图标，然后选择 "分割线 "或" 手绘线"。从视神经在血管内画一条线，直到血管形状之后的第一个血管分支。
   注意:该线必须遵循血管形状，以避免定量误差。
2. 按键盘上的 T 字母以在 ROI 管理器中记录所选区域。
3. 在 菜单栏中，选择直线 工具。从视神经开始画一条线，直到第一个血管分支。
4. 按键盘上的 T 字母以在 ROI 管理器中记录所选区域。
5. 单击 ROI 管理器中的 测量 以获取距离数据。程序将显示一个新窗口，其中包含所需的信息。在另一个程序中复制数据或保存文件。
6. 曲率指数计算如下:用分段线得到的距离除以用直线得到的距离。

9. 血管分支的定量

1. 使用菜单栏的椭圆工具，定义一个同样适用于所有实验条件的区域。所选区域必须是围绕视神经绘制的同心圆。
2. 按键盘上的 T 字母以在 ROI 管理器中记录所选区域。
   注意:在这种情况下，建议保存ROI，因为量化速度很慢，并且必须在所有图像中使用相同的ROI。为此，请在 ROI 管理器中单击"更多" >保存"。
3. 手动计算选择区域内主船产生的主要分支数量。
4. 在邻近区域重复步骤 9.2 和 9.3，维持视神经-周边标准。

10. 血管密度的定量

1. 将图像转换为 8 位模式。
2. 转到菜单栏中的插件，选择血管分析>血管密度。
3. 使用菜单栏的"正方形"工具定义一个区域，其中需要测量容器密度。单击"确定"。
4. 程序将显示一个新窗口，其中包含所需的信息。在另一个程序中复制数据或保存文件。
5. 在邻近区域重复步骤 10.2、10.3 和 10.4，保持 ROI，但将其放置九次，包括整个视网膜的外围和中心。

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结果

如方案部分所述，从单个荧光染色测定中，您可以获得血管形态并定量评估感兴趣的几个参数。特定改变的搜索将取决于所研究的视网膜病变的类型。本文在增殖性视网膜病变小鼠模型中评估了缺血和新生血管区域、曲折性和扩张，而在MetS小鼠模型中分析了血管分支和密度，该模型诱导了非增殖性视网膜病变。

在第一个实验示例中，采用了氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型?...

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讨论

视网膜病变的动物模型是研究血管发育、重塑或病理性血管生成的有力工具。这些研究在该领域的成功依赖于易于访问的组织，从而可以执行各种技术，从而提供来自 体内 和 死后 小鼠^{的数据26，27}。此外， 在体内 研究和临床分析之间发现了很大的相关性，为这些模型提供了可靠的可追溯性和可靠性²⁸。在本文中?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminuim foil
Bovine Serum Albumin	Merck	A4503	quality
Calcium chloride dihydrate	Merck	C3306
Hydrochloric acid	Biopack	9632.08
Confocal Microscope FV1200	Olympus	FV1200	with motorized plate
Covers	Paul Marienfeld GmnH & Co.	111520
Dissecting Microscope	NIKON	SMZ645
Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate	Merck	119753
200 µL  tube	Merck	Z316121
Filter paper	Merck	WHA5201090
Incubator shaker GyroMini	LabNet International	S0500
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate	Invitrogen	I21411
Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)	Merck	475904
Paraformaldehyde	Merck	158127
pHmeter	SANXIN	PHS-3D-03
Potassium chloride	Merck	P9541
Potassium-dihydrogen phosphate	Merck	1,04,873
Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Sodium chloride	Merck	S3014
Sodium hydroxide	Merck	S5881
Tris	Merck	GE17-1321-01
Triton X-100	Merck	X100-1GA
Vessel Analysis Fiji software	Mai Elfarnawany		https://imagej.net/Vessel_Analysis